专利名称：一种百合ans基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及ー种基因及其克隆方法，尤其是百合ANS基因及其克隆方法。
背景技术：
花色是花卉最重要的性状之一，它主要由类黄酮、类胡萝卜素、生物碱三大类色素决定。类黄酮是大多数花色形成的决定性色素群，它存在于花瓣表皮细胞液中，其中花青素属红色系，其他均属黄色系；类胡萝卜素主要呈现黄色、橙色或红色，它广泛存在于植物的花、叶、果皮和根等部位；生物碱则參与花瓣黄色、橙色及红色的形成。这三大类色素的合成都有众多的结构基因及调控基因參与，包含了多个代谢步骤，作用机理较复杂。传统的花色育种费时费力，而且有很大的局限，研究花色基因，对于通过分子育种手段来人工修饰改变花卉顔色具有非常重要的意义，如可通过直接导入外源结构基因或调节基因、利用反义技术和共抑制原理等等方法来达到改变花色的目的。另外，由于花色直观可见，因此它也是研究基因表达调控和基因互作的热点和基础方向。目前对属于类黄酮的花青素的合成代谢和參与其中的基因研究得较为深入，而对类胡萝卜素等其它色素的研究相对较少。花青素最常见的是矢车菊色素(cyanidin)、飞燕草色素(delphinidin)和天竺葵色素(pelargonidin),它们主要积累在花瓣表皮细胞的液泡中，控制花的红色、紫罗兰色及蓝色等颜色变化，其含量的增高或降低，都可能改变花的顔色。影响花青素代谢的基因有两类ー类是不同植物共同具有的结构基因，它们对应的酶有查尔酮合成酶(chalconesynthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烧酮 3_ 轻化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)、ニ轻基黄酮醇还原酶(dihydrofIavonol4-reductase, DFR)、花色素苷合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)以及类黄酮 3_0_ 糖基转移酶(flavonoid3-0_glucosyltransferase, UFGT)等等,它们直接编码花色素代谢生物合成酶；另ー类是调节基因，目前分为myc转录因子和myb转录因子两大类，它们负责控制结构基因表达强度和程式。ANS位于花青素合成通路末端，主要作用是催化无色花色素转化成有色花色素前体物质丙ニ酰辅酶A和香豆酰辅酶A被CHS和CHI催化形成无色的黄烷酮，黄烷酮在F3H的作用下形成无色的ニ羟基黄酮醇，ニ羟基黄酮醇再被DFR催化还原形成不稳定的无色花色素，然后在ANS和UFGT协同作用下合成各类花色素苷。ANS基因首先是通过转座子标签技术从玉米突变体中分离得到的，研究表明ANS和F3 ' H 一祥,属于2-酮戍ニ酸双加氧酶家族,类黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)也属于此家族,它和ANS具有保守的同源关系。Rosati等从美国金钟连翅(ForsythiaX intermedia cv. “Spring Glory”)中克隆得到了 ANS 基因和其启动子，并证明在美国金钟连翘的花瓣中无花色素苷是由于缺少ANS基因的表达所导致的。目前，已经从众多花丼中克隆得到了 ANS基因，如郁金香(Tulipa gesneriana)、文心兰(Oncidium Gower)、大 _菊(Dahlia pinnata ハ瓜叶菊(Senecio cruentus)、苟药(Paeonialactiflora)等等，但迄今为止，还未见从百合中克隆到该基因的报道。
百合(lilium spp.)是百合科百合属(Lilium)的所有种的总称,它是世界著名的观赏花卉之一，有“球根花卉之王”的美誉。英国皇家园艺学会(RHS)和北美百合学会(NALS)按照百合栽培品种和其原始亲缘种与杂种的遗传衍生关系分为9大类，其中的三类亚洲百合杂种(Asiatic hybrids)、磨香百合杂种(Longiflorum hybrids)和东方百合杂种(Oriental hybrids)目前在我国栽培较多。这其中，东方百合系列以其莖杆挺拔、花朵硕大、色彩丰富、芳香宜人的特点备受消费者欢迎，成为市面上主要的百合切花种类。目前对东方百合的研究主要集中在栽培技术、组织培养、采后生理等方面，基因克隆方面的研究较少。本实验采用同源克隆的方法，设计兼并引物和特异性引物，通过RACE法从东方百合‘Justina’的花蕾中分离得到了 ANS基因的全长序列。这将为进ー步探索百合不同花色的形成原因和分子机制，采用分子育种手段进行百合花色育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的
以充分显色的东方百合‘Justina’花蕾为实验材料，液氮速冻后置于_80°C超低温冰箱保存备用，采用Plant RNAzol试剂提取总RNA提取，合成cDNA第一链，通过引物ANS-Fl TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACC
ANS-Rl TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC对百合ANS基因保守片段的扩增，应用3' RACE引物对聚合酶链式反应产物进行3/ RACE克隆，据测序所得的ANS基因保守区序列设计3' RAC外引物和内引物3' GSP ACTATCCCAAATGTCCGCAACC3' NGSP GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC应用5' RACE引物对聚合酶链式反应产物进行5' RACE克隆，据测序所得的ANS基因保守区序列设计5' RAC外引物和内引物5’ GSP GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA5’ NGSP CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT用Seqman软件将所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列进行拼接，得到A基因的cDNA全长序列，共1356个碱基。找到起始密码子和終止密码子的位置，后分别在起始密码子和終止密码子处设计引物进行全长验证。引物序列如下A-forward CCATTCTACTCCCATCAACCA-reverse TATTTCGTAATCCCCCTCTAPCR扩增反应后进行切胶回收、连接转化、蓝白斑筛选、菌落PCR。
下面结合附图对本发明的具体实施例作进ー步详细的说明。图I百合总RNA琼脂糖电泳结果2百合ANS基因保守区扩增3百合ANS基因3’ RACE片段扩增4百合ANS基因5’ RACE片段扩增5百合ANS基因cDNA全长片段扩增图
具体实施例方式以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。以充分显色的东方百合‘Justina’花蕾为实验材料，液氮速冻后置于_80°C超低温冰箱保存备用。I 总 RNA 提取采用Plant RNAzol试剂,具体方法如下I)将花瓣放入研钵中，加入液氮后快速研磨。研磨充分后，按IOOmg组织/mLRNAzol比例加入RNAzol后立即转入离心管。2)室温放置lOmin，使花瓣充分裂解。 3)4°C、12000rpm离心5min,吸取上清液到新离心管中。4)按200 L氯仿/mL上清液加入氯仿，上下颠倒混匀，室温放置15min，在此过程中不断温和上下翻转离心管，以确保液体混匀。5) 4°C、12000rpm 离心 15min。6)吸取上层水相，至新离心管中。7)加入吸入上清量的0. 8倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置30min。8) 4°C 12000rpm离心IOmin,弃上清(勿将管底RNA吸掉)。9)加入500 u L70%こ醇，温和吸打，悬浮沉淀。10)4°C 12000rpm离心5min，尽量弃上清。若仍有残留上清，可再次离心数秒，弃上清。11)室温下开盖放置5-10min，使こ醇挥发，注意不要过于干燥，否则下一歩RNA将很难溶解。12)用40 ii L DEPC水溶解RNA，可反复吸打以促进RNA溶解。13)稍离心，吸取上清液至新离心管中，即提取到的RNA样品。13)RNA质量的检测取5yl RNA样品在1%琼脂糖凝胶、120V电压下，电泳20min，在凝胶成像系统下拍照检测RNA。2. cDNA第一链的合成采用宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行第一链cDNA的合成，反应体系为在PCR管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量为6 ill。I)Total RNA4u LOligo (dT) 15Primer (50 u M) IuLRNase free dH20IuL2) 70°C保温IOmin后迅速在冰上放置5min。3)离心数秒钟。4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。上述模板RNA/引物变性溶液6 |a L
5 X M-MLV Buffer2 jxL
RNase Inhibitor (40U/|oL)0.25jj,L
IOmM dNTP Mixture0.5(iL
RTase M-Mulv (RNase h-) (200U/jj,L)0.4(aL
RNase free water0.85 (j,L5)42°C温育 60min，70°C温育 15min 后冰上冷却。3.百合ANS基因保守片段的扩增(I)引物设计ANS-Fl TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACCANS-Rl TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC(2)在冰上配制下列PCR反应液
第一链 cDNA1.5 JLiL
2XTaq Green Mix12.5|iL
ANS-Fl(IOjaM)0.5 jj L
ANS-Rl (IOjaM)0.5 p L
Nuclease-Free WaterIO^iL将上述PCR反应液短暂离心混匀后，放入PCR仪中进行以下反应94°C预变性5min，94°C变性 40sec，57. 1°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，35cycles，72で延伸 lOmin, 4°C
Iorever04. ANS 基因3' RACE 克隆据测序所得的ANS基因保守区序列设计3' RAC外引物和内引物3' GSP ACTATCCCAAATGTCCGCAACC3' NGSP :GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC3' RACE 反转录 反应体系Total RNA4.5 fiL
y RACE Adaptor (5 M)I ju L
5 xM-MLV Buffer2 )iL
RNase Inhibitor ( 40 U/ ji L )0.25 L
dNTP Mixture ( 10 mM each)I Reverse Transcriptase M-MLY ( RNase h-) ( 200 U/ ju L ) 0.25 |a I
RNase free WaterI (j,L
Total Volume10 (_iL反应条件 42°C，60min，70°C，15min3' RACE Outer PCR 反应反应体系
上述反转录反应液4 L
IxcDNA Dilution Buffer II6 jj,L
3’ GSP ( 10 jiM)2 juL
y RACE Outer Primer ( 10 卩 M)2 卩 L
IOx LA PCR Buffer II ( Mg2+ Free )4 ji L
MgC12 ( 25 mM )3 ju L
TaKaRa LA Taq ( 5 U/ ju L )0.25 n L
dH2028.75 JiL
Total Volume50 ^iL反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 40sec，54°C退火 3Osec, 72°C 延伸 6Osec,
20cycles, 72°C延伸 lOmin, 4°C forever 3' RACE Inner PCR 反应反应体系1stPCR 产物I juL
dNTP Mixture ( 2.5 mM )8 |a L
IOx LA PCR Buffer II (Mg2+ Free )5 ju L
MgC12 (25mM)5 juLTaKaRa LA Taq ( 5 U/ |a L ) 0.5 ja L3’ NGSP ( 10 juM) 2 uL3’ RACE Inner Primer ( 10 ju M) 2 ju LdH20 26.5 (iL
Total Volume50 jiL反应条件94で预变性5min，94°C 变性 40sec，57. 1°C 退火 30s ec，72°C 延伸6Osec，
30cycles, 72°C延伸 lOmirufC forever 5. ANS 基因 5' RACE 克隆据测序所得的ANS基因保守区序列设计5' RAC外引物和内引物5’ GSP GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA5’ NGSP CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT去磷酸化处理①按下列组份配制去磷酸反应液。
Total RNA ( I |ag/)aL)17 jaL
RNase Inhibitor ( 40 U/ |a L )I M L
10X Alkaline Phosphatase Buffer ( MgC12 Free ) 5 iu L Alkaline Phosphatase ( Calf intestine ) ( 16 U/ ja L ) 0.6 jli L RNase Free dH2026.4|liL②5Oで反应Ih ;③向上述反应液中加入20 ii L 的 3M CH3C00Na(pH5. 2)，130ii L 的 RNase Free
dH20后，充分混匀；④加入200 U L的苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : I)，充分混匀后13，OOOrpm室
温离心5min，将上层水相转移至新的PCR管中；⑤加入200 U L的氯仿,充分混勻后13，OOOrpm室温离心5min,将上层水相转移至
新的PCR管中；
⑥加入2 ii L的NA Carrier后均匀混合；⑦加入200 u L的异丙醇，充分混匀后,冰上冷却IOmin ；⑧13，000rpm4°C离心 20min,弃上清；⑨加入500 u L 的 75%冷こ醇(RNase Free dH20 配制)漂洗，13，000rpm4°C 离心5min,弃上清后干燥；⑩加入7 U L 的 RNase Free dH20 溶解沉淀，得到 CIAP-treated RNA。“去帽子”反应①按下列组份配制“去帽子”反应液。
CIAP-treated RNA7 |iL
RNase Inhibitor ( 40 U/ ju L )IpL
IOxTAP Reaction BufferIjjL
Tobacco Acid Pyrophosphatase ( 0.5 U/ ju L ) I pL②37°C反应 lh，得到的反应液即 CIAP/TAP-treated RNA。5' RACE Adaptor 的连接①配制下列溶液CIAP/TAP-treated RNA5 U L5' RACE Adaptor (15 U M) IuLRNase Free dH204 U L65°C保温5min后,冰上放置2min,然后加入下列试剂。
② RNase Inhibitor ( 40 U/ |a L )I ju L
5 X RNA Ligation Buffer8 jiL
40% PEG#600020 \\L
T4 RNA Ligase ( 40 U/ jli L )I 卩 L③16°C反应 lh。④向上述反应液中加入20 ii L 的 3M Ch3C00Na(ph5. 2), 140 u L 的 RNase FreedH20后，充分混匀。⑤加入200 ii L的苯酚/氯仿/异戊醇(25 24 I)，充分混匀后13，OOOrpm室温离心5min，将上层水相转移至新的PCR管中。⑥加入200 ii L的氯仿，充分混匀后13，OOOrpm室温离心5min，将上层水相转移至新的PCR管中。⑦加入2 ii L的NA Carrier后均匀混合。⑧加入200 u L的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却IOmin。
⑨13，000rpm4°C离心 20min,弃上清。加入 500 u L 的 75%冷こ醇(RNase FreedH20配制)漂洗，13, 000rpm4°C离心5min,弃上清后干燥。⑩加入6 u L 的 RNase Free dH20 溶解沉淀，得到 Ligated RNA。反转录反应配制下列反应液
Ligated RNA6 (j,L
Random 9 mers ( 50 p M)0.5 ju L
5 xM-MLV Buffer2 (iL
dNTP (IOmMeach)I ju L
RNase Inhibitor ( 40 U/ M L )0.25 jaLReverse Transcriptase M-MLV(RNase h~) (200U/U L) 0.25 U L反转录反应条件30°C 10min,42°C lh，70°C 15min反应结束后可以进行下ー步实验，或将反应液保存于_20°C。5' RACE Outer PCR 反应配制下列反应液
反转录反应液5 ju L
IxcDNA Dilution Buffer II5 jxL
IOxLAPCRBuffer II ( Mg2+ Free )4 |uL
MgC12 (25mM)3 juL
TaKaRa LA Taq ( 5 U/ L )0.25 ju L
5'RACE reverse I (10 j_iM)2 ju L
5'RACE Outer Primer ( 10 ju M)2 ju L
dH2028.75 |iL
Total50 (J.LPCR反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 40sec，59. 9°C退火 30sec，72°C延伸 70sec，20cycles,72°C延伸 lOmin,4°C forever 5' RACE Inner PCR 反应
Inner PCR 反应液
Outer PCR 反应液I ju L
IOx LAPCR Buffer II ( Mg2 + Free )5 ji L
MgC12 ( 25 mM)5 |uL
dNTP Mixture ( 2.5 mM)8 n L
TaKaRa LA Taq ( 5 U/ ju L )0.5 jli L 5'RACE reverse2 ( 10 nM)2 \iL
5'RACE Inner Primer ( 10 ロ M)2 n L
dH2026.5 ^iL
Total50 [iLPCR反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 40sec，60. 9°C退火 30sec，72°C延伸 70sec，30cycles,72°C延伸 lOmin,4°C forever 6. ANS基因cDNA全长克隆用Seqman软件将所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列进行拼接，得到A基因的 cDNA 全长序列，共 1356 个喊基。在 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html在线进行ORF查找，找到起始密码子和終止密码子的位置，后分别在起始密码子和终止密码子处设计引物进行全长验证。引物序列如下A-forward CCATTCTACTCCCATCAACCA-reverse TATTTCGTAATCCCCCTCTAPCR扩增反应在冰上配制下列PCR反应液
第一链 cDNA1.5 IiL
2XTaq Green Mix12.5joL
A-forward ( 10 |aM)0.5 jaL
A-reverse ( 10 juM)0.5 ju L
Nuclease-Free WaterI OjiL将上述PCR反应液短暂离心混匀后，放入PCR仪中进行以下反应94°C预变性5min, 94 V 变性 40sec，48. 8 °C 退火 30sec, 72 V 延伸 80sec, 35cycles, 72 V 延伸 IOmin,4°C forever。7.切胶回收(I)柱平衡步骤向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入500 UL平衡液BL，室温下12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(2)将单ー的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中快速切下放入干净的离心管中，称取
质量;(3)向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50°C水浴放置lOmin，其间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；胶块完全溶解后将胶溶液降至室温。(4)将上一部所得溶液加入步骤一得到的吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温 放置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(5)向吸附柱中加入700iiL漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，将吸附柱重新放回收集管中；(6)向吸附柱中加入500iiL漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；(7)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置5-10min,彻底的晾干；(8)将吸附柱放入一个干净的离心管仲，向吸附膜中间位置悬空滴加30 y L洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。(9)重复步骤8。8.连接转化(I)在PCR管中配制下列DNA溶液PMD19-T vector IuLInter DNA4 U L(2)加入L的Solution I,枪头轻揉搅勻；(3)16で反应301^11;(4)全量加入至IOOii L Top 10感受态细胞中，枪头轻揉搅匀，冰中放置30min ；(5)42°C热激60sec后，再在冰中放置2min (该过程不要摇动离心管)；(6)加入890 ii LLB培养基，37°C震荡培养2h ；(7)按每 20ml 培养基加入 40 u L X-Gal (20mg/ml)和 16 u LIPTG (50mg/ml)的标准，将X-Gal和IPTG加入到含Amp的固体培养基上，用涂布棒均匀涂开直至液体被吸收，37 °C下恒温培养30min。(8)吸取200 ii L第6步得到的已转化的感受态细胞到第7步得到的LB固体培养基上，用涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37°C培养12-16h。9.连接转化蓝白斑筛选I)转化后的细胞在含有氨节青霉素的LB平板上培养ー晚后,会长出许多抗性菌落(转化子)，其中有白色菌落(重组子)和蓝色菌落(非重组子)；2)挑取白色单菌落接入IOmL含Amp的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜；
10.连接转化蓝白斑筛选菌落PCR取300iiL菌液12000rpm离心5min，弃上清后用30iiL ddH20重悬菌体，100°C水浴5min使菌裂解，12000rpm离心5min,以上清为模板进行菌落PCR反应,体系如下
权利要求
1.ー种百合ANS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :I所示。
2.ー种百合ANS基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示。
3.ー种百合ANS基因克隆方法，其特征在于按下列步骤进行 (1)提取以及纯化百合花瓣RNA，合成cDNA第一链； (2)应用ー对引物通过聚合酶链式反应对百合cDNA第一链进行扩增，所述引物为 ANS-FI TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACCANS-Rl TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC (3)应用3'RACE引物对聚合酶链式反应产物进行3' RACE克隆，据测序所得的ANS基因保守区序列设计3' RAC外引物和内引物3' GSP ACTATCCCAAATGTCCGCAACC3' NGSP GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC (4)应用5'RACE引物对聚合酶链式反应产物进行5' RACE克隆，据测序所得的ANS基因保守区序列设计5' RAC外引物和内引物5’ GSP GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA5’ NGSP CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT (5)ANS基因cDNA全长克隆，用Seqman软件将所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列进行拼接，得到A基因的cDNA全长序列，共1356个碱基，设计引物进行全长验证，引物序列如下A-forward CCATTCTACTCCCATCAACCA-reverse :TATTTCGTAATCCCCCTCTA。
4.如权利要求3所述的百合ANS基因克隆方法，其特征在于 对百合cDNA第一链进行扩增的PCR反应条件94 V预变性5min，94で变性40sec，·57. 1°C退火 30sec, 72°C延伸 40sec, 35cycles, 72°C延伸 lOmirufC forever3’ RACE克隆的outter PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性40sec，54°C退火3086。，72で延伸 60sec, 20cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever3’ RACE克隆的inner PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性40sec，57. 1°C退火3086。，72で延伸 60sec, 30cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever5’ RACE克隆的outter PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性40sec，59. 9°C退火3086。，72で延伸 70sec, 20cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever5’ RACE克隆的inner PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性40sec，60. 9°C退火3086。，72で延伸 70sec, 30cycles, 72°C延伸 IOmirufC forever全长克隆的PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性40sec，48. 8°C退火30sec，72°C延伸 80sec, 35cycles, 72°C延伸 IOmin, 4°C fofever。
全文摘要
一种百合ANS基因克隆方法，提取以及纯化百合花瓣RNA，合成cDNA第一链，应用一对引物通过聚合酶链式反应对百合cDNA第一链进行扩增，应用3′RACE引物对聚合酶链式反应产物进行3′RACE克隆，应用5′RACE引物对聚合酶链式反应产物进行5′RACE克隆，用Seqman软件将所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列进行拼接，得到A基因的cDNA全长序列，共1356个碱基，PCR扩增反应后进行切胶回收、连接转化、蓝白斑筛选、菌落PCR。
文档编号C12N15/10GK102864159SQ20121030123
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者张克中, 崔金腾, 王瑜, 张睿鹂 申请人:北京农学院