专利名称：可产生紫杉醇的链格孢属真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用生物工程方法分离的可产生紫杉醇的链格孢属真菌。
背景技术：
紫杉醇类化合物是从红豆杉科红豆杉属植物中分离得到的二萜类化合物的 总称，其中尤为引人注目的是紫杉醇，其他二萜类化合物一般也具有紫杉醇母 核结构，有些是紫杉醇生物合成的前体物，并且可以人工合成为具有药用价值 的新化合物，紫杉醇能够与细胞微管蛋白结合，阻止微管解聚，有效地控制癌 细胞的快速分裂和增殖，作为一种作用机制独特的抗癌新药，自问世以来一直 受到人们的重视，但由于紫杉醇在天然红豆杉中的含量很低，加上红豆杉资源 有限，因此限制了紫杉醇的进一步开发应用，为了解决这个问题，近些年来科 学家们在寻找及扩大紫杉醇药源途径上进行了大量的工作，其中包括化学合成、 生物技术及利用共生菌发酵生产等，生产紫杉醇具有十分巨大的经济效益和广 阔的开发空间。
发明内容
本发明的目的是提供一种可产生紫杉醇的链格孢属真菌。 上述的目的通过以下的技术方案实现
可产生紫杉醇的链格孢属真菌，分离自红豆杉树皮，将野外采集的树皮 无菌带回实验室中，用无菌小刀切成块，三点栽植于水琼脂培养基上，待长出 白色菌丝后，保留，经过发酵、薄层层析和高效液相色谱分析证明其具有产生 紫杉醇的能力，该酵母保藏于CCTCC，保藏号M207165。
所述的可产生紫杉醇的链格孢属真菌，所述的菌种的扩增反应体系如下: DNA模板lpl约100纳克(ng)， 2.5毫摩尔/升(mmol/1)碱基名称(dNTP) 2jU， 10 x缓冲液2.5fU， IO百万分摩尔(pmo1/1)引物2jd， Taq (DNA聚合酶)酶0.2jil ( 5 U/nl ),最后以去离子水补足至25^11,扩增反应条件如下具体 条件如下94 'C预变性5 min， 94。C变性45sec, 55'C退火45sec， 72""C延伸 45sec，共完成30个循环，最后72'C延伸5min。
所述的可产生紫杉醇的链格孢属真菌，所述的菌株rDNA部分序列
18srDNA扩增引物序列 Al (引物名称)5'-TCGGGCGATGTTCTTTTTCTG-3， A2 (引物名称)5'-GAGCCATTCAATCGGTAGTAGC-3， ITS扩增引物序列
Bl (引物名称)5，-TAGGTGAACCTGCGGAAGGA-3， B2 (引物名称)5'画TTCCCTGTTCACTCGCCGTTACT隱3，
应用特异性引物Al和A2扩增紫杉醇产生菌HDF1的18srDNA片段。Bl 和B2扩增紫杉醇产生菌HDF1的ITS片段。
这个技术方案有以下有益效果
通过本发明，解决了一直亟待解决的紫杉醇的生产问题，为紫杉醇产生提 供了稳定的途径，可以大幅度降低制药成本。
本发明方法，涉及的分析试材廉价易得、成本较低，是一种简便、耗时较 少的发酵液中紫杉醇类化合物生产方法。
本发明方法与高效液相法相比较成本较低，高效液相法需要至少十几万以 上的设备，保养复杂，操作人员要求素质教髙，人员培养时间较长，培养成本 较高，而本发明方法仅需要万元左右设备，操作人员能够很容易地掌握操作方 法，操作人员要求素质不高，培养成本较低。
本发明的具体实施方式
: 实施例l:
一、菌种特点
1、菌种属名链格孢属2、 菌株号HDF1
3、 菌株拉丁名Alternaria
4、 菌株个体培养特征
菌丝大多数表生，部分内生，有隔，多分支，菌丝上有小疣，菌丝褐色， 顶端渐变成无色，直径2.5-5.0微米(nm)。分生孢子梗褐色至浅褐色，有隔膜, 单生，直立或稍弯曲(曲膝状)，L7 3.0nm，长12.5 27.4x2.5 5.0nm。产孢 细胞圆柱状，为菌丝细胞直接产孢。分生孢子高端生或间生，单生或短链状，2 3个串生，排列成直的长链，梨形、椭圆形、或拟卵形，棒形，褐色至浅褐色， 光滑，壁砖状，具3 8个横隔膜，多数无纵隔，大小6.0 12.4xl8.9 33.7^im。 无喙或喙短，喙长2.5 3.0x3.0 9.(Him。分生孢子较宽的部位连接分生孢子梗 而细长部位则着生另一个分生孢子。
5、 菌落群体特征
HDF1菌株在固体平板表面生长迅速旺盛，28'C培养5天菌落直径达6厘米 (cm)。菌落平展，边缘整齐，呈茸毛状、毡状。开始菌丝白色，后期变为淡青 绿色，边缘灰白色，内部浅褐色，中部深褐色，呈波纹状。背部深绿色，无渗 出物。菌落高0.1 0.5cm左右。
6、 菌种核糖体小亚基(rDNA)部分序列特征
(1) 18SrDNA部分序列 TGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGTCA GGGACGTAATCAACGCATGCTGATGACACGCGCTTACTAGGCATTCC TCGTTGAAAAGCAATAATTGCAATGCTTTATCCCCAGCACGACAGAG TTTAACAAGATTACCCAATTCTTTCGAACAAGGAAAAGAACTCGTTGG CTCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCA CAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCAACTTGAGTTGATAGTCTC TCTAAGAAGCCGGCGACCAACCAAAGTTAGCCTGGCTATTTAGCAGA GTAAGGTCTCGCTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAGTCACCCCACG
CTCAATCTGTCAATCCTTATTTCATCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGT GTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTGGTGGTGACCTTCC GTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATAATCCCCCCAGAACC CAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGAGTCAGAAAAAGAA CATCGCCCGA
(2) 核糖体亚基间隔序列(ITS)
5GATTTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACACAAATATGAAGGCGG
GCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGT
CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGAC
AAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATA
ATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA
CGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATC
ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCA
TGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGG
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AGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATC
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GATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAG
GAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGCGTGA人CAGG
GAAAAT
7、培养基
马铃薯葡萄糖(PDA)培养基
马铃薯200克(g)，葡萄糖20g，磷酸二氢钾(KH2P04)lg，硫酸镁(MgS04)
0. 5、，蒸馏水定容到1000毫升(ml)， pH自然。将新鲜的马铃薯去皮，切成小 块，立即放入水中以免被氧化。煮沸30分钟(min),经纱布过滤，加入葡萄糖 等成分溶解，并加蒸馏水定容至lOOOml，分装在三角瓶中，121'C， 1.05千克 /平方厘米(kg/cm2)，高压灭菌30 min，冷却至室温，加入0.25克/毫升(g/ml) 链霉素至其终浓度为100微克/毫升(照/ml)，备用。
二、 HDF1菌株获得及研究过程
1、 HDF1的分离
HDF1分离自红豆杉树皮。将野外采集的树皮无菌带回实验室中，用无菌小 刀切成lcmxlcm大小，三点栽植于水琼脂培养基上，待长出白色菌丝后，保留。 经过发酵、薄层层析和高效液相色谱分析证明HDF1具有产生紫杉醇的能力。
2、 菌株个体培养特征研究方法.
采用载玻片培养法。先将一个内置载玻片(其上放一带方口的滤纸)的平 板装置，121。C高温灭菌。然后，无菌挑取PDA琼脂平板上的菌丝连同菌(稍 带些培养基)涂于上述装置的滤纸上，28'C培养，隔日盖上盖玻片。培养4天 后在显微镜下定点定时观察，同时进行显微测量。
3、 菌落群体特征研究方法将保存的菌种用PDA培养塞经活化后点植在PDA培养基琼脂平板上，28'C 条件下，倒置培养一定时间进行定点定时观察菌落形态变化并测量菌落直径， 记录群体形态特征。 4、菌株rDNA部分序列研究方法
18srDNA扩增引物序列 Al (弓l物名称)5，國TCGGGCGATGTTCTTTTTCTG國3， A2 (引物名称)5'画GAGCCATTCAATCGGTAGTAGC-3， ITS扩增引物序列
Bl (引物名称)5，-TAGGTGAACCTGCGGAAGGA-3， B2 (引物名称)5，-TTCCCTGTTCACTCGCCGTTACT國3，
应用特异性引物Al和A2扩增紫杉醇产生菌HDF1的18srDNA片段。Bl 和B2扩增紫杉醇产生菌HDF1的ITS片段。
扩增反应体系如下DNA模板lpl约100纳克(ng), 2.5毫摩尔/升 (mmol/1)碱基名称(dNTP) 2pl， 10 x缓冲液2.5^1， 10百万分摩尔(pmo1/1) 引物2jil， Taq(DNA聚合酶)酶0.2^1 ( 5 U/pl )，最后以去离子水补足至25fil。 扩增反应条件如下具体条件如下94 。C预变性5 min， 94'C变性45sec， 55°C 退火45sec， 72'C延伸45sec，共完成30个循环，最后72'C延伸5min。
扩增后的片段与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，测序即可。
序列表:
tgagccetttc犯tcggtagtagcgacgggcggtgtgtacaaaggtcagggacgt犯tcaa60
cgcatgctgatgacacgcgcttactaggca^ttcctcgttgattgcaatgc120
tttatccccagc3cgacagagtttaacaagattacccaattctttcgaac180
actcgttggctctgtcagtgtagcgcgcgtgcggccc，￡lC￡Ltct￡L8Lgggca/tcacaga240
cctgttattgcctcaaacttccatcaacttgagttg￡Lta<gtctctctaag肌gccggcga300
cc犯ccaa^gttagcctggctatttagcagagtaaggtctcgctcgttatcgcaattasg360
3CCCC3Cg犯Ct3￡Lgaa>Cggccatgcacceiccacctga朋aatc犯gaaa42Q
g3gctctc肌tctgtcaatccttatttcatctggacctggtgagtttccccgtgttgagt480
c犯attaagccgcaggctccacgcctggtggtgaccttccgtcaatttcttta^gtttca540
gccttgcgaccataatccccCC3g犯CCC3aaaactttgatttctcgtaaggtgccg鄉600
cccga 625
gatttaggtgaacctgcggaaggatcattac^Lcaaatatgaaggcgggctggaacctctc60ggggttacag ccttgctg犯tgggttcgcc caccactaggcaaattaata attacaacttcagcga^tg cg3taagtsggcacattgcg ccctttggtaaagctttgct tggtgttgggattggcagcc ggcctactgggtctagcatc catt犯gcctctg犯cttaa gca^atc肌tggcgcgtg犯cagggaa犯t
tta/ttCELCCC ttgtcttttgacaaacataa accttttgtatcaacaacgg atctcttggttgtgaattgc etgaattcagtttcca犯ggg catgcctgttcgtcttgtct ctagctttgctttcggagcg cagcacaagtttttttcaac ttttgacctc
620
cgteicttctt gtttccttgg 120attgcaatca gcgtcagtaa 180tctggcatcg atgaagaacg 240gaatcatcga atctttgaac 300cgagcgtcat ttgtaccctc 360tggagactcg cctt犯agta 420
CgC￡LCtctCt ￡LtC￡LgC￡Let￡Lg 480
ggatcaggta gggatacccg 540acagggattg ccctagtaac 620
权利要求
1.一种可产生紫杉醇的链格孢属真菌，其特征是该真菌分离自红豆杉树皮，将野外采集的树皮无菌带回实验室中，用无菌小刀切成块，三点栽植于水琼脂培养基上，待长出白色菌丝后，保留，经过发酵、薄层层析和高效液相色谱分析证明其具有产生紫杉醇的能力，该酵母保藏于CCTCC，保藏号M207165。
2. 权利要求1所述的可产生紫杉醇的链格孢属真菌，其特征是所述的菌种的扩增反应体系如下DNA模板lpl约100纳克(ng)， 2.5毫摩尔/升(mmo1/1)碱基名称(dNTP) 2^1， 10 x缓冲液2.5jd， 10百万分摩尔(pmo1/1)引物2jU, Taq(DNA聚合酶)酶0.2^1 ( 5 U/pl )，最后以去离子水补足至25^1，扩增反应条件如下具体条件如下94'C预变性5min， 94"C变性45sec， 55°C退火45sec， 72。C延伸45sec，共完成30个循环，最后72。C延伸5min。
3.根据权要求1或2所述的可产生紫杉醇的链格孢属真菌，其特征是所述的菌株rDNA部分序列18srDNA扩增引物序列Al (引物名称)5'-TCGGGCGATGTTCTTTTTCTG画3，A2 (引物名称)5，-GAGCCATTCAATCGGTAGTAGC-3，ITS扩增引物序列Bl (引物名称)5，TAGGTGAACCTGCGGAAGGA-3，B2 (引物名称)5，-TTCCCTGTTCACTCGCCGTTACT-3，应用特异性引物Al和A2扩增紫杉醇产生菌HDF1的18srDNA片段。Bl和B2扩增紫杉醇产生菌HDF1的ITS片段。
全文摘要
可产生紫杉醇的链格孢属真菌，作为一种作用机制独特的抗癌新药，自问世以来一直受到人们的重视，但由于紫杉醇在天然红豆杉中的含量很低，加上红豆杉资源有限，因此限制了紫杉醇的进一步开发应用。本发明的组成包括该真菌分离自红豆杉树皮，将野外采集的树皮无菌带回实验室中，用无菌小刀切成块，三点栽植于水琼脂培养基上，待长出白色菌丝后，保留，经过发酵、薄层层析和高效液相色谱分析证明其具有产生紫杉醇的能力，该酵母保藏于CCTCC，保藏号M 207165。本发明作为抗癌新药原料。
文档编号C12R1/645GK101676383SQ20081013712
公开日2010年3月24日 申请日期2008年9月16日 优先权日2008年9月16日
发明者凌宏志, 刚 宋, 平文祥, 葛菁萍, 丹 赵 申请人:黑龙江大学