专利名称：绿色巴夫藻培养基配方及三级培养方法
技术领域：
本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及一种绿色巴夫藻培养基配方及三级培养方法。
背景技术：
绿色巴夫藻Pavlova viridid是ー种海洋微藻,属金藻门、普林藻纲、巴夫藻目、巴夫藻科、巴夫藻属，无细胞壁、个体微小、繁殖快、营养丰富，适于水产动物幼体摄食和消化，尤其富含水产经济动物幼体生长和发育所必需的二十ニ碳六烯酸EPA，是ー种优质单胞藻饵料，广泛应用于虾、蟹、贝类幼体及海水仔鱼人工育苗。因EPA和DHA也是人体必需脂肪
酸，可预防和治疗多种疾病，价值越来越受到科研工作者重视。绿色巴夫藻的培养传统上使用MAV培养液配方(即KNO3IOOmg, KH2PO4IOmg,FeSO4 · 7H20 2. 5mg, MgSO4 O. 25mg, EDTA-Na2 IOmg，VB12 5X10_7mg, VB1 6Xl(T3mg，海水lOOOmL)。用此培养基，生长速度慢，产量低。我的实验表明，用尿素取代硝酸盐，生长速度快，且饱和与单不饱和脂肪酸含量高。尿素组密度可达30X IO6 celΙ/mL，而KNO3-高密度仅为19X106 cell/mL。以前緑色巴夫藻培养基中是不加碳源的，但我的实验表明，添加适量的NaHCO3,有利于绿色巴夫藻的生长。过去很长一段时间人们一直认为，水体中游离CO2是藻类利用外源无机碳的唯一形式。1910年，Angelstein首次提出并证实HC<V可作为水生植物的无机碳源。此后大量研究表明，除CO2タ卜，HC03_也是海洋植物的主要无机碳源。岳国峰的实验表明，条斑紫菜可间接吸收HC03_。胞外碳酸酐酶(CA)催化HC03_水解成扩散进入胞内是条斑紫菜无机碳利用的主要形式，占全部无机碳利用的73%以上。张学成的工作也表明，螺旋藻培养基中添加50-100mmol/L NaHCO3时，不仅可以满足螺旋藻生长的需要，而且有助于保持藻体生长的pH值。另外ー些研究表明，蓝藻如多变鱼腥藻(Anabaena variabili)、聚胞藻(Synechococcus)、大型红藻如江蓠(Gracilaria)、条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)等可以利用HC03_作为碳源。Mortain用14C方法直接证明了硅藻在光合作用中可以同化CO2,也可以同化HC03_。Sivak等报道，螺旋藻的光合放氧率远远高于CO2的利用率，从另ー角度证明了螺旋藻可以利用HC0_3。林惠民认为，NaHCO3在培养基中的作用之ー是作为碳源。水体中的总溶解无机碳(TIC)有4种存在形式C02、H2C03、HC03_和CO广。它们存在如下化学平衡C02+H20 = H2CO3 = HCO3^H+ = CO 广+2H.它们之间的平衡又与溶液pH值有密切关系。另外，我还在培养基中补充了 f/2微量元素和m维生素，营养更加全面、均衡，有助于产量的提高。关于绿色巴夫藻的培养方式，以前也是采用三级培养，一级采用三角烧瓶，ニ级用玻璃瓦缸，三级用开放水泥池。现在ニ级培养我用白塑料桶代替玻璃瓦缸，好处是大小合适，易于搬动，操作灵活，不易污染，不忌直射光，可封闭式充气，洗刷方便，可以重复使用，不易损坏，透光性好，成本低廉，生长快，产量高。三级培养我用塑料薄膜悬浮吊带培养代替开放水泥池，好处是成本低、易于操作、不易污染、易于掌控、灵活多祥、不易划破、安全可靠。有的学者建议充入空气和CO2混合气体，比例为V空气VCO2 = 15 I (体积比)，但这样做设备复杂，成本太高，所以直接用气泵充入空气更好。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种绿色巴夫藻培养基配方，配方如下C0 (NH2) 2(即尿素)108mg, KH2P048mg, NaHCO3 500mg,九ニ O植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，f/2微量元素溶液I毫升，f/2维生素溶液I毫升，海水1000毫升。其中f/2 微量元素溶液配方=ZnSO4 · 4H2023 毫克，MnCl2 · 4H20 178 毫克，CuSO4 · 5H2010 毫克，FeC6H5O7 · 5Η203· 9 克，Na2MoO4 · 2Η20 7. 3 毫克，CoCl2 · 6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4. 35 克，纯水1000毫升；f/2维生素溶液配方维生素B12 O. 5毫克，维生素B1IOO毫克，维生素HO. 5毫克，纯水1000毫升。一种绿色巴夫藻三级养殖方法，其特征在于包括如下步骤第一阶段，三角烧瓶培养；用3000-5000mL三角烧瓶培养，海水用脱脂棉过滤，煮沸消毒，添加上述培养基配方。室内培养，空调控温，25± I °C。日光灯管照明，光强3000-60001X，光/暗周期为16L/8D。藻液体积占瓶体积的3/5，取对数生长期藻种接种。灭菌的报纸和橡皮筋封ロ，接种密度25X 104cell/mL。不充气，每天摇瓶6次。藻细胞密度达400X 104-600X 104cell/mL即转入下ー阶段培养。第二阶段，白塑料桶培养；培养用的白色塑料桶为市场售常用聚こ烯塑料桶，圆筒形，直径30cm,高60cm,加满水约6. 5X 104ml,消毒海水洗浄,再用蒸懼水润洗3遍,桶ロ处用酒精擦洗消毒备用。白色塑料桶置于室外水泥地上，顶部有透明玻璃钢瓦遮阴，四周开放式，将白桶放置于离地O. 5m的水泥板上，自然光照射，最佳温度25-30°C，最佳光照強度3000-60001x。培养用海水采用漂白液(次氯酸钠)氧化法消毒。方法是Im3海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10_20mg/L，充气8_12h后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。藻种要选择对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等。接种在上午8:00-10:00进行。接种密度为50X IO4ceI 1/mL，气泵充入空气，充气量不宣太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连ー气石。夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气I小时，停I小时，重复进行。用透明薄膜盖于桶上部，然后用橡皮筋拉紧，进行封闭式培养。经过5-7天的培养，密度达600X 104-800X 104cell/mL即转入下ー级培养。第三阶段，塑料薄膜袋培养；采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚こ烯透明塑料薄膜袋，两头分别用纱布扎ロ。一端扎入I根充气管，末端连2个散气石；塑料袋另ー端扎入ー根长约20厘米，直径6厘米的聚こ烯硬管，作为出气管，此袋即为培养藻的容器。将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长X宽X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中注入O. 8 I. 4立方米的培养基并接入藻种，即可进行培养。每池吊袋6-8个。培养用的海水盐度20-28%。，用次氯酸钠消毒法消毒，方法同第二阶段。加入上述营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，接种密度100X 104cell/mL，室外培养，自然光照射，温度20_30°C，光强3000_60001χ为最佳，充入空气，充气方法同第二阶段。培养4-6天，密度达600 X 104-800 X 104cell/mL即可采收。有益效果緑色巴夫藻的培养传统上使用MAV培养液配方，生长速度慢，产量低。我的实验表明，用尿素取代硝酸盐，添加适量的NaHCO3并补充了九ニ O植物生长刺激素(即赤霉素)、f/2微量元素、f/2维生素，营养更均衡、全面，大大加快了緑色巴夫藻的生长速度，产量可以提高86%。緑色巴夫藻的培养方式，现在ニ级培养我用白塑料桶代替玻璃瓦缸，三级培养我用塑料薄膜悬浮吊带培养代替开放水泥池，易于操作、不易污染、易于掌控、灵活多祥、不易划破、安全可靠，透光性好，成本低，生长快，产量高。
图I为三角烧瓶培养绿色巴夫藻图(一级培养)其中附图标记为1三角烧瓶2藻液3封ロ用的消毒报纸4封ロ用的橡皮筋。图2为塑料白桶培养培养緑色巴夫藻图(ニ级培养)其中附图标记为1塑料白桶2充气管3藻液4散气石5封ロ用的塑料薄膜。图3为塑料薄膜悬浮吊袋方法培养绿色巴夫藻图(三级培养)其中附图标记为1塑料薄膜袋2水泥池3藻液4进气管5出气管6散气石7普通海水。
具体实施例方式培养基配制方法I)柠檬酸铁较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90°C，并不断搅拌至全部融化；2)九ニ O植物生长刺激素(即赤霉素)为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小时以上)，再按所需浓度兑水稀释；3)加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；4)各种营养盐特别是f/2微量元素溶液和f/2维生素溶液均需预先配成母液备用；5)全部营养盐加完后再充气搅拌15分钟，即可接种；6)所有药品纯度均需化学纯级别；7)此培养基配方对绿色巴夫藻各培养阶段都适用。绿色巴夫藻三级养殖方法，參见附图1-3 第一阶段，三角烧瓶培养。用3000-5000mL三角烧瓶培养，海水用脱脂棉过滤，煮沸消毒，添加上述培养基配方。室内培养，空调控温，25± I °C。日光灯管照明，光强3000-60001X，光/暗周期为16L/8D。藻液体积占瓶体积的3/5，取对数生长期藻种接种。灭菌的报纸和橡皮筋封ロ，接种密度25X 104cell/mL。不充气，每天摇瓶6次。藻细胞密度达400X 104-600X 104cell/mL即转入下ー阶段培养。第二阶段，白塑料桶培养。培养用的白色塑料桶为市场售常用聚こ烯塑料桶，圆筒形，直径30cm,高60cm,加满水约6. 5X 104ml,消毒海水洗浄,再用蒸懼水润洗3遍,桶ロ处用酒精擦洗消毒备用。白色塑料桶置于室外水泥地上，顶部有透明玻璃钢瓦遮阴，四周开放式，将白桶放置于离地O. 5m的水泥板上，自然光照射，最佳温度25-30°C，最佳光照強度3000-60001x。培养用海水采用漂白液(次氯酸钠)氧化法消毒。方法是Im3海水中加入漂白液200 300mL，使海水中有效氯含量达到10_20mg/L，充气8_12h后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。藻种要选择对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等。接种在上午8:00-10:00进行。接种密度为50 X IO4Cell/mL，气泵充入空气，充气量不宣太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连ー气石。夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气I小时，停I小时，重复进行。用透明薄膜盖于桶上部，然后用橡皮筋拉紧，进行封闭式培养。经过5-7天的培养，密度达600X IO4Cell/mL-800 X IO4CelΙ/mL即转入下ー级培养。第三阶段，塑料薄膜袋培养。采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚こ烯透明
塑料薄膜袋，两头分别用纱布扎ロ。一端扎入I根充气管，末端连2个散气石，作充气用；塑料袋另一端扎入ー根长约20厘米，直径6厘米的聚こ烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器。将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长X宽X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中加入O. 8 I. 4立方米的培养基并接入藻种，即可进行培养。每池吊袋6-8个。培养用的海水盐度20-28%。，用次氯酸钠消毒法消毒，方法同第二阶段。加入上述营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，接种密度100X 104Cell/mL，室外培养，自然光照射，温度20_30°C，光强3000_60001χ为最佳，充入空气，充气方法同第二阶段。培养4-6天，密度达600 X 104-800 X 104cell/mL即可米收。最后应说明的是以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管參照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
权利要求
1.一种绿色巴夫藻培养基配方，其特征在于该绿色巴夫藻培养基配方如下CO (NH2) 2 (尿素)108mg，KH2PO4 8mg, NaHCO3 500mg,九ニ O植物生长刺激素(赤霉素)5国际単位，f/2微量元素溶液I毫升，f/2维生素溶液I毫升，海水1000毫升；其中f/2微量元素溶液配方ZnS04 · 4H20 23 毫克，MnCl2 · 4H20 178 毫克，CuSO4 · 5H20 10 毫克，FeC6H5O7 · 5H203.9 克，Na2MoO4 · 2H20 7. 3 毫克，CoCl2 · 6H20 12 毫克，Na2EDTA 4. 35 克，纯净水 1000 毫升；f/2维生素溶液配方维生素B12 O. 5毫克，维生素B1IOO毫克，维生素HO. 5毫克，纯净水1000晕升。
2.—种绿色巴夫藻培养基配方，其特征在于该绿色巴夫藻培养基配方如下CO(NH2)2(尿素)108mg, KH2P048mg, NaHC03500mg,体积比 I % 的钥酸水溶液 15ml，硫酸锰5mg,磷酸ニ氢钾IOmg,氯化钾3mg,九ニ O植物生长刺激素(赤霉素)5国际单位，f/2微量元素溶液I毫升，f/2维生素溶液I毫升，海水1000毫升；其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4 · 4H2023 毫克，MnCl2 · 4H20178 毫克，CuSO4 · 5H2010 毫克，FeC6H5O7 · 5Η203· 9 克，Na2MoO4 · 2Η207. 3 毫克，CoCl2 · 6Η2012 毫克，Na2EDTA4. 35 克，纯净水 1000 毫升；f/2 维生素溶液配方维生素B12O. 5毫克，维生素B1IOO毫克，维生素HO. 5毫克，纯净水1000毫升。
3.—种绿色巴夫藻三级养殖方法，其特征在于包括如下步骤 第一阶段，三角烧瓶培养；用3000-5000mL三角烧瓶培养，海水用脱脂棉过滤，煮沸消毒，按照权利要求I中绿色巴夫藻培养基配方顺序和剂量依次添加培养基配方，室内培养，空调控温，25 ± I °C;日光灯管照明，光强3000-60001x，光/暗周期为16L/8D ;藻液体积占瓶体积的3/5，取对数生长期藻种接种；灭菌的报纸和橡皮筋封ロ，接种密度25 X 104cell/mL,不充气，每天摇瓶6次，藻细胞密度达400 X 104-600 X 104cell/mL即转入下ー阶段培养。
第二阶段，白塑料桶培养；培养用的白色塑料桶为市场售常用聚こ烯塑料桶，圆筒形，直径30cm，高60cm，加满水约6. 5X 104ml，消毒海水洗浄，再用蒸馏水润洗3遍，桶ロ处用酒精擦洗消毒备用；白色塑料桶置于室外水泥地上，顶部有透明玻璃钢瓦遮阴，四周开放式，将白桶放置于离地O. 5m的水泥板上，自然光照射，最佳温度25-30°C，最佳光照強度3000-60001X;培养用海水采用漂白液(次氯酸钠)氧化法消毒；氧化法消毒方法是Im3海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10_20mg/L，充气8_12h后，用硫代硫酸钠中和余氯；硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；藻种要选择对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等；接种在上午8:00-10:00进行；接种密度为50X 104cell/mL，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连ー气石；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气I小时，停I小时，重复进行；用透明薄膜盖于桶上部，然后用橡皮筋拉紧，进行封闭式培养；经过5-7天的培养，密度达600X 104-800X 104cell/mL 即转入下ー级培养。
第三阶段，塑料薄膜袋培养；采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚こ烯透明塑料薄膜袋，两头分别用纱布扎ロ ；一端扎入I根充气管，末端连2个散气石；塑料袋另一端扎入一根长约20厘米，直径6厘米的聚こ烯硬管，作为出气管，此袋即为培养藻的容器；将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长X宽X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中注入O. 8 I. 4立方米的培养基并接入藻种，即可进行培养；每池吊袋6-8个；培养用的海水盐度20-28%。，用次氯酸钠消毒法消毒，方法同第二阶段；加入上述营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，接种密度100X 104cell/mL，室外培养，自然光照射，温度20_30°C，光强3000_60001χ为最佳，充入空气，充气方法同第二阶段 ；培养4-6天，密度达600X 104-800X 104cell/mL即可采收。
全文摘要
本发明公开了一种绿色巴夫藻培养基配方及三级培养方法，涉及海洋微藻养殖领域。绿色巴夫藻的培养传统上使用MAV培养液配方，生长速度慢，产量低。我的实验表明，用108mg/L尿素取代硝酸盐，添加500mg/L的NaHCO3并补充了5国际单位/L九二0植物生长刺激素(即赤霉素)、f/2微量元素、f/2维生素，营养更均衡、全面，大大加快了绿色巴夫藻的生长速度，产量可以提高86％。绿色巴夫藻的培养方式，现在二级培养我用白塑料桶代替玻璃瓦缸，三级培养我用塑料薄膜悬浮吊带培养代替开放水泥池，好处是易于操作、不易污染、易于掌控、灵活多样、不易划破、更加安全可靠，透光性好，成本低，生长快，产量高。
文档编号C12R1/89GK102851213SQ20121030100
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者王培磊 申请人:王培磊