专利名称：微生物酶法生产磷酸肌酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术生产磷酸肌酸的技术领域，涉及通过微生物酶法转化肌酸和三磷酸腺苷生产磷酸肌酸的方法。
背景技术：
憐酸肌酸(Creatinephosphate, CP 或 Phosphocreatine, PCr 或 PC)也称肌酸憐酸，是肌酸的重要衍生物，于1927年于哺乳动物肌肉中分离得到。在高能量转换的细胞内，磷酸肌酸至少有以下两种作用一是作为细胞内的能量载体，二是作为一种能量缓冲剂。磷酸肌酸作为人体内的一种高能储存物质，已被广泛用于各类心脏病的防治药物，也可作为营养品直接服用，同时作为生化制剂已被广泛用于临床诊断中。
目前磷酸肌酸的制备方法主要有(I)经典法是以肌酸为起始原料，在NaOH溶液中滴加三氯氧磷进行缩合反应，经钡或钙盐交换纯化得到磷酸肌酸二钠盐。这种方法引入的可溶性钡盐具有强烈的毒性，因此对于需要生产供注射用药的磷酸肌酸二钠盐，该工艺可能存在一定的风险。(2)有机合成法是通过制备磷酸肌酐中间体，重结晶纯化，然后加氢脱苄基，获得肌酐磷酸钠，进一步在氢氧化钠水溶液中加热开环得磷酸肌酸二钠盐。这种方法步骤多、成本高，同时引入氢气，操作上具有一定的危险性。(3)生物转化法是以微生物细胞或从生物体中提取的酶作为生物催化剂，利用酶的专一性制备磷酸肌酸，具有反应条件温和、反应速度快和专一性强等优点。已有报道的中国专利CN02129203. 5采用从兔肌肉中提取的肌酸激酶，以磷酸和肌酸为原料，生物酶催化合成磷酸肌酸二钠盐。但由于他采用的肌酸激酶酶活力较低，且受来源限制，不能规模制备，因此不具有产业化价值。肌酸激酶(EC2. 7. 3. 2)，通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、TP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应,反应式如图I所示。不过，传统的酶法采用的肌酸激酶一般提取自动物肌肉，这种采用动物肌肉细胞浆制备的粗酶体系作为酶源，势必引入较多的杂蛋白到反应体系中，将给转化后的分离提取工艺带来困难；也有发明采用3-磷酸甘油酸作为起始底物，采用包括肌酸激酶在内的复合酶系，但由于参与反应的酶较多，各种酶所要求的最适条件不同，因此不能保证同时满足所有酶的最适条件，最终是影响磷酸肌酸的产率。
发明内容
本发明的目的就是解决现有磷酸肌酸制备技术中存在的上述问题，提供一种成本低、产率高、环保无污染的微生物酶法生产磷酸肌酸的绿色转化方法。本发明提供的微生物酶法生产磷酸肌酸的方法包括以表达肌酸激酶的基因工程重组菌的发酵菌体细胞或裂解液为酶源，以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在室温至45°c下，pH9至11，经酶法转化反应O. 5至5h，生产磷酸肌酸。其中，酶促反应液中，底物肌酸的加入量为5至15g/L，三磷酸腺苷的加入量为2. 5至10g/L，酶源的添加量为300至900U/L，辅助因子无水硫酸镁的加入量为32. 5至95mmol/L。底物肌酸的用量优选为10g/L,三磷酸腺苷的用量优选为7. 5g/L,酶源的添加量优选为450U/L，无水硫酸镁的添加量优选为65mmol/L，优选转化温度为37°C，优选转化PH9，优选转化时间3h。所述的表达肌酸激酶的基因工程重组菌为大肠杆菌BL21 (DE3)-pET21a(+)-CPK,表达载体为pET21a(+)-CPK重组表达载体，重组菌体细胞中表达有高活 性的肌酸激酶。所述的表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21，表达载体为pET21a(+) -CPK重组表达载体。本发明自行构建了高效表达肌酸激酶的大肠杆菌基因工程菌株BL21 (DE3) -pET21a(+) -CPK,即从小鼠肌肉中提取总RNA，构建含有小鼠肌酸激酶基因的大肠杆菌基因工程菌，该菌体细胞的肌酸激酶酶活力可达30U/g。收集菌体，进行超声波破碎获得肌酸激酶的粗酶液，酶活约为6U/mL。在本发明实施例中，采用高效液相色谱法来测定磷酸肌酸的含量，具体方法如下高效液相色谱采用C18柱(150X4. 6mm)对磷酸肌酸的含量进行测定，该液相条件为以乙腈-磷酸盐(5:95)为流动相，其中磷酸盐配方为O. 2%磷酸二氢钾和O. 08%四丁基硫酸氢铵；进样量10 μ L ;总流速为I. OmL/min ;检测波长21Onm ;柱温为25°C。本发明的优点和有益效果本发明从底物肌酸和三磷酸腺苷出发，利用高效表达肌酸激酶的大肠杆菌基因工程菌BL21-pET21a(+)-CPK的发酵菌体或裂解液为酶源，酶法催化肌酸和三磷酸腺苷生产磷酸肌酸，具有条件温和、周期短、酶促体系中杂质少、产物分离提取方便、工艺步骤简单、操作安全等优点，有很好的产业化应用前景。
图I是肌酸激酶催化肌酸生成磷酸肌酸的反应示意图；图2是HPLC法测定磷酸肌酸的液相图谱(图中A所示)与标准曲线(图中B所示)；图3是考察磷酸肌酸的转化条件；A :反应温度与转化率的关系；B pH与转化率的关系；C :反应时间与转化率的关系；D :三磷酸腺苷添加量与转化率的关系；E :肌酸添加量与转化率的关系；F :酶量与转化率的关系；G :无水硫酸镁添加量与转化率的关系。图4是在最优转化条件下，HPLC法测定反应结束时转化液中磷酸肌酸的含量。
具体实施例方式一、肌酸激酶活力的测定采用化学显色法测定肌酸激酶活力，原理是在一定条件下，肌酸激酶逆向催化磷酸肌酸生成肌酸，利用肌酸与α-萘酚和双乙酰反应，生成红色化合物。在一定范围内，红色的深浅与肌酸含量成正比，与同样处理的肌酸标准液比色，求得酶活力。具体操作过程如下
I试剂配制(1)混合底物①PH7. 4三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷2. 4g，加入蒸馏水定容至IOOmL,再加入O. 2N盐酸88. 8mL及无水硫酸镁O. 34g，调节pH至7. 4。②12mM磷酸肌酸溶液称取磷酸肌酸钠36mg,加蒸懼水定容至IOOmL,调节pH至7. 4，。③ImM ADP溶液称取ADP钠盐O. 233g，加入蒸馏水定容至IOOmL,调节pH至7. 4。临用前，取上述①、②、③试剂各IOmL混合，即为混合底物。(2)0. 3N氢氧化钡溶液称取氢氧化钡4. 73g，加蒸馏水定容至lOOmL。(3) 5%硫酸锌溶液称取硫酸锌8. 82g,加蒸懼水定容至lOOmL。(4 )标准肌酸溶液(I · 7 μ M/mL )准确称取无水肌酸22. 3mg,加蒸懼水定容至lOOmL。(5)双乙酰溶液先配成1%溶液,置于棕色瓶中4°C保存，临用时用蒸懼水稀释20倍。(6)贮存碱溶液称取30g氢氧化钠,64g无水碳酸钠,加蒸懼水定容至500mL。(7) α-萘酚溶液称取α -萘酚lg，采用上述贮存碱溶液使之溶解，并定容至lOOmL。2测定操作步骤(如下表I所示)表I单位mL
—加入物空白管标准品测定管
裉合底物__0￡5__0￡5__0."5
酶液__/__/__0.1
标准肌酸溶液____01__/_
蒸馏水____/__^_
置于37 eC水浴保'温30 miu Ba(OH)2 溶液0.50.50,5
ZiiSO4 溶液OJ0.5O'5----
蒸馏水0.50.503
混匀，离心5 -I O mill
上清液__05__05__05_
α-萘酚III
双乙酰溶液__05__0￡__03_
置于3，eC水浴保温15 mill 蒸馏水j3I3IJ
离心3-5 mill, 520 mu波长测定吸光度;读取各管的光密度。
酶活力定义在上述反应条件下，于37°C，Imin催化形成I μ mol肌酸所需要的酶量为一个酶活力单位。二、磷酸肌酸含量的测定一HPLC法测定磷酸肌酸的含量高效液相色谱采用C18柱(150 X 4. 6mm)对磷酸肌酸的含量进行测定，该液相条件为高效液相色谱采用C18柱(150X4. 6_)对磷酸肌酸的含量进行测定，该液相条件为以乙腈-磷酸盐(5:95)为流动相，其中磷酸盐配方为O. 2%磷酸二氢钾和O. 08%四丁基硫酸氢铵；进样量10 μ L ;总流速为I. OmL/min ;检测波长21Onm ;柱温为25°C。(如图2A)精确配制系列浓度的磷酸肌酸标准液，连续进样5次，计算峰面积并取平均值，以磷酸肌酸浓度(X，mmol/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产生的磷酸肌酸经适当稀释后以HPLC测定，依据标准曲线进行精确定量。(如图2B)实施例I基因工程菌大肠杆菌的构建及重组肌酸激酶的表达 根据NCBI数据库收录的小鼠肌肉的肌酸激酶基因序列，设计上游引物CPKl 5，-GGGAAT TCC ATA TGC CGT TCG GCA ACA CCC ACA AC-3，(SEQ ID No. I)和下游引物CPK2 :5，-CCG CTC GAG CTT CTG CGC GGG GAT CAT GTC GTC G_3，(SEQ ID No. 2)。提取小鼠骨骼肌总RNA，反转录制备cDNA。以小鼠骨骼肌cDNA为模板，PCR扩增得到肌酸激酶基因。采用基因工程方法，构建重组表达质粒pET-2la (+) -CPK。将重组表达载体pET_2la (+) -CPK转化至E. coli BL21(DE3)，获得基因工程菌株。将阳性重组菌株接种于4mL含有氨苄青霉素100 μ g/mL的LB培养基中过夜培养，随后以1%转接量接入IOOmL含有氨苄青霉素100 μ g/mL的新鲜LB培养基中，37°C振荡培养3h，然后，加入终浓度为ImM的IPTG诱导液，特异性诱导肌酸激酶的表达。所得培养液于4°C下6，OOOrpm离心lOmin，收集菌体，获得表达肌酸激酶的基因工程重组菌(BL21(DE3)-pET21a(+)-CPK)，用50mmol/L的磷酸缓冲液(pH8. O)悬浮洗涤后再离心,收集菌体作为酶原细胞。实施例2重组肌酸激酶基因工程重组菌的发酵将实施例I中的重组大肠杆菌接种于4mL含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养作为一级种子液；随后以1%转接量接入IOOmL含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C，200rpm培养8_12h作为二级种子液；二级种子液以1%接种量转接于IOOL发酵罐中，发酵培养基为新鲜的LB培养基，培养温度37°C，初始转速300rpm，初始pH7. 2。定时取样，菌液0D600nm达到I. 0-1. 2时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导液诱导。下罐发酵液4°C下3，OOOrpm离心15min收集菌体细胞，得到表达肌酸激酶的基因工程重组菌的发酵菌体细胞，按方法一测定，酶活可达30U/g。实施例3重组肌酸激酶基因工程重组菌的裂解液制备按照实施例2发酵重组肌酸激酶基因工程重组菌，获得发酵菌体，收集菌体进行超声波破碎获得肌酸激酶的粗酶液，按照方法一测定其酶活力，酶活约为6U/mL。实施例4转化反应中温度的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞或实施例3制备的裂解液作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入酶量300U/L，底物肌酸5g/L，三磷酸腺苷3. 5g/L，无水硫酸镁50mmol/L,转化pH值10，转化时间O. 5h。考察转化温度30_45°C时对三磷酸腺苷转化率的影响(由于三磷酸腺苷的单价约为肌酸的二十几倍，所以反应体系中，肌酸过量而考察三磷酸腺苷的转化率)，采用方法二检测磷酸肌酸的含量。结果见图3A。实施例5转化反应中pH的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞或实施例3制备的裂解液作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入酶量300U/L，底物肌酸5g/L，三磷酸腺苷3. 5g/L，无水硫酸镁50mmol/L，转化温度为37°C，转化时间O. 5h。考察转化pH值9_11时对三磷酸腺苷转化率的影响，采用方法二检测磷酸肌酸的含量。结果见图3B。实施例6转化反应中反应时间的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞或实施例3制备的裂解液作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入酶量300U/L，底物肌酸5g/L，三磷酸腺苷3. 5g/L，无水硫酸镁50mmol/L,转化温度为37°C，转化pH值为9。考察转化时间O. 5_3h时对三磷酸腺苷转化率的影响，采用方法二检测磷酸肌酸的含量。结果见图3C。
实施例7转化反应中底物三磷酸腺苷的投入量的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞或实施例3制备的裂解液作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入酶量300U/L，底物肌酸15g/L，无水硫酸镁50mmol/L，转化温度为370C，转化pH值为9，转化时间3h。考察三磷酸腺苷3. 5-10g/L时对三磷酸腺苷转化率的影响，采用方法二检测磷酸肌酸的含量。结果见图3D。实施例8转化反应中肌酸投入量的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞或实施例3制备的裂解液作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入酶量300U/L，三磷酸腺苷用量7. 5g/L，无水硫酸镁50mmol/L，转化温度为37°C，转化pH值为9，转化时间3h。考察肌酸投入量5-15g/L时对三磷酸腺苷转化率的影响，采用方法二检测磷酸肌酸的含量。结果见图3E。实施例9转化反应中酶量的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞或实施例3制备的裂解液作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入底物肌酸10g/L,三磷酸腺苷7. 5g/L,无水硫酸镁50mmol/L,转化温度为37°C，转化pH值9，转化时间3h。考察酶添加量为300-900U/L时对三磷酸腺苷转化率的影响，采用方法二检测磷酸肌酸的含量。结果见图3F。实施例10转化反应中无水硫酸镁的浓度的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞或实施例3制备的裂解液作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入酶量450U/L，底物肌酸用量为10g/L，三磷酸腺苷用量7. 5g/L，转化温度为37°C，转化pH值为9，转化时间3h。考察无水硫酸镁的浓度为32. 5-95mmol/L时对三磷酸腺苷转化率的影响，采用方法二检测磷酸肌酸的含量。结果见图3G。从结果可见，以无水硫酸镁32. 5-95mmol/L为辅助因子，在30-45°C，pH值为9-11，酶量300-900U/L，反应O. 5-3h，可以转化底物肌酸和三磷酸腺苷生产磷酸肌酸。同时，通过分析实验结果，结合考虑实际操作以及成本，优选的转化条件为肌酸10g/L，三磷酸腺苷7. 5g/L，无水硫酸镁65mmol/L，酶量450U/L，反应温度37°C，pH值9，反应时间3h。在该优选条件下进行验证实验，三磷酸腺苷的转化率为92%(见图4)。
权利要求
1.一种微生物酶法转化肌酸和三磷酸腺苷生产磷酸肌酸的方法，其特征在于该方法包括以表达肌酸激酶的基因工程重组菌的发酵菌体或裂解液为酶源，以肌酸和三磷酸腺苷为底物，底物肌酸的加入量为5至15g/L，三磷酸腺苷的加入量为2. 5至10g/L，酶源的添加量为300至900U/L，在室温至45°C下，pH9至11，经酶法转化反应0. 5h至5h，生产磷酸肌酸。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的表达肌酸激酶的基因工程重组菌为大肠杆菌BL21 (DE3) -pET21a (+) -CPK,表达载体为pET21a (+) -CPK重组表达载体，重组菌体细胞中表达有高活性的肌酸激酶。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于酶促反应液中，还包括辅助因子无水硫酸镁，无水硫酸镁的加入量为32. 5至95mmol/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述无水硫酸镁的用量优选为65mmol/L。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其特征在于酶促反应液中，底物肌酸的用量优选为10g/L，底物三磷酸腺苷的用量优选为7. 5g/L，酶源的添加量优选为450U/L，优选转化温度为37°C，优选转化pH9，优选转化时间3h。
全文摘要
一种微生物酶法转化肌酸和三磷酸腺苷生产磷酸肌酸的方法。本发明采用基因工程方法，构建高效表达肌酸激酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET21a(+)-CPK，以发酵菌体或裂解液为酶源，催化肌酸和三磷酸腺苷反应生产磷酸肌酸。本发明提供了一种新的磷酸肌酸的绿色生产工艺方法，该方法具有条件温和、周期短、酶促体系中杂质少、产物分离提取方便、工艺步骤简单、操作安全等优点，有很好的产业化应用前景。
文档编号C12R1/19GK102808006SQ20121030182
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者高智慧, 任丽梅, 刘磊, 姚瑞娟, 余琼林, 王文芳, 刘阳 申请人:天津启仁医药科技有限公司