专利名称：：利用具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系提高家蚕杆状病毒系统表达外源基因效率的方法
技术领域：
：本发明涉及特殊用途家蚕新品种选育及利用基因工程技术表达外源基因，确切地说以育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系(高发生率和孵化率、后代全雌、蛹体大、生命力强)为宿主，有效提高利用杆状病毒系统表达外源基因效率的一种方法。
背景技术：
：利用生物反应器表达外源基因来生产昂贵的医用活性物质是目前生物技术工程的研究热点，具有巨大的经济效益和社会效益，市场前景广阔。昆虫作为生物反应器表达外源基因能够直接在生物体内形成具有活性的表达产物，家蚕属于鳞翅目昆虫，是利用基因工程技术生产活性物质的理想生物反应器。自日本学者前田进1985年成功利用家蚕杆状病毒表达系统成功表达外源基因以来，至今已有人与小鼠介素3、介素4(IL-3,IL-4)，人免疫缺陷病毒(HIV-I即艾滋病毒)的核心蛋白(gsg)，人乙型肝炎病毒表面抗原(HBV52-sAg)，人丙型肝炎抗原，人血小板因子IV(HPF4)等数百种外源基因在家蚕中表达。由于我国蚕业有着悠久的历史，大规模饲养推广体系健全，这为家蚕作为生物反应器表达外源基因产业的发展提供了很大空间。家蚕作为生物反应器用杆状病毒表达系统表达外源基因过程中，需要多情况下是以蛹材料。因此，现行品种需要将茧子削开、蛹倒出，往往造成蛹体受伤，给大规模操作带来不便，也不利于无菌消毒。若能选择裸蛹品种(不吐丝，直接化蛹)，就为家蚕表达外源基因提供了便利。另外，同品种的雌雄个体外源基因的表达量也不同，刘金明等(中国兽医寄生虫病，2005，13(1):57)以重组病毒rSjl4NPV为感染病毒，分别在不同的家蚕品种秋丰X白玉、871X872中表达脂肪酸结合蛋白(Sjl4)，通过纯化蛋白的产量比较，同品种的雌蚕表达量高于雄蚕，纯化的蛋白表达量分别为871X872雌蚕表达量5.09mg/条蚕、雄蚕4.86mg/条蚕(提高4.73%);秋丰X白玉雌蚕5.04mg/条蚕、雄蚕4.72mg/条蚕(提高6.78%)。因此，若能育成兼具裸蛹性状、后代全部为雌性个体的品种，以其为宿主表达外源基因，将有效提高外源基因表达量和表达效率。雌蚕无性克隆不同于有性生殖，是卵细胞在未受精的情况下直接发育成雌性个体的现象。在自然状态下，无性克隆的发生率很低，仅为0.004%，而利用性别控制技术，通过对卵细胞生活周期中染色体的调控，改变细胞发生的自然过程，不仅能达到单一雌性孵化的目的，也可提高其发生率。在卵细胞的生活周期中，减数分裂是配子形成的必要阶段，包括二次分裂过程。第一次分裂使染色体数目减半，第二次分裂形成4个单倍体(n)的配子。在有性生殖方式下，卵子与精子通过受精形成二倍体(2n),从而保证了亲代与子代间染色体数目的恒定性。而利用性别控制技术可抑制第一次分裂，卵细胞不经过染色体数目减半直接进入第二次分裂，成为二倍体分裂核(2n)，这样发育成的个体持有与母体完全相同的染色体组，连续以此方式继，即为"雌蚕无性克隆系"。俄罗斯科学院Astaurov和Strunnikov院士等通过30多年的研究，建立了欧洲一化性品种简单有效的温汤处理诱导雌蚕无性克隆的方法。我们从1996年开始，以我国二化性蚕品种为材料进行雌蚕无性克隆系的研究工作。首先针对我国二化性品种的特点，优化了温汤处理的技术条件(王永强等，浙江农业科学，1997(增刊)6263)，首次阐明了雌蚕无性克隆发生率性状的遗传规律(王永强等，蚕业科学，2004，30(2):133136)，育成了高发生率和孵化率、茧丝质性状优良的二化性中、日系雌蚕无性克隆系(原种)，并在育种和蚕种生产上得到了应用，以其为母本，经济性状优良的限性卵色品种为父本，建立了"单交制种"的新模式，能有效降低蚕种生产成本(王永强等，蚕业科学，2007，33(2):335339;何克荣等，2007，33(3):462465)。雌蚕无性克隆系除了在家蚕育种和蚕种生产上具有很好的利用价值外，由于其后代为全雌、蛹体相对较大、基因型完全一致等特点，在其它领域也将具有开发利用价值，但还没有这方面的研究报道。本发明为提高家蚕杆状病毒系统表达外源基因的效率，针对性的选育适合基因工程操作具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系(高发生率和孵化率、后代全雌、蛹体大、生命力强)作为外源基因表达的宿主。
发明内容本发明的一个目的是提供以育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系(高发生率和孵化率、后代全雌、蛹体大、生命力强)为宿主，有效提高利用杆状病毒系统表达外源基因效率的一种方法。本发明的方法以常规二性化杂交种为无性克隆系选育的素材，应用温汤处理技术进行雌蚕无性克隆继代，选择优良个体留种，经多年多代无性克隆选育，育成高发生率和孵化率、后代全雌、蛹体大、生命力强的杂交种雌蚕无性克隆系；将杂交种雌蚕无性克隆系与带M/基因，不吐丝结茧的裸蛹品种雄蚕杂交，育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系；以具有这种裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系为宿主，利用家蚕杆状病毒系统在表达外源基因。具体说来，本发明采用的技术方案如下-1、以我国生产上推广应用的二化性杂交种为雌蚕无性克隆系选育的素材，应用优化的二化性品种温汤处理技术条件，各品种处女蛾的未受精卵用温汤处理进行雌蚕无性克隆继代，14低世代混合蚁量育，选择发育正常、蛹体大的个体留种；5代以后的中后世代蛾区育，淘汰发育迟缓、畸形蚕等不良个体较多的蛾区，选择发生率和孵化率高、蛹体大、生命力强的蛾区留种，每个蛾区选优良个体进行无性克隆继代。经多年多代无性克隆选育，育成高发生率和孵化率、后代全雌、蛹体大、生命力强的杂交种雌蚕无性克隆系；2、杂交种雌蚕无性克隆系用温汤处理的方法进行无性克隆继代，后代采用蛾区育；同时将杂交种雌蚕无性克隆系分别与裸蛹品种雄蚕(带M/基因，不吐丝结茧)杂交，根据裸蛹M/基因的表现型，从后代中选择具有裸蛹性状的雄蚕与杂交种雌蚕无性克隆系进行回交，从回交后代中再选择具有裸蛹性状的雄蚕与杂交种雌蚕无性克隆系进行回交，回交3次，再经雌蚕无性克隆继代选择，育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系；3、以育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系为宿主，利用家蚕杆状病毒系统在蛹期表达口蹄疫空衣壳抗原P1-2A3C，以相同条件下饲养的现行蚕品种秋丰X白玉(雌、雄各半的品种)为对照，通过蛹体重、蛹血量的测定及用ELISA方法测定表达产物的OD492值，进行表达量和效率的比较分析。本发明有益的效果1、以本发明育成适合基因工程操作具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系(高发生率和孵化率、全雌、蛹体大、生命力强)为宿主，利用家蚕杆状病毒系统表达外源基因，其后代全部为裸蛹，不结茧，减少了削茧、倒蛹等工作，减少蛹体受伤，便于大规模操作，提高工作效率；2、以本发明育成的杂交种雌蚕无性克隆系为宿主，由于后代全部为雌性个体、蛹体大，可有效提高外源基因的表达量和效率。图l为本发明的技术流程图。具体实施例方式现结合以下实施例更加详细地描述本发明的专用型家蚕杂交种选育方法。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为是对本发明的范围和实质的限制。实施例l:育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系通过我们对雌蚕无性克隆发生率性状的遗传规律研究(王永强等，蚕业科学，2004，30(2):133136)，表明该性状由1对以上的多基因所控制，符合加性-显性遗传模型，主要受加性效应控制，通过累代选择可提高其发生率和孵化率水平。因此，以我国生产上推广应用的二化性杂交种白玉x秋丰、明丰X春玉、学613X春日为雌蚕无性克隆系选育的素材，应用优化的二化性品种温汤处理技术条件(诱导温度4446-C、浸渍时间1418min)，各品种取20蛾处女蛾的未受精卵用温汤处理进行雌蚕无性克隆继代，14低世代混合蚁量育，选择发育正常、蛹体大的个体留种；5代以后的中后世代蛾区育，每个品种饲养1520蛾，淘汰发育迟缓、畸形蚕等不良个体较多的蛾区，选择发生率和孵化率高、蛹体大、生命力强的58个蛾区留种，每个蛾区选1015个优良个体进行无性克隆继代。从选育过程来看，9代之前发育欠整齐、畸形蚕较多、生命力较差，9代后性状有了明显的变化，生命力与现行品种相近。经10代以上的无性克隆选育，育成了发生率和孵化率分别达90%、80%以上、后代全雌、蛹体大、生命力强的3个杂交种雌蚕无性克隆系雌蚕IOI、雌蚕102、雌蚕103;2、杂交种雌蚕无性克隆系用温汤处理的方法进行无性克隆继代，后代采用蛾区育，选育规模和方法同上；同时将3个杂交种雌蚕无性克隆系分别与裸蛹品种雄蚕(带M/基因，不吐丝结茧)杂交，根据裸蛹A^基因的表现型，从后代中选择具有裸蛹性状的雄蚕与杂交种雌蚕无性克隆系进行回交，从回交后代中再选择具有裸蛹性状的雄蚕与杂交种雌蚕无性克隆系进行回交，回交3次，育成3个具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系雌蚕IOIN、雌蚕102N、雌蚕103N，主要经济性状与雌蚕101、雌蚕102、雌蚕103相仿(至2009年春期已分别选育至14、13、13代)。利用家蚕杆状病毒系统表达外源基因，需要将含外源基因的病毒液注射到蛹体内，因此，具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系更适于基因工程操作，不用削茧、倒蛹，减少蛹体受伤，将有效提高表达效率。总之，以生产推广应用的白玉X秋丰、明丰X春玉、学613X春日3对杂交种为素材，经无性克隆的累代选择和裸蛹基因M/的导入，经多年多代选育，育成了发生率和孵化率分别达90%、80%以上、后代全雌、蛹体大、生命力强的3个具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系:雌蚕101N、雌蚕102N、雌蚕103N，2009年春期饲养的主要性状见表1实施例2:以杂交种雌蚕无性克隆系"雌蚕102N"为宿主表达口蹄疫空衣壳抗原P1-2A3C以育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系"雌蚕102N"为宿主，利用家蚕杆状病毒系统在蛹期(上蔟后69d)表达口蹄疫空衣壳抗原Pl-2A3C，以现行蚕品种秋丰X白玉(雌、雄各半的品种)为对照，进行了表达量和效率的比较分析。试验和对照种各设3个重复区，每个重复区注射6头蛹。在相同条件下进行饲养，雌蚕102N个体的平均蛹重为1.75g，比对照的1.45g增加20.69%;平均蛹血量U2ml，比对照的0.833ml增加34.45y。。注射外源基因后的蚕蛹在25t:下保护45d，让重组病毒充分繁殖，收集蚕蛹冷冻干燥、活性物质分离纯化，用ELISA方法进行了表达量测定，雌蚕102N所表达的产物平均OD492值为0.520，秋丰X白玉为0.500，提高4.00%。据ELISA检测原理，其OD492值与抗原(蛋白表达量)成线性关系，且平均蛹血量比对照种增加34.45%，平均OD492值比对照种提高4.00%,因此，以雌蚕102N为宿主蛋白表达量较以对照秋丰X白玉将增加34.45%以上，以具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系为宿主提高家蚕杆状病毒系统表达外源基因效率是一种切实可行的方法。实验结果见表2。10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.利用具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系提高家蚕杆状病毒系统表达外源基因效率的方法，其特征在于以常规二性化杂交种为无性克隆系选育的素材，应用温汤处理技术进行雌蚕无性克隆继代，选择优良个体留种，经多年多代无性克隆选育，育成高发生率和孵化率、后代全雌、蛹体大、生命力强的杂交种雌蚕无性克隆系；将杂交种雌蚕无性克隆系与带Nd基因，不吐丝结茧的裸蛹品种雄蚕杂交，育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系；以具有这种裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系为宿主，利用家蚕杆状病毒系统表达外源基因。2.如权利要求1所述的方法，具体步骤为-(1)、以我国生产上推广应用的二化性杂交种为雌蚕无性克隆系选育的素材，应用优化的二化性品种温汤处理技术条件，各品种取20蛾处女蛾的未受精卵用温汤处理进行雌蚕无性克隆继代，14低世代混合蚁量育，选择发育正常、蛹体大的个体留种；5代以后的中后世代蛾区育，每个品种饲养1520蛾，淘汰发育迟缓、畸形蚕等不良个体较多的蛾区，选择发生率和孵化率高、蛹体大、生命力强的58个蛾区留种，每个蛾区选1015个优良个体进行无性克隆继代经IO代以上的无性克隆选育，育成了发生率和孵化率分别达90%、80%以上、后代全雌、蛹体大、生命力强的3个杂交种雌蚕无性克隆系雌蚕IOI、雌蚕102、雌蚕103;(2)、杂交种雌蚕无性克隆系用温汤处理的方法进行无性克隆继代，后代采用蛾区育，选育规模和方法同上；同时将3个杂交种雌蚕无性克隆系分别与带A^基因，不吐丝结茧的裸蛹品种雄蚕杂交，根据裸蛹M/基因的表现型，从后代中选择具有裸蛹性状的雄蚕与杂交种雌蚕无性克隆系进行回交，从回交后代中再选择具有裸蛹性状的雄蚕与杂交种雌蚕无性克隆系进行回交，回交3次，育成3个具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系雌蚕101N、雌蚕102N、雌蚕103N;(3)、以育成具有裸蛹性状的杂交种雌蚕无性克隆系"雌蚕102N"为宿主，利用家蚕杆状病毒系统在上蔟后69d的蛹期表达外源基因。3.如权利要求2所述的方法，其中优化的二化性品种温汤处理技术条件为诱导温度4446。C、浸渍时间1418min。4.如权利要求l-3任一项所述的方法，其中所述的二性化杂交种是白玉X秋丰、明丰X春玉、学613X春日。全文摘要本发明公开了一种以具有裸蛹性状、适于基因工程操作的杂交种雌蚕无性克隆系(后代全部为雌性)为宿主，有效提高利用杆状病毒系统表达外源基因效率的方法。它以生产上推广应用的家蚕杂交种为素材，利用雌蚕无性克隆技术，选择蛹体大、生命力强、发生率和孵化率高的个体留种继代，经多年多代个体和蛾区选育，育成了无性克隆发生率和孵化率分别达90％和80％以上、蛹体大、生命力强的杂交种雌蚕无性克隆系；在此基础上，与裸蛹品种(带Nd基因，不吐丝结茧)杂交，通过回交、标记基因选择等方法，使杂交种雌蚕无性克隆系在保持原有性状的同时，兼具裸蛹性状，更适于基因工作操作，不用削茧、倒蛹，有效提高了外源基因的表达效率。文档编号C12N15/866GK101638667SQ20091010235公开日2010年2月3日申请日期2009年9月1日优先权日2009年9月1日发明者农丁,何秀玲,刘培刚,周文林,姚陆松,孟智启,张金卫,柳新菊,王永强,祝新荣,胡桂燕申请人:浙江省农业科学院