专利名称：一种检测火鹤的serk基因表达状况的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及一种基因检测的方法，尤其是检测火鹤的SERK基因表达状况的方法。
背景技术：
火鹤(Anthurium andraeanum)又名红掌、安祖花，为天南星科(Araceae)花烛属(Anthurium)植物,原产南美洲热带雨林中。其花型独特，佛焰荀明艳华丽，色彩丰富，花期长，叶形别致，观叶观花俱佳，是现在居室不可多得的装饰珍品，世界花卉贸易中，红掌是仅次于热带兰的第二大热带花卉。我国在20世纪70年代引入栽培，目前已成为名贵的切花品种。火鹤一般常用分株繁殖，速度很慢，偶尔也用扦插等方法进行繁殖，但成活率很低，而用播种繁殖必须经过人工授粉才能获得种子，耗费人力，而且种子繁殖有较大变异，所以用常规方法难以扩大生产。目前，花烛组培快繁主要是通过器官发生途径由不同外植体诱导形成愈伤组织，然后由愈伤组织诱导不定芽再生，进行继代增殖。通过器官发生途径获得再生植株并进行快速繁殖已成为一种较有效的繁殖方式，但仍存在外植体诱导愈伤组织周期较长，获得无菌苗速度较慢，且无菌苗长期连续增殖极易发生退化和变异等缺点。而通过体细胞胚胎发生途径再生植株在繁殖率、遗传稳定性等方面均具有许多优势，如一次性产生的体胚数量多，繁殖速度明显比器官发生途径快，遗传性稳定、不易发生体细胞变异，还可以用于遗传改良等。·
目前我国研究大多停留在器官发生途径的水平上，少有体细胞胚胎发生途径的报道，且主要停留在形态细胞学的水平上。
发明内容
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的以火鹤品种‘阿拉巴玛’成熟植株新生幼嫩叶片为外植体，进行胚性愈伤组织发生的诱导，结果表明在 Al (1/2MS+1. 0mg/L6-BA+0. 4mg/L 2，4_D)、A2 (1/2MS+0. 5mg/L6-BA+0. 6mg/L 2,4-D)、A3(1/2MS+0. 5mg/L6-BA+0. 5mg/L 2,4-D)、A4(1/2MS+1. Omg/L6-BA+0. 6mg/L2，4-D)3种培养基中获得较高的愈伤诱导率，愈伤诱导率达到了 85%以上。将启动培养阶段获得的愈伤组织切割置于1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L KT+0. 5mg/L NAA上继代培养，发现生成一种表面不光滑、质地疏松的新愈伤组织，后经细胞学观察鉴定为胚性愈伤组织。将继代培养获得的新愈伤组织切割置于1/2MS+0. 5mg/L6-BA培养基上进行发育培养，胚性愈伤组织继续膨大，最后分散为单个的瘤状物，直至长成为小植株。以火鹤胚性愈伤组织为材料，进行总RNA的提取。应用扩增得到的火鹤SERK基因的全长cDNA序列，设计特异性较强的引物 CAGACGGTTCACTTGTGGCAG 和 ATCCACGAAGGCGAAGGAGGTT，以 18S rRNA作为内参基因，采用实时荧光定量PCR技术，分析了火鹤体胚诱导与发育阶段SERK基因转录水平的表达变化情况，由图3可知18S rRNA基因扩增得到的Ct值和起始模板稀释数的相关性良好，显示了很好的线性关系；标准曲线的斜率相差O. I左右，引物对两个基因的扩增效率相近，可以采用2_Λ Δετ方法分析后续数据；由图4和图5SERK基因扩增得到的S型荧光定量动力学曲线和融合曲线可知=SERK在实时荧光定量PCR过程中，荧光强度均有不同程度的增加，说明模板有扩增；在扩增过程中只存在单一峰，表明SERK基因的引物的特异性很好，没有产生非特异性扩增和二聚体；根据荧光定量PCR内参基因18SrRNA和SERK基因的Ct值，见图6，应用2_ΛΛετ方法进行火鹤体细胞胚发生过程中不同发生发育阶段培养物SERK基因的相对定量计算。以零处理的叶片作为对照，对其它11个不同时期培养物进行定量分析，结果如图7，其中荧光定量表达分析标准曲线、溶解曲线、扩增曲线均符合扩增要求，可知火鹤体细胞胚发生发育过程中三个不同培养时期SERK基因的表达呈现出3个阶梯状下降趋势，其中诱导培养阶段中诱导处理IOd的叶片中含有的SERK基因的表达量是诱导处理30d的2倍，其后的培养中SERK基因的表达量显著下降。将诱导培养阶段获得的愈伤组织接种到继代培养基上，继代培养IOd后，检测到SERK基因大量表达，其相对表达量达到17. 92，可能是在这个时期SERK基因的大量表达促使了胚性愈伤组织的发生，到继代培养一个月后SERK基因的表达接近于无。将继代培养获得的胚性愈伤组织接种到胚发育培养基上后，SERK基因的表达又略有增加，但是仅仅是胚性愈伤组织发生阶段的1/3，其后 随着胚的发育，SERK基因的表达又逐渐减少。
下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步详细的说明。图I火鹤总RNA琼脂糖电泳结果2火鹤SERK基因荧光定量检测片段扩增结果3火鹤体细胞胚发生过程中18S rRNA和SERK基因的标准曲线(A为18S rRNA的标准曲线，B为SERK基因的标准曲线)图4SERK基因S形荧光定量动力学曲线图5SERK基因的融合曲线图6火鹤体细胞胚发生过程中18S rRNA和SERK基因的Ct值图7火鹤体胚发生过程中SERK基因的相对表达
具体实施例方式以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。取刚展开的幼嫩叶片为外植体材料,经过O. I %升萊3min表面灭菌后,用无菌水冲洗4-5遍，将叶片沿中脉切成I X Icm叶片切块平铺接种于1/2MS+0. 5mg/L6-BA+0. 5mg/L2，4-D培养基中，培养基Ph值为5. 8，接种10瓶，每瓶3块叶片，于(25±2) °C黑暗条件下诱导愈伤组织。两个月后待粒状愈伤组织连成片后，将愈伤组织切割置于l/2MS+1.0mg/L6-BA+0. lmg/L KT+0. 5mg/L NAA上继代培养，继代培养获得的新愈伤组织切割置于1/2MS+0. 5mg/L6-BA培养基上进行发育培养。以在继代培养基上培养20天的胚性愈伤组织为试验材料，经改良CTAB提取法提取总RNA。I)取2mL离心管，加CTAB裂解液900 μ L，β -巯基乙醇30 μ L，65°C水浴IOmin ；
2)称取IOOmg胚性愈伤组织于液氮中研磨。将预热的CTAB裂解液加入到研钵中裂解，融化后迅速转入2mL离心管，涡旋混匀30s，65°C水浴5min ；3)加入ImL氯仿/异戍醇，润旋混勻，4°C, IOOOOrpm,离心15min ；；4)取上清至新的2mL离心管，加入2 μ L的DNase I和5 μ LBuffer, 37 °C反应20min, 4°C, IOOOOrpm,离心 15min ；5)取上清至新的2mL离心管，加入ImL氯仿/异戊醇，涡旋混匀，4°C，IOOOOrpm,离心 15min ；6)取上清至I. 5mL离心管，加入1/3体积的8mol/L LiCl，4°C沉淀过夜(不超过16h)；7) 4°C, 12000rpm离心20min,弃上清，加入500 μ L70%乙醇悬浮沉淀； 8) 4°C, 12000rpm 离心 5min,加入 500 μ L100% 乙醇,弃上清,室温倒置 Imin ；9)加入30 μ L RNAse-free水溶解RNA，I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。改良CTAB法提取的火鹤总RNA，cDNA第一链的合成反应体系为DTotal RNA5μ LOligo (dT) 15 Primer IuL2) 70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min以上；3)离心数秒钟使变性引物聚集于MiciOtube管底部；
4 )上述变性溶液6 μL
5X M-MLV Buffer2 μL
RNase Inhibitor (40U/pL)0.25pL
I OmM dNTP Mix0 · 5 pL
RNase free water0.75 gL
RTase M-Mulv (RNase h-) (200υ/μ )0.5pL
Total10μΣ5)42°C温育 60min,70°C温育 15min 后冰上冷却。火鹤SERK基因表达实时荧光定量PCR分析火鹤胚状体发生发育过程中启动培养(4个时期)、继代培养(3个时期)、发育培养(4个时期)3个阶段的不同时期的组织材料。根据克隆出的火鹤体胚SERK基因全长序列，设计一对引物进行火鹤体胚发生过中SERK基因表达实时荧光定量试验，长度为129bp。YGPCR forwardI CAGACGGTTC ACTTGTGGCA GYGPCR reverseI ATCCACGAAG GCGAAGGAGG TT采用18SrRNA基因为内参基因(片段长度171bp)18S rRNA F CCTGAGAAAC GGCTACCACA T
18S rRNA R CACCAGACTT GCCCTCCAPCR 反应体系(25 μ L)
SYBR Premix Ex Taq II ( 2 x )12.5 μ L
PCRForwardPrimer ( 10 μ Μ)0.5 μ L
PCR Reverse Primer (10 μ M)0.5 μ L
cDNA 模板2 μ L dH20 (灭菌蒸德水)9·5 μ LPCR反应程序(两步法)18S rRNA基因扩增预变性 95°C 30sec ;95°C变性 IOsec ;62°C退火 30sec ;循环数50。火鹤SERK基因扩增预变性95°C 30sec ;95°C变性IOsec ;62°C退火30sec ;循环数50。一种检测火鹤的SERK基因表达状况的试剂盒，该试剂盒中实时荧光定量PCR反应体系(25 μ L)为:
SYBR Premix Ex Taq II ( 2 x )12.5 μ L
PCR Forward Primer ( 10 μ M)0.5 μ L
PCR Reverse Primer (10 μ M)0.5 μ L
cDNA 模板2 μ L
dH209.5 μ LPCR反应程序18S rRNA基因扩增预变性 95°C 30sec ;95°C变性 IOsec ;62°C退火 30sec ;循环数50 ；火鹤SERK基因扩增预变性95°C 30sec ;95°C变性IOsec ;62°C退火30sec ;循环数50。采用实时荧光定量PCR技术，分析了火鹤体胚诱导与发育阶段SERK基因转录水平的表达变化情况，由图3可知18SrRNA基因扩增得到的Ct值和起始模板稀释数的相关性良好，显示了很好的线性关系；标准曲线的斜率相差O. I左右，引物对两个基因的扩增效率相近，可以采用2_“CT方法分析后续数据；由图4和图5SERK基因扩增得到的S型荧光定量动力学曲线和融合曲线可知=SERK在实时荧光定量PCR过程中，荧光强度均有不同程度的增加，说明模板有扩增；在扩增过程中只存在单一峰，表明SERK基因的引物的特异性很好，没有产生非特异性扩增和二聚体；根据荧光定量PCR内参基因18S rRNA和SERK基因的Ct值，见图6，应用2_ΛΛετ方法进行火鹤体细胞胚发生过程中不同发生发育阶段培养物SERK基因的相对定量计算。以零处理的叶片作为对照，对其它11个不同时期培养物进行定量分析，结果如图7，其中荧光定量表达分析标准曲线、溶解曲线、扩增曲线均符合扩增要求，可知火鹤体细胞胚发生发育过程中三个不同培养时期SERK基因的表达呈现出3个阶梯状下降趋势，其中诱导培养阶段中诱导处理IOd的叶片中含有的SERK基因的表达量是诱导处理30d的2倍，其后的培养中SERK基因的表达量显著下降。将诱导培养阶段获得的愈伤组织接种到继代培养基上，继代培养IOd后，检测到SERK基因大量表达，其相对表达量达到17. 92，可能是在这个时期SERK基因的大量表达促使了胚性愈伤组织的发生，到继代培养一个月后SERK基因的表达接近于无。将继代培养获得的胚性愈伤组织接种到胚发育培 养基上后，SERK基因的表达又略有增加，但是仅仅是胚性愈伤组织发生阶段的1/3，其后随着胚的发育，SERK基因的表达又逐渐减少。
权利要求
1.一种检测火鹤的SERK基因表达状况的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)愈伤组织的诱导与继代培养、发育培养取刚展开的幼嫩叶片为外植体材料，经过O.I %升汞3min表面灭菌后，用无菌水冲洗4_5遍，将叶片沿中脉切成I X Icm叶片切块平铺接种于1/2MS+0. 5mg/L6-BA+0. 5mg/L2，4_D培养基中，培养基Ph值为5. 8，于25±2°C黑暗条件下诱导愈伤组织，愈伤诱导率达到了 85%以上，两个月后待粒状愈伤组织连成片后，将愈伤组织切割置于l/2MS+1.0mg/L6-BA+0. lmg/L KT+O. 5mg/L NAA上继代培养，继代培养获得的新愈伤组织切割置于1/2MS+0. 5mg/L6-BA培养基上进行发育培养，将启动培养获得的愈伤组织切成小块，转入不加2，4-D的培养基上进行继代培养20 30d ； (2)以火鹤胚性愈伤组织为材料，用改良的CTAB法提取总RNA； (3)设计一对引物进行火鹤体胚发生过中SERK基因表达实时荧光定量试验，长度为 129bp ；YGPCR forwardI CAGACGGTTC ACTTGTGGCAGYGPCR reverseI ATCCACGAAG GCGAAGGAGG TT 以18S rRNA基因作为内参，采用实时荧光定量PCR分析火鹤体胚发生发育过程中SERK基因表达的变化规律，18SrRNA基因为内参基因，片段长度171bp，18S rRNA F CCTGAGAAACGGCTACCACAT18S rRNA R :CACCAGACTTGCCCTCCA。
2.如权利要求I所述的一种检测火鹤的SERK基因表达状况的方法，其特征在于改良CTAB提取法为(1)取2mL离心管，加CTAB裂解液900μ L，β -巯基乙醇30 μ L，65°C水浴IOmin ； (2)称取IOOmg胚性愈伤组织于液氮中研磨。将预热的CTAB裂解液加入到研钵中裂解，融化后迅速转入2mL离心管,润旋混勻30s,65°C水浴5min ； (3)加入ImL氯仿/异戍醇,润旋混勻，4°C,IOOOOrpm,离心15min ；； (4)取上清至新的2mL离心管,加入2μ L的DNase I和5 μ LBuffer, 37°C反应20min,4°C，IOOOOrpm,离心 15min ； (5)取上清至新的2mL离心管,加入ImL氯仿/异戍醇,润旋混勻,4°C,IOOOOrpm,离心15min ；(6)取上清至I.5mL离心管，加入1/3体积的8mol/L LiCl，4°C沉淀不超过16h ； (7)4°C, 12000rpm离心20min,弃上清,加入500 μ L70%乙醇悬浮沉淀； (8)4°C，12000rpm离心5min,加入500 μ LlOO %乙醇,弃上清,室温倒置Imin ； (9)加入30μ L RNAse-free水溶解RNA，I. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测。
3.—种检测火鹤的SERK基因表达状况的试剂盒，其特征在于该试剂盒中实时荧光定量PCR反应体系(25 μ L)为:SYBR Premix Ex Taq II ( 2 x )12.5 μ L PCR Forward Primer (10 μ M)0.5 μ L PCR Reverse Primer (10 μ M) 0.5 μ L cDNA 模板2 μ L dH209.5 μ LPCR反应程序18S rRNA基因扩增预变性95°C 30sec ;95°C变性IOsec ;62°C退火30sec ;循环数50 ；火鹤SERK基因扩增预变性95°C 30sec ;95°C变性IOsec ;62°C退火30sec ;循环数50。·
全文摘要
一种检测火鹤的SERK基因表达状况的试剂盒及其方法，属于植物分子生物学领域。以火鹤盆栽品种‘阿拉巴玛’成熟植株刚展开幼嫩叶片为外植体，进行火鹤胚性愈伤组织的诱导，并对两个诱导阶段获得的非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织进行细胞学观察；通过克隆得到火鹤体胚SERK基因的cDNA基因全长序列设计特异性较强的引物，并采用实时荧光定量PCR技术对火鹤体细胞胚诱导与发育阶段的SERK基因转录水平的表达量变化进行研究分析，得到成本较低，特异性较高的检测火鹤的SERK基因表达状况的试剂盒及其方法。
文档编号C12Q1/68GK102925550SQ20121030123
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者张克中, 崔金腾, 王爱香, 张睿鹂 申请人:北京农学院