专利名称：一株高产孢环链拟青霉菌株及其筛选与应用方法
技术领域：
本发明涉及微生物，具体而言，涉及环链拟青霉菌抹孢子形成或分离的方 法，还涉及其应用方法。
背景技术：
近年来，利用昆虫病原真菌来防治农作物的虫害技术得到较快的发展，
在中国专利申请件中，就有200710031511, X号"一种玫烟色拟青霉菌菌抹 及其应用"、200710059835.4号"防治线虫危害的生物有机肥制备方法及 用途，，、200710117818. 1号"一抹淡紫拟青霉菌与应用"、200810029158. 6 号"一种爪哇拟青霉菌4朱及其应用，，、200810220004.5号"绿僵菌素与玫 烟色拟青霉真菌混配的杀虫剂及其制备方法"等属于釆用真菌防治虫害的生 物技术。目前生物农药的防治受到人们的关注。
对十字花科蔬菜害虫小菜蛾、枒虫等的防治，多采用传统的化学防治方 法。J不链4以青霍户aec27(9迈yces cafe/z/s/ww/afzAy Z. Q. Liang是一种重要 的昆虫病原真菌，可寄生很多鳞翅目类昆虫；在我国的地理分布也较广阔， 这种病原真菌对森林害虫的调节具有重要意义。同时作为一种活体生物农 药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新作用机理、对环境无污染、无残留的 特征，可以用来防治菜青虫、虫牙虫和小菜蛾等害虫，在温室害虫的生物防治 上有纟艮好的应用前景。开发这类生物杀虫剂意义重大。
发明内容
本发明的目的是[l]提供一种环链拟青霉菌菌株；[2]为生产上述所需 高产孢、高致病力环链拟青霉菌菌抹提供一种简便的筛选方法；[3]提供上 述环链拟青霉菌菌林的应用方法。
本发明提供的环链拟青霉菌菌抹是从云南省昆明市西山公园的罹病昆虫上分离获得；该菌才朱为/^ec/7o;z7/ces c"e/7/'a/w〃/a"s GZUIFR-XS. 1，菌抹 保藏号为CCTCCNo: M209120, 2009年6月8日在中国典型培养物保藏中 心保藏。所述的环链拟青霉户ae"7。yz7/ces cafe/2/a/7/2w/"u51 Z. Q. Liang菌 林GZUIFR-XS. 1,属丝孢目、拟青霉属。
所述环链拟青霉在查氏培养基上，25。C下培养14天，菌落白色，隆起， 长绒毛状，延长培养产生密集型孢梗束；背面白色；分生孢子梗短，长约10~ 15 pm，其上着生有由2~4个瓶放组成的轮生体，瓶放基部椭圆形或柱状 膨大，向上突然变细，7~11 x 1. 3~3 |im，颈部长约2 jLim。分生孢子透 明，光滑，椭圆形，近^^形或柱状，2-5 x 1.3-2 jum,形成叠瓦状排列 的斜链或成环状。
本发明提供的筛选方法是将环链拟青霉菌抹接种于PDA培养基上，26 C下恒温培养14d,用灭菌的打孔器切取带菌的琼脂片，并将其置于装有玻 璃珠的30mL 0. 1%吐温-80的无菌水中，振荡30 min,待分生孢子完全被打 散均匀后，用无菌脱脂纱布过滤，获得孢子悬浮液。
本发明提供的应用方法是将上述环链拟青霉菌孢子悬浮液用喷雾法或 浸液法喷洒于十字花科蔬菜上，用于菜青虫、小菜蛾、虫牙虫等害虫的生物防 治。所述菌抹的菌落产生密集型孢梗束，其菌抹由于产孢量大、致病力高， 是一种有效的杀虫剂。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本菌林从云南省昆 明市西山公园的罹病虫体上获得，为中国本土的菌林，并非从国外引进，能 适应本地的自然环境。该环链拟青霉菌是一种昆虫病原真菌，作为一种活体 生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新作用机理、对环境无污染、无 残留，可以用作防治菜青虫、对虫和小菜蛾等害虫，在温室害虫的生物防治 上有很好的应用前景。该环链拟青霉产孢量大、致病力强，其菌落产生肉眼 可见的密集型孢梗束，这为生产菌林的选择提供了 一种简便的篩选方法。
图l为菌抹的形态示意图，图2为表面孢梗束密集型菌落，图3为表面 孢梗束稀疏型菌落，图4为粉质型菌落，图5为致病力测定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。 实施例l菌林的分离鉴定 1.实验材料与方法 1.1材料来源
在云南省昆明市西山公园、贵州省贵阳市森林公园、贵州省遵义凤凰 山、辽宁沈阳的罹病昆虫上以及北京的土Jt裏。
马丁氏培养基KH2P04 lg， MgS04. 7H20 0. 5g ,蛋白胨5g,葡萄糖10g, 琼脂 18g，孟加拉红1/300 ml。灭菌条件121°C， 30min。用前待温度冷 却在40。C左右，加青霉素20 /mg,链霉素40 Mg /mg。
查氏培养基NaN03 2g,K2HPOag， KCL 0. 5g, MgS04 0. 5g， FeS04 0. Olg， 蔗糖30g,琼脂17-20g,水1000ml, pH自然。灭菌条件121°C, 30min。 1.2菌4朱的分离纯化
对罹病昆虫进行表面消毒，挑取白色孢子粉于制备好的马丁氏培^ini中， 倒置于25 C温箱中培养；对采集的土样采用稀释分离法进行分离，倒置于 25 C温箱中培养。待菌落长出后转移到新的培^进行纯化，共获得16抹 分离林，代号分别为GZUIFR-XS. 1, GZUIFR-GZZY. 7， GZUIFR-SL. 7， GZUIFR-XS. 2， GZUIFR-XS. 7， GZUIFR-SL. 8, GZUIFR-Sh2, GZUIFR-SL. 3， GZUIFR-ML. 3, GZUIFR-XS. 4, GZUIFR-GZSL. 27， GZUIFR-468. 10, GZUIFR-8. 02， GZUIFR-XS. 6， GZUIFR-ML. 4, GZUIFR-XSXY. 4。
1. 3分离林的鉴定
把16抹待鉴定菌株移入查氏培养基中，采用点中法接种，倒置放于25C温箱中培养7天。然后釆用胶带粘帖法进行标本片的制作并采用Motic 数码显微镜进行显微摄影，描述记载这些菌株的菌落特征、微观的个体形态 特征及一些生物学特性进行鉴定。
2.实一验结果
2.1菌抹的形态描述
通过经典形态学鉴定，这16个分离抹均为环链拟青霉如图l所示，具体 描述如下
在查氏培养基上，25。C下培养14天，菌落白色，隆起，长绒毛状，延长 培养产生孢梗束或无；背面白色；分生孢子梗短，长约10-15 /am,其上着 生有由2~4个瓶放组成的轮生体，瓶梗基部椭圆形或柱状膨大，向上突然 变细，7~11 x l. 3~3 jum,颈部长约2 pm。分生孢子透明，光滑，椭圆 形，近球形或柱状，2~5 xi. 3~2 jum，形成叠瓦状排列的斜链或成环状。 2.2菌落形态特征差异
环链拟青霉不同菌林在查氏培养基上，其菌落特征有明显差异。其菌落 形态大致可归纳为三大类表面孢梗束密集型菌落，如图2,表面孢梗束稀疏型菌落，如图3，粉质型菌落，如图4。
实施例2环链拟青霉不同菌林产孢量的测定
产孢量是除了杀虫效果外，开发真菌杀虫剂考虑的重要因素。若产孢量 小，即使杀虫效果非常好，也无法应用于大生产。为开发其作为真菌杀虫剂， 对环链拟青霉不同菌抹的产孢量进行比较、优选。
1.实验材料与方法
1.1实验菌抹与培养基
实例1中分离鉴定的16个环链拟青霉菌抹。PDA培养基马铃薯200g切块，用水煮沸30min，加葡萄糖20g，琼脂 20g,水补足1000ml， pH自然。灭菌条件121。C, 30min。 1.2孢子悬浮液的制备
将所试菌4朱4妄种于PDA培养基上，26C恒温培养14d，用灭菌的打
孔器(直径9 cm)切取带菌的琼脂片，并将其置于装有玻璃珠的30mL 0.1
%吐温-80的无菌水中，振荡30 min，待分生孢子完全被打散均匀后，用无
菌脱脂纱布过滤，获得孢子悬浮液。然后用血球计数板测定孢子浓度，每菌
林设三个重复。计算每l CII^的产孢量。
2.实^验结果
实验结果列于表L
表l环链拟青霉不同菌抹的产孢量比较
菌号 产孢量(个/cm2)
GZUIFR-XS. 14. 91 x 108
GZUIFR-GZZY. 74.17 x if)8
GZUIFR-SL. 74. 17 x 108
GZUIFR-XS.22. 83 x 108
GZUIFR-XS. 72. 53 x If)8
GZUIFR-SL. 82. 53x108
GZUIFR-Sh22. 21 x 108
GZUIFR-SL. 32. 08 x io8
GZUIFR-ML. 31. 93 x 10s
GZUIFR-XS. 41. 74 x 108
GZUIFR-GZSL. 271. 34 x 108
GZUIFR-468.101. 27 x io8
GZUIFR-8. 021. 04 x 108
GZUIFR-XS. 60. 89 x 10s
GZUIFR-ML. 40. 89xl08
GZUIFR-XSXY. 40. 45xl08
从表1看出，不同菌林的环链拟青霉产孢量差别非常大。环链拟青霉GZUIFR-XS. 1，环链拟青霉GZUIFR-SL. 7和环链拟青霉GZUIFR-GZZY. 7三个 菌抹产孢量都达到了 4xl07mL以上，其中产孢量最高的环链拟青霉 GZUIFR-XS. 1菌抹已接近5x107 cm2，它们比产孢量最低的环链拟青霉 GZUIFR-XSXY. 4菌抹(0. 45 x 107 cm2)高出11倍之多。
综合实施例1和实施例2，环链拟青霉不同菌落形态和产孢量的平均分 析表明，菌落产孢梗束密集型的产孢量平均值为2. 51 x 1()8个/cm2;'菌落孢梗 束稀疏型的产孢平均值为1.97xl()8个/cm2;菌落粉质型的产孢量平均值为 1.56 x 1()8个/cm2。从这些数据可看出，菌落产孢梗束密集型，其产孢量最大； 菌落孢梗束稀疏型次之；菌落粉质型的为最少。
实施例3环链拟青霉不同菌抹对小菜蛾的致病性测定
1.实验材料与方法
1.1实验菌林与虫体来源
实例1中分离鉴定的16个环链拟青霉菌抹。小菜蛾尸/""//<3 L.幼虫为贵州省农科院李风良老师提供。用试验田中种植的甘蓝祠喂。 1. 2孢子悬浮液的制备
将实施例2中的孢子悬浮液均配成浓度为lxl()7个/mL,进行供试菌林 对供试虫小菜蛾的致病力测定。 1.3对供试虫小菜蛾的致病力
由于小菜蛾幼虫虫体较小，用喷雾方法不能使菌液均匀的喷于虫体表 面，因此本试^r采用浸液法。将小菜蛾幼虫分别浸于配好的孢子悬浮液中。 每浓度处理15头虫，浸渍10-20s后》tA罐头瓶中，同时用加吐温-80的无 菌水处理小菜蛾作为对照。用保鲜膜将瓶口封好，在薄膜上扎小孔通气，置 于"。C恒温培养箱培养，保持90。/。以上的相对湿度，并饲喂新鲜叶片。每曰 检查小菜蛾的死亡虫数，挑出死虫置于灭菌的9cm培^jni中保湿继续培养， 最后镜检，根据死虫上的产孢结构确证是否为所试菌感染。该试验连续进行直至幼虫化蛹成虫结束，周期约2周左右。 2.实—睑结果 2. 1感染症状表现
d 、菜蛾幼虫受所试环链拟青霉不同菌林感染后的症状表现相似。 一般2 d左右食欲减退，行动开始，感染后，不吃食，行动迟緩，死亡高峰期在处 理后的第4 ~ 7d，部分拟青霉菌抹致病的死亡高峰期是在处理后的3 ~ 5天， 死亡时虫体颜色不发生明显变化。死虫25匸下保湿培养1 2 d后虫体长出少 量白色菌丝，1~2 d后菌丝由较为疏松逐渐变密覆盖虫体，虫体僵硬，随 后虫体被白色菌丝所覆盖，粘片显微观察，白色菌丝产生大量拟青霉产孢结 构和分生孢子。
2.2环链拟青霉不同菌林对小菜蛾的致病性差异
环链拟青霉是重要的昆虫病原真菌，为了更好的开发利用这一资源，对 上述分离的16个环链拟青霉不同菌林对小菜蛾的致病力进行了测定。结果表 明它们对小菜蛾的致病性表现出很大差异。如在本试验条件下，GZUIFR-XS. 1 GZUIFR-SL. 7, GZUIFR-XS. 2和GZUIFR-SL. 8对小菜蛾的致病性最好;而来自 土壤的BJ8. 02菌抹最差。
综上所述，从环链拟青霉不同菌抹的菌落形态特征与对小菜蛾的致病性 数据进行分析，菌落产孢梗束密集型的菌抹致病率平均值为83.70%;菌落 产孢梗束稀疏型的为79. 07 o/。；菌落粉质型的仅为33. 34 %。这些数据可看出， 菌落表面孢梗束密集型的菌林对小菜蛾致病效果最好；菌落粉质型的最少。
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述 实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、筒化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护 范围之内。
权利要求
1一株高产孢环链拟青霉菌株，其特征在于该菌株是从云南省昆明市西山公园的罹病昆虫上分离获得；该菌株为Paecilomycescateniannulatus GZUIFR-XS.1，菌株保藏号为CCTCC NoM209120，2009年6月8日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述的环链拟青霉Paecilomyces cateniannulatus Z.Q.Liang菌株GZUIFR-XS.1，属丝孢目、拟青霉属。
2.如权利要求1所述的环链拟青霉菌林，其特征在于该菌株在查氏培 养基上，25。C下培养14天，菌落白色，隆起，长绒毛状，延长培养产生 密集型孢梗束；背面白色；分生孢子梗短，长约10-15 iim,其上着生 有由2~4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部椭圓形或柱状膨大，向上突然 变细，7~11 x 1.3~3 ium，颈部长约2 ]um。分生孢子透明，光滑， 椭圆形，近5求形或柱状，2~5 xl. 3~2 pm,形成叠瓦状排列的斜链或 成环状。
3.筛选权利要求1所述的环链拟青霉菌林的方法，其特征是将环链拟 青霉菌林接种于PDA培养基上，26 C下恒温培养14d,用灭菌的打孔 器切取带菌的琼脂片，并将其置于装有玻璃珠的30mL 0. 1%吐温-80的 无菌水中，振荡30 min,待分生孢子完全被打散均匀后，用无菌脱脂纱 布过滤，获得孢子悬浮液。
4.选权利要求1所述的环链拟青霉菌林的应用方法，其特征在于将上 述环链拟青霉菌孢子悬浮液用喷雾法或浸液法喷洒于十字花科蔬菜上， 用于害虫菜青虫、小菜蛾、坊虫的生物防治。
全文摘要
本发明公开了一株高产孢环链拟青霉菌株，该菌株是从云南省昆明市西山公园的罹病昆虫上分离获得；该菌株为Paecilomyces cateniannulatus GZUIFR-XS.1，菌株保藏号为CCTCC NoM209120，2009年6月8日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述的环链拟青霉Paecilomyces cateniannulatus Z.Q.Liang菌株GZUIFR-XS.1，属丝孢目、拟青霉属。本菌株为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境，是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，可以用作防治菜青虫、蚜虫和小菜蛾等害虫，对环境无污染、无残留，在害虫的生物防治上有很好的应用前景。该环链拟青霉产孢量大、致病力强，其菌落产生肉眼可见的密集型孢梗束，这为生产菌株的选择提供了一种简便的筛选方法。
文档编号C12R1/79GK101597574SQ20091010264
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者文 杜, 梁宗琦, 梁建东, 韩燕峰 申请人:贵州大学