专利名称：一种苹果酸转运子基因GmALMT1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及苹果酸转运子基因GmALMTl及其应用。
背景技术：
酸性土壤在世界上广泛分布，全世界酸性土壤总面积占世界耕地面积的30-40%，而且有50%以上的潜在耕地为酸性土壤，主要分布在热带、亚热带及温带地区(Kochian etal.，2004)。酸性土壤对农作物生长抑制的作用不仅表现在H+浓度过高危害作物本身，而且常常表现为有效磷的缺乏和铝毒害对植物生长和产量的协同抑制。在长期自然和人工选择的进化过程中，植物形成了一系列形态、生理和分子的协同适应性机制，克服酸性土壤中存在的低PH值、有效磷缺乏和铝毒害等障碍因子。据报道，植物适应铝毒害的机制，主要包括内部忍耐和外排机制(例如，苹果酸的分泌)；适应低磷胁迫的机制，主要包括根形态构型的改变、有机酸的分泌、酸性磷酸酶的诱导和分泌、高 亲合力磷转运子的诱导等(Raghothama, 1999; Vance et al.，2003)。由于有效磷的缺乏和铝毒害同时并存在于酸性土壤中，暗示了植物可能存在共同的适应机制，克服有效磷的缺乏和铝毒害。值得一提的是，在油菜、菜豆、大豆、白羽扇豆等植物的研究中发现，低磷胁迫显著加强根系苹果酸的分泌，而且促进其对外源难溶性磷的活化和利用(Hoffland etal.，1989; Hinsingerj 2001; Shen et al.，2002; Liao et al.，2006; Sas et al.，20010);在铝胁迫下，拟南芥、小麦、小黑麦和大豆的苹果酸的分泌量显著增加，从而缓解铝对根系生长的抑制(Delhaize et al. , 1993; Pellet et al. , 1996; Ritchey et al.,1998; Ma, 2000)。这些结果揭示调控苹果酸的分泌可能是说明植物适应酸性土壤中有效磷的缺乏和铝毒害的节点。自从Sasaki等2004年从小麦中克隆到第一个编码分泌根系苹果酸的转运子基因ALMTl以来，在拟南芥、葡萄、油菜和大麦上已经克隆到了相似的苹果酸转运子。进一步研究表明，这些有机酸转运子的表达控制植物分泌苹果酸的过程(Ramanet al. , 2005; Hoekenga et al. , 2006; Ligaba et al. , 2006; Furukawa et al.,2007)。大豆是重要的经济作物，在我国农业生产中具有非常重要的地位，它是一种传统的粮、油、饲兼用的豆科作物。前期研究发现，适应南方酸性土壤的大豆基因型具有较高的磷效率和耐铝毒害能力，但是控制其过程的关键基因尚未报道。针对上述研究背景，申请人通过同源克隆的方法，克隆了一个受外源pH、磷和铝协同调控的、根尖特异表达的苹果酸转运子，GmAlMTl。通过整株、毛根和蛙卵等表达体系，证明GmAlMTl基因编码的蛋白具有控制苹果酸分泌的功能，最终提高转基因植株提高耐铝毒的能力。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种苹果酸转运子基因GmALMTl。本发明的另一个目的是提供上述基因编码的蛋白质。
本发明的进一步目的是提供上述基因及其编码的蛋白质的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明所提供的苹果酸转运子基因—Z#77，可以来源于大豆，其包含或具有选自如下的核苷酸序列
(1)SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列；
(2)与(I)的核苷酸序列的互补序列在低等严格条件、中等严格条件、优选高严格条件下杂交的核苷酸序列；
(3)与(I)的核苷酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；
(4)与(I)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序
列；
(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列SEQID N0:2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；
(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；
(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。SEQ ID NO: I由1461个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为第1-1461位碱基，编码具有序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列组成的蛋白质在本发明中称为GmALMTl 蛋白。本发明提供的苹果酸转运子基因—编码的蛋白质，其包含或具有选自如下的氨基酸序列
(1)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；
(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；
(3)与SEQID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的
氨基酸序列；
(4)(I)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；
(5)本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。本发明提供的基因―和蛋白质能够调控包含它的转基因生物体内苹果酸的转运。扩增上述―Z#777基因全长或其任一片段的引物对属于本发明的保护范围。本发明还提供含有上述GmALMTl基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有GmALMTl基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pYLRNAi(由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献胡旭霞和刘耀光，2006，分子植物育种)或其它衍生植物表达载体。本发明还提供一种基因工程菌，其含有上述的表达载体。
本发明还涉及细胞，其包含本发明的基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。还涉及来自所述植物的转基因种子。本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交。本发明还涉及本发明的方法生产的植物。
本发明还涉及本发明的基因或重组载体在调控植物苹果酸的分泌中的用途，包括制备转基因植物以及制备促进植物适应酸性土壤的制剂。本发明还涉及调控植物适应酸性土壤的方法，该方法包括制备含有本发明的 基因或重组载体的植物，例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因
植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。本发明所提供的一个优选实施方案是将上述基因GmALMTl导入大豆中，得到转基因复合植物；所述转基因复合植物的根部耐铝能力等高于所述目的对照植物。所述基因GmALMTl可以例如是通过所述重组表达载体导入受体植物的。携带有本发明的基因GmALMTl的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的下胚轴转化法转化到大豆细胞或组织中。本发明的优点和效果
I.基因所属的苹果酸转运蛋白家族在拟南芥，小麦和油菜中虽已被克隆及报道，但其在豆科作物苹果酸分泌方面的生物学功能并不清楚。本发明克隆的基因GmALMTl对大豆苹果酸分泌有显著的影响，这对阐明苹果酸转运蛋白基因在豆科作物适应酸性土壤的生物学功能有着重要意义。2.基因GmALMTl不仅影响了根尖苹果酸的转运，超量表达该基因还增加了大豆和拟南芥对铝毒的忍耐能力；该基因的功能研究对于解析豆科作物适应酸性土壤的分子机理有着深远的研究意义。
图I :田间试验中大豆总根长和干重。图2 :水培试验中低pH值、铝和磷有效性对大豆根相对根生长的影响。图3 :水培试验中低pH值、铝和磷有效性对大豆根系苹果酸含量和苹果酸分泌量的影响。图4 -.GmALMTl的亚细胞定位。图5 :招和pH值对GmALMTl在根系表达特异性的调控。图6 :铝、pH值和磷有效性对GmALMTl基因表达的影响。图7 GmALMTl转运蛋白的电生理活性。图8 :干涉和过表达对转基因大豆毛状根苹果酸的分泌以及耐铝性的影响。
图9 :mt达GmALMTl基因对转基因拟南芥苹果酸的分泌以及耐铝性的影响。
具体实施方式
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例I GmALMTl基因的克隆I、基因{GmALMTl、的克隆根据已报道的小麦 TaALMTl-I (AB081803)和 TaALMTl-2 (AB081804)，拟南芥 AtALMTl (Atlg08430)和油菜 BnAlMTl (AB194300) ΒηΑ1ΜΤ2 (AB194301)基因的氨基酸序列进行同源性比较，在高度保守区域设计上游简并引物5’-TGGGCIRTIHTIACIGTIGT-3’ (SEQ ID NO:3)和下游简并引物 5’ - CCIGCCCAIAYIGGRMA -3，(SEQ ID N0:4)，并以按照 TRIzol 一步法提取磷高效基因型HN98大豆根尖总RNA，然后反转录得到的cDNA作为模板进行PCR 扩增，PCR反应体系为50 PL，包含10 μΜ正反向引物各I PL，10XPCR buffer 5 μ , 2. 5 mM dNTP 4 μ , Taq 酶 O. 5 μ , cDNA 模板量 2. 5 μ ，然后用灭菌 ddH20 补足 50 μ 。PCR 反应程序为94 V I分钟；94 V 30秒，52 V 30秒，72 V 2分钟，扩增30个循环；72 V 延伸10分钟。扩增的PCR产物通过1%琼脂糖胶电泳，通过Golden view核酸染料染色后， 在凝胶成像系统成像。DNA凝胶回收试剂盒回收长度为405bp的PCR产物。回收得到PCR 产物克隆到pMD18_T (TAKARA公司，具体描述见http://www. takara. com. cn/)载体上进行测序鉴定。根据测序的结果，运用Primer 5. O引物设计软件，设计以下RACE PCR引物 3，特异引物 5，-GCCTCTTTATGATGGCTTCGGAGTTG-3，(SEQ ID NO:5)3’ 巢式引物 5’ -AATGTGGGCTGTTCTGACAGTGGTG-3’ (SEQ ID NO:6)5’ 特异引物 5’ -CAAGTACTGCTCCCAAGGATGGCGA -3’ (SEQ ID NO:7)5’ 巢式引物 5’ -GACGGGACAAATGAAAGTGGAGATGACC-3’ (SEQ ID NO:8)。
按照CLONTECH’ s Advantage TM 2 PCR Kit 操作说明进行。取 5μ PCR 产物进行电泳检测，二轮的PCR反应获得特异的产物，具体操作参照CLONTECH’s AdvantageT M 2 PCR Kit操作说明进行。然后用DNA凝胶回收试剂盒回收参照对3’ /5’ -RACE PCR的产物回收。回收得到PCR产物克隆到pMD18_T (TAKARA公司，具体描述见http://www. takara. com. cn/)载体上进行测序鉴定。将以上获得基因的3’和5’端的序列和前面得到的GmALMTl的部分cDNA序列拼接得到大豆GmALMTl全长cDNA序列。
2、载体的构建过量表达载体的构建以大豆根尖cDNA为模板，用上游特异引物5’-GGAAGATCTCATGGA TATAGAGTCAACAACCCAAGC-3’ (SEQ ID NO:9)和下游特异引物5’-CAGCACGCGTCTATTTACAAATTGAATGTTCCGAGGG-3’ (SEQ ID NO: 10)矿增 GmALMTl ORF 1461 bp片段，PCR片段回收测序无误后，通过II和#7 I对片段及目的载体进行双酶切后，将GmALMTl基因连接到目的载体pYLRNAi。
干涉载体的构建以大豆根尖cDNA为模板，用上游特异引物5’ -GGATCCTGGTCGCTGTCTCG-3’ (SEQ ID NO: 11)和下游特异引物5’-AAGCTTACATTCCCGAGTAAGTGCT-3’ (SEQ ID NO: 12)扩增 392 bp 目的片段，用及丽Y I 取Hind III分别酶切PCR产物和目的载体pYLRNAi，回收产物纯化后连接载体，转化大肠杆菌ToplOF’(由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献Wang et al.，2006, The Plant Cell)，测序无误后，用上游特异引物 5’- CTGCAGACATTCCCGAGTAAGTGCT-3’ (SEQ ID NO: 13)和下游特异引物5’-ACGCGTTGGTCGCTGTCTCG -3，(SEQ ID NO: 14)扩增反向片段，用 Pst I和#7 I双酶切反向片段和带有正向片段的载体后，将反向片段连接到包含有正向片段的目的载体pYLRNAi中，转化大肠杆菌ToplOF’，测序无误后转化发根农杆菌K599 (由澳大利亚昆士兰大学豆科综合研究中心惠赠，保存于华南农业大学根系生物学研究中心实验室，具体描述见文献Kereszt A, et al. , 2007),用于农杆菌介导的大豆下胚轴注射法进行毛根转化。
亚细胞定位分析表达载体的构建按照常规方法，提取大豆根部RNA，并将其反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用上游特异引物5’ - TCTAGAGATGGATATAGAGTCAACAACC -3’ (SEQ ID NO:15)和下游特异引物 5’ - GGTACCAGACAAATTGAATGTTCCGAG -3’ (SEQ ID NO:16)扩增GmALMTl开放阅读框片段，PCR片段回收测序无误后，将GmALMTl基因连接到目的载体EGFP。
电生理表达载体的构建按照常规方法，提取大豆根部RNA，并将其反转录成 cDNA， 以该cDNA为模板，用上游特异引物5， -CTTGCAGATCTGCCGCCACCATGGATATAGAGTCA-3’ (SEQ ID NO:17)和下游特异引物 5’-GCAAGACTAGTCTATTTACAAATTGA-3’ (SEQ ID NO: 18)扩增GmALMTl开放阅读框片段，PCR片段回收测序无误后，通过ife·/ II和分el对回收片段及目的载体进行双酶切后，将GmALMTl基因连接到目的载体T7TS。
3、GmALMTl的亚细胞定位及其基因的表达模式分析 DGmALMTl的亚细胞定位分析通过基因枪转化法，将装载了 GmALMTl的EGFP载体和EGFP空载体导入洋葱表皮细胞和大豆原生质体进行瞬时表达。然后用共聚焦显微镜(TCS SP2; Leica)和荧光显微镜 (LEI CA DM5000B, Germany)分别观察洋葱表皮细胞和大豆原生质体的GFP和PI荧光信号。 结果见图4为GmALMTl的亚细胞定位分析。其中A-C为洋葱表皮对照35S启动子驱动的空载，A为GFP荧光信号；B为PI信号；C为A和B的融合结果；D_F为GmALMTl-GFP在洋葱表皮的亚细胞定位，D为GmALMTl-GFP荧光信号；E为PI信号；F为D和E的融合结果。G 为大豆原生质体对照35S启动子驱动的空载；H-I为GmALMTl-GFP在大豆原生质体的亚细胞定位，H为GmALMTl-GFP荧光信号；I为H和明场的融合结果。图中除A-F标尺为100 ym;G_I 标尺为 20 μ m。
2 ) GmALMTl基因的表达模式分析基因表达的组织特异性分析大豆种子在正常营养液发芽3天后，将生长一致的幼苗转移到含50 μΜ AlCl3的O.5 mM CaCl2溶液(pH值为4. 3)中处理6小时，分别提取0-2 cm, 2-4 cm, 4-7 cm根段的 RNA。
铝浓度对GmALMTl基因表达的影响大豆种子在正常营养液发芽3天后,将生长一致的幼苗转移到含0、50、100 μΜ AlCl3的O. 5 mM CaCl2溶液(pH值为4. 3)中处理6小时，提取0_2 cm根段的RNA。
低pH值和铝对GmALMTl基因表达的影响大豆种子在正常营养液发芽3天后，将均一的幼苗转移到O. 5 mM CaCl2溶液(pH 值为4. 3)中处理0，6，12小时，然后转移到含50 μΜ AlCl3的O. 5 mM CaCl2溶液(pH值为 4. 3 )中处理2，4，6，8，10，12和24小时。每个时间点分别采集0_2 cm的根段，抽提RNA。
铝、pH值和磷对GmALMTl基因表达的影响大豆种子分别在正常营养液和缺磷营养液中发芽3天后,将均一的幼苗转移到不同的处理，即+Α1/+Ρ/ρΗ4· 3，+Α1/-Ρ/ρΗ4· 3，_Α1/+Ρ/ρΗ4· 3，_Α1/+Ρ/ρΗ5· 8，-Α1/-Ρ/ ρΗ4· 3和-Α1/-Ρ/ρΗ5· 8。其中pH分别为4. 3和pH 5. 8 ;磷处理分别为320 μΜ (+Ρ)和OμΜ (-P);铝处理分别为 38 μΜ Al3+ (+Al)和 O μΜ Al3+ (-Al)。用 GE0CHEM-EZ 计算铝的活性。处 理6小时后采集0-2 cm的根段，抽提RNA。
将上述RNA反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmALMTl的表达模式。大豆的看家基因TefSl作为内参。用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为XM^TefSl基因的引物为TefSl F: 5’ - TGCAAAGGAGGCTGCTAACT -3’ (SEQ ID NO:19)TefSl R: 5’ - CAGCATCACCGTTCTTCAAA -3’ (SEQ ID NO:20)GmALMTl基因的引物为GmALMTm-. 5’ -GAGCACTTACTCGGGAATGTG-3’ (SEQ ID NO:21)GmALMTl R: 5’ -GGACTTTGGCAGTTGATGGG-3’ (SEQ ID NO:22)图5为低pH值和铝对GmALMTl表达模式的影响。其中A 'GmALMTl基因在根部的不同区段的表达量；B :铝浓度对基因表达的影响；C :低pH值和铝对基因表达的影响。图中数据为4个重复的平均值和标准误差。
图6为pH值、铝和磷的有效性对GmALMTl表达模式的影响。其中A为高磷的条件下，pH值对基因在根尖表达的影响；B为低磷的条件下，pH值对基因在根尖表达的影响；C为磷铝互作对GmALMTl基因在根尖表达的影响。图中数据为4个重复的平均值和标准误差。星号表示同一指标在两个基因型之间的显著性比较*表示显著水平产 〈O. 05时，差异显著；**表示显著水平O. 001〈 P〈O. 01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P〈O. 001时，差异极显著；ns表示差异不显著。
4、GmALMTl功能的电生理研究将构建好的GmALMTl-TST7载体反转录成cRNA。挑选良好的蛙卵细胞，注射约30 ng GmALMTl-TST7，对照试验注射30 nL水。同时向蛙卵注射50 nL浓度为O到100 mM的苹果酸钠，使内源苹果酸活性分别为1.3，2. 4和4. 5 ({mal2_}i)。缓冲液pH值调整为7. 5或4.5，用双电极电压钳检测。利用pCLAMP 10.0 (美国Axon公司)和Digidatas 1320A软件进行图像处理及数据分析。图7为GmALMTl功能的电生理研究。A，苹果酸活性对GmALMTl 通道电流的影响；B，pH值对GmALMTl通道电流的影响；C，pH值为7. 5时，苹果酸活性对 GmALMTl的I-V曲线的影响；D，pH值为4. 5时，苹果酸活性对GmALMTl的I-V曲线的影响。
实施例2转基因复合植株的研究I、转基因材料的获得 I)转基因大豆复合植株的获得将构建好的表达载体和干涉载体转化至发根农杆菌K599中，采用农杆菌介导的大豆下胚轴注射法获得转基因复合植株(根部为转基因毛状根、地上部为非转基因)，后续的表型鉴定均使用此株系。空载体对照按照上述方法，将表达载体pYLRNAi同样方法转化大豆，获得转pYLRNAi空载对照株系(CK)。
2)转基因拟南芥植株的获得将构建好的表达载体质粒转化至根癌农杆菌Gv3101中，采用农杆菌介导的拟南芥花序转染法获得转基因拟南芥植株。空载体对照按照上述方法，将表达载体PYLRNAi同样方法转化拟南芥，获得转pYLRNAi空载对照株系(CK)。
2、转基因材料的检测1)转基因大豆复合植株的检测毛状根形成后21天，采根部样品提取RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测过表达及干涉的效果。
2)转基因拟南芥植株的检测采集Tl代拟南芥种子经潮霉素抗性筛选后，获得Tl代转基因植株；采集T2代种子用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为60%的T2代植株；采集T3代种子，用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为100%转基因系。提取该转基因系植株的RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量 PCR检测过表达的效果。
大豆看家基因TefSl和拟南芥的tubulin作为参照基因，相对表达量为目的基因的表达量与看家基因表达量的比值。大豆看家基因Tfe/分的检测引物为SEQ IDNO: 19 和 SEQ ID NO:20 'GmALMTl 的检测引物为 SEQ ID N0:21 和 SEQ ID N0:22。
I)拟南芥tubulin基因的引物为tubulin F: 5’ - TGTCGTCCAACCTTACAACTCACT -3’ (SEQ ID NO:23) tubulin R: 5’ - TCTCCAGGGTCCTCCATTCC -3， (SEQ ID NO:24)2)反应体系2 X SYBR Green PCR master mix 10 μ L 上游引物· (10 mol/L) 0. 6 μ L 下游引物· (10 mol/L) O. 6 μ L Mili-Q 水 补至 20 μ L 稀释的cDNA: 2 yL 3)反应条件95°C预变性I min，然后按95°C变性15 S，55-60。。退火15s，进行35-40个循环，最后 72°C延伸30 S。定量PCR确认得到有效的不同转基因株系。
3、转基因复合植株表型分析I)毛状根根系苹果酸分泌量的测定将阳性转基因大豆复合株系以及对照株系转移到4. 3 mM CaCl2溶液(pH值为4. 3)中培养6小时后，收集根系分泌物。将20 mL分泌物用阳离子交换树脂处理后，用冷冻干燥法浓缩为lmL。经O. 45mm滤膜过滤后用HPLC仪器测定样品中的苹果酸含量。
2)苏木精染色检测转基因毛状根的耐铝性将阳性转基因大豆复合株系以及对照株系经6小时铝处理后，剪下其根尖部位，用苏木精染液染色约半小时。取出根尖，用清水冲洗表面附着的苏木精染料，在体式显微镜下观察染色情况。
图8为基因对大豆复合植株苹果酸分泌量及其耐铝性的影响。其中A: GmALMTl基因在转基因大豆毛状根的表达量分析；B -.GmALMTl过量和干涉株系以及对照毛状根的苹果酸分泌量；C -.GmALMTl过量和干涉株系以及对照毛状根表面铝的积累。CK，转化空载的对照株系；0X，GmALMTl的超表达株系；RNAi，GmALMTl的干涉株系。星号表示同一指标在过量和干涉株系与对照株系之间的显著性比较*表示显著水平P〈O. 05时，差异显著；**表示显著水平O. 001 < P〈O. 01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P〈O. 001时，差异极显著；ns表示差异不显著。
4、转基因拟南芥耐铝性分析I)根部有机酸的分泌转基因和野生型拟南芥在MS培养基萌发一星期后，将大小一致的幼苗转移到液体MS 培养基中继续培养10天。将液体MS培养倒掉，用pH值为4. 3的O. 5 mM CaCl2溶液清洗植株3遍，将培养液换成O. 5 mM CaCl2溶液(pH值为4. 3)，培养24小时后，收集培养液测 定苹果酸含量。
2)铝对根生长的影响转基因和野生型拟南芥在MS培养基萌发4天后，将大小一致的幼苗转移到含O或400 μΜ AlCl3的CaCl2固体培养基(CaCl2浓度为O. 5 mM，pH值为4. 3)并测定主根根长。铝处理2天后，再次测定主根根长。计算根的相对生长。
图9为GmALMTl基因的表达对转基因拟南芥耐铝性的影响。其中A 'GmALMTl基因在转基因拟南芥中的表达量分析-.GmALMTl不同转基因株系和野生型拟南芥根部的苹果酸分泌量；C -.GmALMTl不同转基因株系和野生型拟南芥在铝处理条件下的表型分析。D GmALMTl不同转基因株系和野生型拟南芥相对根生长量的比较。CK，转化空载的对照株系； OX, GmALMTl的超表达株系；星号表不冋一指标在超表达株系与对照株系之间的显者性比较*表示显著水平Z7〈O. 05时，差异显著；**表示显著水平O. 001〈 Z7〈O. 01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P〈O. 001时，差异极显著；ns表示差异不显著。
5、田间试验与水培试验图I为田间试验中大豆的总根长和生物量。A :田间试验大豆总根长；B :大豆植株干重； 试验中每个处理设6个重复，图中柱子为试验各处理6个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在同一处理不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，即*表示显著水平产〈0.05时，差异显著；**表示显著水平0.001〈 P〈0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平〈O. 001时，差异极显著。
图2为水培试验中铝、pH值和磷有效性对大豆根生长的影响。A :图中所示为高磷和低磷条件下加铝对大豆相对根生长的影响:图中所示为没有铝处理的条件下，磷和pH 值对大豆相对根生长的影响。其中pH分别为4. 3和pH 5. 8 ;磷处理分别为320 μΜ (+Ρ)和 O μΜ (-P);铝处理分别为 38 μΜ Al3+ (+Al)和 O μΜ Al3+ (-Al)，铝的活性由 GE0CHEM-EZ计算。试验中每个处理设4个重复，图中柱子为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在同一处理不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平/7〈0.05时，差异显著；**表示显著水平O. 001 <P <0. 01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P〈O. 001时，差异极显著。
图3为水培试验中铝、pH值和磷有效性对大豆根系苹果酸积累和分泌的影响。A 高磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸分泌的影响；B :低磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸分泌的影响C :高磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸积累的影响D :低磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸积累的影响。试验中每个处理设4个重复，图中柱子为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在同一处理不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平Z7〈O. 05时，差异显著；**表示显著水平O. 001 <P <0. 01时， 差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P〈O. 001时，差异极显著。
权利要求
1.一种苹果酸转运蛋白基因_z#77，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所/Jn ο
2.—种权利要求I所述苹果酸转运蛋白基因编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—种表达载体，其特征在于含有权利要求I所述的苹果酸转运蛋白基因GmALMTl。
4.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的表达载体。
5.权利要求I所述苹果酸转运蛋白基因在制备转基因植物中的应用。
6.权利要求I所述苹果酸转运子基因GmALMTl在制备促进植物适应酸性土壤的制剂中的应用。
7.权利要求3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用。
8.权利要求3所述的表达载体在制备促进植物适应酸性土壤的制剂中的应用。
9.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述双子叶植物为大豆。
全文摘要
本发明公开了一种苹果酸转运蛋白基因GmALMT1及其应用。该苹果酸转运蛋白基因GmALMT1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明GmALMT1基因可以用于调控大豆根尖苹果酸的分泌。
文档编号C12N15/29GK102925453SQ20121030208
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者梁翠月, 田江, 廖红 申请人:华南农业大学