专利名称：一株海洋真菌链格孢属mnp801及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株海洋真菌-链格孢属(Alternaria sp. )MNP801,及其在制备抗
肿瘤药物和胰蛋白酶抑制剂中的应用。
背景技术：
寻找生理活性强的物质发展成为抗癌、抗菌、抗氧化等药物是人类攻克疾病的主要工作之一。海洋环境苛刻，具有低温、低照、高盐、高压和寡营养等特点，海洋微生物由于栖息于这样的极限环境下，产生了与陆地生物完全不同的代谢系统和机体防御系统，所以能产生许多结构新颖、活性特异的次级代谢产物，研究发现它们许多成分也具有抗癌，抗菌等药用价值，并且许多特异的化学结构类型是在陆地微生物中难以发现的。细胞培养法是筛选抗肿瘤药物比较常用的一种筛选方法，常用的有MTT法等。
发明内容
本发明目的是提供一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌——链格孢属(Alternaria sp. ) MNP801 及其应用。本发明采用的技术方案是一株海洋真菌-链格孢属(Alternaria sp. )MNP801,保藏于中国典型培养物保
藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No :M2012288，保藏日期2012年7月18日。本发明还涉及所述的链格孢属MNP801在制备抗肿瘤药物中的应用，具体为所述链格孢属MNP801提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物具体可为治疗肝癌或神经癌的药物。所述的链格孢属MNP801在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，具体为所述链格孢属MNP801提取物在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。优选的，所述提取物为乙酸乙酯提取物，由如下方法制得将链格孢属MNP801接种至液体发酵培养基中，于25 35°C、15(T210r/min振荡条件下培养14 30(1，得到发酵液，将发酵液经细胞破碎后，离心取滤液用乙酸乙酯萃取，浓缩得浸膏(密度为I. 2^1. 7g/ml),即为所述链格孢属MNP801的乙酸乙酯提取物；所述发酵培养基组成为麦芽浸粉3. 0 7. Og/L,麦芽糖I. 5 2. Og/L,葡萄糖3. 0 7. Og/L,酵母浸粉0. 8 I. 5g/L，溶剂为水。具体的，所述乙酸乙酯提取物可按如下方法获得a.海洋真菌MNP801的种子培养挑取海洋真菌MNP801菌株接入种子培养基，于25-35°C、150-210r/min培养48h，得到种子液；种子培养基组成如下麦芽浸粉3. (T7. Og/L,麦芽糖I. 5^2. Og/L,葡萄糖3. (T7. 0g/L，酵母浸粉0. 8^1. 5g/L，溶剂为水；b.海洋真菌MNP801的发酵培养将上述种子液接入发酵培养基，于25 35°C、15(T210r/min培养21d，得到发酵液；发酵培养基组成如下麦芽浸粉3. (T7. Og/L,麦芽糖I. 5^2. Og/L,葡萄糖3. (T7. Og/L,酵母浸粉0. 8 1.5g/L，溶剂为水；c.将上述培养好的发酵液超声破碎；d.将上述破碎好的发酵液过滤除去菌体；e.将上述过滤好的发酵液(滤液)，用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制的浸膏(I)；f.将上述菌体冷冻干燥，甲醇浸泡后，过滤除去菌体，滤液浓缩挥干，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制的浸膏(2)；g.将上述浸膏(1)，浸膏(2)合并，即得到发酵液的提取物。
经实验验证，本发明海洋真菌MNP801的乙酸乙酯提取物胰蛋白酶抑制活性IC5tl(ug/ml)为301. 56 ;对卩(12肿瘤细胞的半抑制率浓度IC50 (ug/ml)为92. 97，对HepG-2肿瘤细胞的半抑制率浓度IC5tl (ug/ml)为88. 81。本发明的有益效果主要体现在提供了一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗H印G-2肿瘤细胞(肝癌细胞)和PC12肿瘤细胞(神经癌细胞)作用，同时具有胰蛋白酶抑制活性，为新药研发提供了基础。
图I为平板培养基上海洋真菌MNP801的菌落形态；图2为光学显微镜下海洋真菌MNP801的菌体形态。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :( I)海洋真菌MNP801的种子培养挑取海洋真菌MNP801菌株(CCTCC No:M2012288)接入种子培养基，于28°C、200r/min培养48h，得到种子液；种子培养基组成如下麦芽浸粉6. Og/L,麦芽糖I. 8g/L，葡萄糖6. Og/L，酵母浸粉I. 2g/L，溶剂为水；(2)海洋真菌MNP801的发酵培养将上述种子液以10%体积比接入发酵培养基，于28°C、200r/min培养21d，得到发酵液；发酵培养基组成如下麦芽浸粉6. 0g/L,麦芽糖I. 8g/L，葡萄糖6. 0g/L,酵母浸粉1.2g/L，溶剂为水；(3)有效成分提取将上述培养好的发酵液于细胞破碎仪下超声破碎，然后过滤除去菌体，取滤液用等体积乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制得浸膏I (密度约为I. 5g/ml)将上述菌体冷冻干燥，甲醇浸泡后，过滤除去菌体，滤液浓缩挥干，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制的浸膏2 (密度约为I. 5g/ml)；g.将上述浸膏1，浸膏2合并，即得到发酵液的乙酸乙酯提取物。实施例2 :海洋真菌提取物的酶抑制，抗肿瘤活性试验I.胰蛋白酶抑制活性测试
(I)胰蛋白酶抑制活性测试所需试剂的配制配制IOOOmlO. lmol/L的Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液)加入6. 057g三羟甲基氨基甲烷、0. lmol/L的盐酸385ml及I. 1099g CaCl2于蒸馏水中，并定容
至Ho配制25ml2mM底物BAPNA (Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐):称取底物BAPNAO. 0217g于容量瓶中，使用0. lmol/L的Tris-HCl缓冲液将其定容至25ml。配制50ml2mg ml/1的胰蛋白酶称取胰蛋白酶0. Ig于50ml容量瓶中，使用
0.lmol/L的Tris-HCl缓冲液将其定容至50ml。最后配制30% (v/v)乙酸用于停止反应。
(2)胰蛋白酶抑制活性法测定活性将样品提取物配成100 V- g mL_1 > 50 u g mL_1>25 u g mL'12. 5 y g mL'6. 25 ug -mr1等5个不同的浓度，于96孔板中加入待测样品50 y L (Tris缓冲液溶解)，用等体积的缓冲液作为对照组，然后在样品组和对照组中加入预先于37°C水浴孵化IOmin的2mg 胰蛋白酶50 ii L和2mM底物BAPNA100 u L，37°C保温反应30min后，再加入30%乙酸50 ii L终止反应；空白组则在乙酸终止反应之后，再加入底物BAPNA，其余操作同上，酶标仪405nm下检测OD。按下式计算抑制率抑制率(%)==[1 -(样品组OD —空白组0D)/(对照组OD —空白组0D) ] X 100%用SPSS软件测得海洋真菌MNP801的提取物胰蛋白酶抑制活性IC5tl (ug/ml)为301.53ug/ml。2.体外抗肿瘤活性测试采用H印g2，PC12两种肿瘤细胞系,进行MTT试验(I)取对数生长期的细胞，用0. 25%胰酶消化制成单细胞悬液，用含血清10%的RPM1640培养基，调节细胞浓度为2X IO5个/ml，每孔IOOul细胞悬液的量加入至96孔细胞培养板，在饱和温度37°C、5%C02培养箱中培养；(2) 12h后，吸弃培养基，对照组加入100ul2%的RPM1640培养基；空白组加入IOOu12%的RPM1640培养基；给药组加入不同浓度梯度，即50，100, 200,400,800ug/ml的供试样品，各组均为5个复孔，继续培养48h ；(3)在实验结束前4h，每孔加入20ulMTT (四甲基偶氮唑盐，5mg/ml，用PBS缓冲液配制)，继续在37°C、5%C02培养箱中培养4h ；(4)小心吸弃上清,每孔各加入150ul 二甲基亚砜(DMS0),振荡，酶标仪490nm处测定OD值。按下述公式计算抑制率抑制率(%)==[1 -(样品组OD —空白组0D)/(对照组OD —空白组0D) ] X 100%用SPSS软件测得海洋真菌MNP801的提取物对PC12肿瘤细胞半抑制率浓度IC5tl值为92. 97ug/ml，提取物对H印G-2肿瘤细胞的半抑制率浓度IC5tl值为88. 8lug/ml 0
权利要求
1.一株海洋真菌——链格孢属(Alternaria sp. )MNP801，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No :M2012288，保藏日期2012年7月18日。
2.如权利要求I所述的链格孢属MNP801在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗肝癌或神经癌的药物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述链格孢属MNP801提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求I所述的链格孢属MNP801在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述链格孢属MNP801提取物在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。
7.如权利要求4或6所述的应用，其特征在于所述提取物为こ酸こ酯提取物，由如下方法制得将链格孢属MNP801接种至液体发酵培养基中，于25 35°C、15(T210r/min振荡条件下培养14 30d，得到发酵液，将发酵液经细胞破碎后，离心取滤液用こ酸こ酯萃取，浓缩得浸膏，即为所述链格孢属MNP801的こ酸こ酯提取物；所述发酵培养基组成为麦芽浸粉3.0 7. Og/L,麦芽糖I. 5 2. Og/L,葡萄糖3. 0 7. Og/L,酵母浸粉0. 8 I. 5g/L，溶剂为水。
全文摘要
本发明提供了一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌——链格孢属(Alternaria sp.)MNP801及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No:M2012288，保藏日期2012年7月18日。本发明的有益效果主要体现在，提供了一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗HepG-2肿瘤细胞和PC12肿瘤细胞作用，同时具有胰蛋白酶抑制活性。
文档编号C12N1/14GK102952756SQ20121030192
公开日2013年3月6日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者王鸿, 陈俊, 谢燕瑾 申请人:浙江工业大学