专利名称：提高植物抗性和诱导植物防御反应的蛋白质及其基因、应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自真菌的具有多于20个氨基酸的肽、编码该肽段的核苷酸序列及其应用的领域，特别涉及一种能提高植物抗性和诱导植物防御反应来自于极细链格孢菌 (Alternaria tenuissima)的蛋白质及编码该蛋白质的核苷酸序列及其应用。
背景技术：
烟草花叶病是由烟草花叶病毒引起的病毒病，对烟草生产危害性极大。自苗期至收获期均能发病，田间株发病率一般为5 % 20 %，个别田块可高达90 % 100 %，早期发病的损失可达50 70%，甚至失收。此外，病叶在烤晒后颜色不均，烟味差，品质大为降低，严重影响我国烟草生产的品质和产量。烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，缩写为 TMV)，是烟草花叶病等的病原体，病毒粒体为杆状。目前，对植物病害的防治主要采取化学防治的方法和种植抗病品种，但是由于化学农药存在污染和抗药性，使它们往往存在着无法摒除的弊端。上世纪随着生物技术的发展，植物诱导抗性研究深受植物病理学家的重视。 激发子(elicitor)是一类能激发植物产生防卫反应的化合物，是诱导植物抗性的主要因子之一，也愈发受到关注。氧爆发(Reactive Oxygen Species, R0S)禾口一氧化氮(Nitro oxide, NO)在激发子诱导的植物抗病防卫反应中起着非常重要的作用，它们都参与调控气孔运动，促进细胞编程性死亡，直接或间接杀死入侵的病原菌，作为第二信使可在转录水平上激活和调控植物体内各种防卫相关基因的表达以及参与系统获得性抗性(Systemic acquired resistance, SAR)的建立等。极细链格孢菌产生的蛋白质作为激发子是一种重要的效应分子，它通过识别并作用于植物细胞表面或亚细胞组分的受体分子来传递病原菌的激发子信号，启动植物的防卫系统，诱导植物的局部组织产生过敏性细胞坏死，并通过局部细胞信号物质的系统传递使植物最终产生系统获得性抗性。中国农业科学院植物保护研究所已经从极细链格胞菌丝内中分离了一种蛋白激发子PeaTl，并获得编码该蛋白的基因(GenBank accession number EF030819)，该蛋白具有诱导植物系统获得抗性的功能，激发烟草和水稻抗病相关基因和蛋白的表达，但该蛋白不引起烟草过敏(Hypersensitive reaction, HR)反应，即从烟草叶背注入50μ lUymol/L蛋白溶液24h后，在注射周围不形成坏死斑。研究表明，同一种真菌可以产生一种以上的蛋白激发子，因此进一步挖掘极细链格孢菌产生的新蛋白激发子并明确其序列信息，对进一步揭示激发子提高植物抗性的作用机理具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够提高植物抗性及诱导植物防御反应的来自于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima) JH505菌株的蛋白质及编码该蛋白质的核苷酸序列及其应用。
本发明所述的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima) JH505菌株，是从中国湖南省大白菜黑斑病中分离纯化获得的。该菌种已经与2011年5月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，登记入册编号CGMCC No :4841，分类命名为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)。一种分离的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。一种上述分离的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。本发明上述分离的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其中所述植物为烟草。一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列为下列所述之一(1)编码氨基酸序列如SEQ ID NO 2的蛋白质的多核苷酸序列；(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。本发明分离的多核苷酸，其中所述编码氨基酸序列如SEQ ID NO 2的蛋白质的多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。一种载体，其含有上述分离的多核苷酸。本发明载体，其中所述载体为如图9所示在PGEX-6P-1中插入基因Hripl的重组载体 PGEX-6P-1-Hripl。一种遗传工程的宿主细胞，其含有上述的载体。本发明遗传工程的宿主细胞，其中所述宿主细胞为含有上述重组载体 PGEX-6P-1-Hripl 的大肠杆菌 Rossetta (DE3)。本发明的蛋白质，是指来自极细链格孢菌(Alternaria tenuissima) JH505菌株的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。本发明的优点为该蛋白质可以明显提高植物抗性，浓度低起效快，重组蛋白接种浓度在0. 08 μ M时诱导效果最佳，坏死斑数抑制率为60. 31 %，坏死斑直径抑制率为 54. 04%。该蛋白质为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1是本发明中蛋白质用MONO-Q阴离子交换柱进行纯化时的蛋白纯化图；图2是本发明中蛋白质用分子筛Superdex 200 10/300GL进行纯化时的蛋白纯化图；图3是本发明中蛋白质纯化时各个步骤的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，I代表浓缩的发酵液过滤液，II代表用MONO-Q阴离子交换柱进行纯化时的峰II组分，III代表用分子筛Superdex 200 10/300GL进行纯化时的峰II组分；图4是本发明中用水处理叶片3天后摩擦接种TMV，接种3天后拍摄的烟草叶片；图5本发明中用1. 0 μ M Hripl处理叶片3天后摩擦接种TMV，接种3天后拍摄的烟草叶片。图6是本发明中用Hripl处理烟草悬浮细胞后H2A的产生速率；其中■为Hripl处理烟草悬浮细胞后H2A的产生速率， 为空白对照。图7是本发明中用Hripl处理烟草悬浮细胞后NO含量的测定；其中■为Hripl处理烟草悬浮细胞后NO含量，▲为空白对照。图8是本发明中Hripl基因目的片段克隆所用PGEX-6P-1载体图；图9是本发明中在PGEX-6P-1中插入基因Hripl的重组载体PGEX-6P-I-Hripl ；图10是本发明中重组蛋白质用GST Column柱进行亲和层析后的SDS-PAGE和考马斯亮兰染色的电泳图，M代表蛋白标准，1代表纯化的重组蛋白质；
具体实施例方式实施例1极细链格孢菌的培养及发酵液制备极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)是从中国湖南省大白菜黑斑病中分离纯化获得(CGMCC No. 4841)，菌株划线接种于PDA平板，黑暗中培养1周，挑取菌落边缘处接种于200mL的葡萄糖液体培养基中，24°C、150r/min黑暗中培养4周，获得极细链格孢菌的发酵液。其中PDA平板的制备方法取去皮马铃薯200克，切成块，加水1000毫升煮沸30 分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，待葡萄糖和琼脂溶化后分装，121°C灭菌30分钟。葡萄糖液体培养基的制备方法磷酸二氢钾0. 6g，硝酸钾0. 7g，七水硫酸镁 0. 25g，三水磷酸氢二钾0. 125g，硝酸钙0. 3g，硼酸lmg，一水硫酸锰1. 5mg,七水硫酸锌％ig， 二水钼酸钠0. Img,碘化钾20 μ g,五水硫酸铜20 μ g,六水氯化钴20 μ g, FeNa2EDTA 8mg,烟酸lmg，吡哆醇lmg，泛酸钙(calcium panthotenate) lmg，盐酸硫胺素lmg，天冬酰胺lg，葡萄糖20g，加去离子水至1L，在121°C的温度下，灭菌15分钟。实施例2粗蛋白质激发子的制备和检测取实施例1中所得的发酵液，在4°C、13000rpm条件下离心30min，收集上清液，用孔径0.45 μ m的滤膜(Whatman)抽滤两次，直至没有菌体。加入硫酸铵粉末，使发酵液中硫酸铵终浓度为80%来沉淀目标蛋白质，然后将其放在4°C环境下静置池，在4°C、IOOOOg 条件下离心15min，用Tris-HCl缓冲液QOmM，pH 8.0)在4°C透析下48h(阻断10，000 分子量)，透析结束后离心，最后将获得的沉淀物溶解到Tris-HCl缓冲液QOmM，pH 8. 0) 中，4°C透析Mh (阻断10，000分子量)。收集透析袋中的液体并用孔径为0. 22 μ m的滤膜 (Millipore Corp.，Billerica, MA, USA)抽滤一次。蛋白质含量用 BCA protein assay kit (Pierce, Inc.，Appleton，WI，USA)经GF-M2000型酶标仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)在波长590nm处测定，蛋白质终浓度为100 μ g/mL。生物活性的检测以生长3个月，具有5-7片真叶的烟草(Nicotiana tabacum cv. Samsun NN)为材料，将粗蛋白溶液浓度稀释到50μ g/mL，利用ImL不带针头的注射器， 将50 μ L溶液从叶子背面分别注入叶片中，以Tris-HCl缓冲液和相同浓度的牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA)溶液为对照，24h观察是否有坏死斑形成。结果注射粗蛋白质激发子的叶片，注射部位池后叶片表现轻微的透明，1 后可以呈现典型的过敏反应，形成坏死斑。24h后变褐并完全干枯，而对照并无任何反应，和正常叶片一样。
实施例3蛋白质激发子的分离纯化及生物活性测定使用AKTA explore 10 (GE Healthcare)蛋白质纯化仪对所得的总蛋白质进行进一步纯化，样品首先通过MONO-Q阴离子交换柱(GE Healthcare)，用5ml的1Tris-HCl缓冲液(75mM, pH 8. 0)平衡MONO-Q阴离子交换柱，用含有NaCl的Tris-HCl缓冲液(NaCl浓度为0-1M)线性洗脱目标蛋白。检测洗脱峰是否能引起烟草过敏反应。检测到峰II (见图 1)能引起过敏反应，故将该组分超滤浓缩(超滤管型号为Amicon Ultra_15，阻断10，000 分子量，Millipore)，浓缩得到的组分用分子筛Superdex 200 10/300GL(GE)进一步纯化， 洗脱缓冲液组分为 50mMNaH2P04，50mM Na2HPO4,150mM NaCl，pH 7.0，流速为 0. 5ml/ml，线性洗脱，最终纯化得到能诱导过敏反应的活性组分峰II (见图幻，并超滤浓缩，超滤过程中将原来的缓冲液替换为Tris-HCI缓冲液QOmM，pH 8. 0)，储存在_20°C冰箱备用。以上纯化过程中蛋白质激发子活性的检测按照实施例2中生物活性的检测方法进行。该单一蛋白质峰经15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带(见图幻，说明蛋白质纯度高。该蛋白质表观分子量为17kD(pI = 5. 50)，将此蛋白质激发子命名为Hripl (过敏反应诱导蛋白1， Hypersensitive response inducing protein 1)。用实例2同样方法测试，设置不同浓度的Hripl (5 μ M，1 μ Μ，800ηΜ, 600ηΜ, 200ηΜ)，1 μ M能够引起典型过敏性反应(见图4禾口图 5)，最低能引起过敏反应的蛋白浓度为ΙΟΟηΜ。结果分离纯化的Hripl可以使烟草形成过敏反应的坏死斑。(1)氧爆发和H2A沉积的测定烟草悬浮细胞(tobacco BY_2)来自 Nicotiana tabacum cv. Xanthi，由中国农业大学生命科学学院赠送。烟草悬浮细胞培养基MS液体培养基(MS+100mg/ml，肌醇；0. 2%, KH2P04 ；0. 2mg/ml，2，4-D ；lmg/ml,VBl ；3%蔗糖)，121°C高压蒸汽灭菌 15min，室温保存。悬浮细胞在25°C、150rpm的摇床中培养，使细胞保持在指数增长期，实验前一天进行上述培养方可使用。离心收集指数增长期的烟草悬浮细胞并重新悬浮于缓冲液(175mM甘露醇，0. 5mM 氯化钙，0. 5mM硫酸钾(北京化工，分析纯)，IOmM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma), pH 6. 5)中，配制成0. lg/mL (细胞湿重/体积)的重悬细胞，在对1，150印111孵育111。取25(^1^ 重悬细胞加入HEPES缓冲液(175mM甘露醇，0. 5mM氯化钙，0. 5mM硫酸钾(北京化工，分析纯)，IOmM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, Sigma), 0. 3mM发光氨(Luminol))中，同时加入Hripl 使其终浓度为luM，开始用化学发光检测仪(Promega)，检测细胞所生成的活性氧。结果用Hripl处理烟草悬浮细胞约IOmin后，烟草悬浮细胞出现氧爆发现象； H2O2的最大值出现在处理后30min，然后H2A浓度逐渐降低。(见图6)(2) NO积累量的测定NO是植物抗病反应的中早期信号反应，具有调控植物抗病信号传导途径的作用。烟草悬浮细胞中NO含量的测定按照Lamotte所叙述的方法((Lamotte et al. 2004), 用NO特殊的荧光体DAF-2DA (4，5- 二氨基荧光素二乙酸酯，4，5-diaminof Iuorescein diacetate) (Sigma-Aldrich)进行荧光标记，然后通过荧光光谱得到NO的量。检测荧光度结果表明，当Hripl的浓度达到0. 1 μ ηΜ时，就能观测到Ν0，并且在IOmin内持续增加，在经过Hripl处理后的IOOmin达到稳定水平(见图7)。实施例4蛋白质激发子Hripl肽段序列的获得
纯化的Hripl蛋白质经双向电泳检测，切取蛋白质单点分别经IOng/ μ 1测序级修饰胰蛋白质酶 Gequencing Grade Modified Trypsin，Promega) 30°C、ρΗ7· 5 酶解 30min lh，ESI-MS/MS为英国Micromass公司的Q-T0F2正交加速电喷雾串联质谱仪。配备纳升喷雾源。所有测定均在正离子方式下进行。质谱仪用Glu-fib的串联质谱碎片校正，质量准确度小于0. IDa。雾化气为氮气，碰撞气体为氩气。源温80°C，锥孔电压50V。TOF加速电压 9. lkV。MCP检测器电压为2150V。毛细管电压800V。最终通过MALDI-T0F和de novo测序获得该蛋白质的多个肽段序列，(Dvctggpqtfapqnvr ；o)rllfdlr和(3)lvtsptsgsvdftfk， 根据以上序列设计编码Hripl基因的PCR引物。实施例5蛋白质激发子Hripl编码基因的克隆和序列分析利用反转录酶链式反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到编码上述激发子的基因Hripl。根据质谱测序结果设计激发子编码基因3’区的简并引物 (5，-CGTCTYCTGTTYGACCTYCGT-3‘)，利用试剂盒 3，Full Race Kit(TaKaRa)进行 3，-RACE 反应。用胶回收试剂盒(天根，北京)对PCR产物进行纯化。将纯化得到的产物克隆到载体 PMD19-T (TaKaRa)上，并将该重组质粒转化感受态细胞DH5 α (Transgen,北京)。选用通用引物M13-47和RV-M进行PCR检测，筛选出阳性克隆进行核酸测序(英骏公司)。为扩增基因的5’区，据以上测序结果设计两个引物外引物(5’ -GCCCTCGTTGTGACACTCAAGC-3’ )和内引物(5，-CCTGAGCAGGTCCAGGAATGGGTG-3，)，利用试剂盒 5，Full Race Kit(TaKaRa)进行5，-RACE反应，经过与3，-RACE反应后相同的处理，测序后得到了如SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。根据该核苷酸序列推测的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)中包含实施例4中获得的3个肽段。根据MALDI-T0F和de novo测序结果可以推出，该基因的理论上编码含有163个氨基酸残基的蛋白。其cDNA序列包涵139bp的5'侧翼序列，495bp的开放读码框(ORF)， 和244bp的3'侧翼序列。Hripl ORF编码蛋白分子量17562. 5Da，等电点(pi)为5. 50。对此理论推断蛋白进行分析，发现Hripl与一些植物病原真菌有很高的相似性。其中相似性最高的是引起小麦斑点病(Wheat tanspot fungus pathogen)的病原菌理论蛋白(Genbank 登录号为EDU45602)。实施例6 Hripl基因的原核表达和纯化(1)表达载体的构建设计蛋白质激发子基因Hripl的特异性引物，引入带有酶切保护碱基的酶切位点，正向引物5，-EcoRI GGAATTCATGTACTTCTCGAATATACTCCCGG-3，，反向引物5，-Xho I GCT CGAGTCAGCACTGAGGCAAGTTACAGAC-3，，扩增全长 Hripl 基因(94°C 3min ；94°C 30s, 67°C 30s, 72°C lmin，;35循环；72°C IOmin ；4°C )。先将Hripl基因目的片段克隆到PGEX-6P-1载体，经 EcoRI和Xhol酶切后，将Hripl片段克隆到PGEX-6P-1载体(Novagen)(见图8)的EcoRI/ Xhol位点，电击转化到大肠杆菌Rossetta(DE3)，经氨苄青霉素筛选后，挑取生长良好的克隆进行PCR检测，并对PCR检测呈阳性的菌落进行测序验证。表达载体中的目的基因与 PGEX-6P-1质粒上的基因序列完全相同，阅读框也正确，表明目的基因已成功构建到表达载体中，将构建成功的表达载体命名为pGEX-6P-l-Hrip (见图9)。(2)诱导表达将步骤(1)中所获得的表达载体用热激发转化到大肠杆菌Rossetta (DE!3)中。质粒提取及转化表达宿主菌株的方法同(1)，将验证正确的重组表达菌株过夜活化，同时取 PGEX-6P-1空质粒的菌株作为对照。分别取ImL过夜培养液加入到含有100 μ g/mL氨苄青霉素的IOOmL LB液体培养基中(1 %接种量)，37°C，200r/min振荡培养2 池培养至OD6tltl 为0. 6 0. 8。加入诱导剂IPTG (终浓度为0. Immo 1/L)，16°C，220r/min继续振荡培养24h, 诱导表达目的蛋白。将诱导表达后的菌液5000r/min离心5分钟后收集菌体，用20mM磷酸缓冲液PH7. 4洗涤一次后，再用20mM、pH7. 4 PBS缓冲液重新悬浮细胞并超声破碎。将破碎后的混合物13000r/min离心后取上清。取20 μ L上清液，加入5 μ L 5ΧSDS上样缓冲液 (变性)重悬菌体，沸水浴中加热lOmin，13000r/min离心lOmin，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。转化空质粒的大肠杆菌处理方法与转化目的基因的菌株相同，也进行SDS-PAGE检测。结果经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约43_kDa的融合表达蛋白 (GST-Hripl)，其中GST标签的分子量为^kDa,与预测一致。(3)重组蛋白的纯化利用AKTA explorerlO蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。选用GST Column柱进行亲和层析，先用50mM EDTA的磷酸缓冲液平衡亲和柱；取步骤( 离心后的重组蛋白液 5mL进样，流速为lmL/min，淋洗至基线后，用洗脱缓冲液(20mM PBS，pH7. 4，500mM咪唑)进行洗脱；收集各洗脱峰，在大量体积的磷酸盐缓冲液O0mM，pH7.4)中4°C透析过夜，随后进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色检测蛋白的纯度(见图10)。生物活性测定采用实施例2中方法测定重组蛋白质激发子对烟草的活性。结果获得纯化的融合表达蛋白(GST-Hripl重组蛋白)。实施例7重组蛋白(GST-Hripl)在烟草上引起的反应用ImL不带针头的注射器，分别将50 μ L、lyM的融合表达蛋白(GST-Hripl)，以及相同浓度的空质粒表达蛋白和iTris-HClOOmM, ρΗ 8.0)溶液分别从叶子背面注入烟草叶片中，24h后观察叶片上的反应。如实施例3中(1)的方法，观察重组蛋白诱导H2A在处理叶片上的积累；如实例3 中O)的方法，观察重组蛋白引起烟草悬浮细胞NO积累量。结果重组蛋白(GST-Hripl)能够引起烟草叶片发生过敏反应；GST-Hripl使处理叶片H2O2积累，产生红褐色沉淀；GST-Hripl使处理的烟草悬浮细胞NO含量增加。(1)抗性相关基因半定量RT-PCR分析取GST-Hripl处理不同时间的烟草叶片，用液氮研磨成粉，按50-100mg/mL加入 Trizol试剂，室温5min静置，12000rpm离心5min,弃沉淀；按200 μ L氯仿/mL Trizol试剂加入氯仿，涡旋剧烈震荡混勻，4°C，12000rpm离心15min，吸取上层，加入0. 5mL异丙醇/mL Trizol试剂，混勻，-20°C静置20min;离心，75% (w/v)乙醇漂洗，离心去除乙醇，5-lOmin 晾干。加入焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)处理水，测RNA浓度，调成相同浓度。第一链cDNA 的合成，采用 TransGen 公司的 TransScript Two-Step RT-PCR Kit。 取 500ng 总 RNA，按照试剂盒说明书，用 TransScript RT/RI Enzyme Mix,以 Anchored Oligo (dT) 18为引物，42°C孵育30min，85°C加热5min使酶失活。取1 μ L反转录产物为模板做PCR，. β -actin为内标基因，以抗性相关基因特异引物做PCR，观察抗性相关基因的表达情况。 表1.利用反转录酶链式反应(RT-PCR)检测抗性基因所用引物序列
权利要求
1.一种分离的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—种权利要求1所述的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。
3.根据权利要求2所述蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其特征在于所述植物为烟草。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于其核苷酸序列为下列所述之一(1)编码氨基酸序列如SEQID NO 2的蛋白质的多核苷酸序列；(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述分离的多核苷酸，其特征在于所述编码氨基酸序列如SEQID NO 2的蛋白质的多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
6.一种载体，其特征在于含有权利要求4或5所述的分离的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述载体，其特征在于所述载体为在PGEX-6P-1中插入基因Hripl 的重组载体 PGEX-6P-1-Hripl。
8.一种遗传工程的宿主细胞，其特征在于含有权利要求6或7所述的载体。
9.根据权利要求8所述遗传工程的宿主细胞，其特述在于所述宿主细胞为含有权利要求7所述重组载体的大肠杆菌Rossetta (DE3)。
全文摘要
本发明提高植物抗性和诱导植物防御反应的蛋白质及其基因、应用涉及来自真菌的具有多于20个氨基酸的肽、编码该肽段的核苷酸序列及其应用的领域。本发明记载了一种分离的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；以及一种上述蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用；还记载了一种编码氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的蛋白质的分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明蛋白质可以明显的提高植物的抗性，浓度低起效快，为提高植物的抗病性提供了新的途径。
文档编号C12N1/21GK102241752SQ20111014920
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者曾洪梅, 杨秀芬, 袁京京, 邱德文, 郭立华, 马赫什·萨克哈莱姆·库勒 申请人:中国农业科学院植物保护研究所