专利名称：多菌发酵剂和用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品及其生产方法
技术领域：
本发明属于多菌发酵及其乳品和应用的技术领域，是一种多菌发酵剂和用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品及其生产方法。
背景技术：
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)作为人类生命的第一杀手的心脑血管病， 当前严重威胁着人类的生命和健康。我国每年新发生脑卒中病例约300万，心肌梗死60万人，心脑血管病死亡人数约260万，平均每小时死亡300人。更令人担忧的是，心脑血管病发病和死亡人群日益呈现年轻化趋势，30岁左右发生心肌梗死和脑卒中的已屡见不鲜，15 岁以上人群高血压患病率约为14%，比30年前增加了一倍。上述疾病间关系密切，错综复杂。而动脉粥样硬化是诸多心脑血管病的主要病理基础，因此，防治动脉粥样硬化是防治心脑血管病的根本性战略措施。临床上应用的经典的抗动脉粥样硬化药物主要有调血脂药、抗氧化药、多烯脂肪酸类、抗血小板药及保护动脉内皮药等。常用的调血脂药主要有他汀类、贝特类、胆酸结合树脂类、烟酸等，可以通过不同程度的降低血中胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白水平，提高高密度脂蛋白水平起到治疗作用。但是临床流行病学研究发现，长期应用贝特类药物可增加非冠脉疾病的死亡率，胆酸结合树脂类虽然降低冠脉疾病的死亡率，但总死亡率并未降低。20世纪80年代以来他汀类药物的广泛使用，使动脉粥样硬化治疗取得了重大进展。然而，通过单独降低LDL胆固醇水平带来的益处存在一定的限度，从他汀类药物自身来讲，发生横纹肌溶解症是其致命的缺点。
发明内容
本发明提供一种多菌发酵剂和用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品及其生产方法，因其独特的制作工艺，使其具有抗动脉粥样硬化、调节血脂、抗炎、抗氧化等作用。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种多菌发酵剂，其按下述原料重量份发酵得到，发酵菌与牛奶或脱脂牛奶的重量比为1 20至30，发酵菌为短乳 If |ii (Lactobaci 1 Ius brevis)> ^lJ ？LIf lif (Lactobacillus plantarum) > Jfnf dr If lif (Lactobacillus. helveticus)> 马季L ？L If 胃(Lactobacillus kef ianofaciens)、zP 酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)、单孢酉良酒酵母(Saccharomyces unisporus)、东方伊萨酵母 (Issatchenkia orientalis)，各菌种之间的重量比为 0. 8 至 1. 0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 1.0 至 1.2: 0.2 至 0.4: 0. 2 至 0. 4。上述技术方案之一可进一步进行优化或/和选择如下
上述多菌发酵剂按下述步骤得到首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌后，其次冷却到42°C至45°C加入所需要量的发酵菌，然后在40°C至45°C恒温下发酵8小时至12小时得到多菌发酵剂。在上述恒温下发酵5小时至12小时时至少搅拌两次。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种上述多菌发酵剂的生产方法，其按下述步骤进行首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌后，其次冷却到 42°C至45°C加入所需要量的发酵菌，然后在40°C至45°C恒温下发酵8小时至12小时得到多菌发酵剂。上述技术方案之二可进一步进行优化或/和选择如下 在上述恒温下发酵5小时至12小时时至少搅拌两次。上述牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌的操作参数为加热90°C至95°C，保温10分钟至15分钟杀菌。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种利用上述多菌发酵剂的用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品，其按下述原料发酵得到，按牛奶或脱脂牛奶总重量的 3%至5%的比例添加上述制得的多菌发酵剂。上述技术方案之三可进一步进行优化或/和选择如下
上述多菌发酵乳品按下述步骤得到第一步，首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶加热到50°C至60°C进行均质后经过巴氏杀菌，其次冷却到40°C至45°C加入所需要量的多菌发酵剂，然后在40°C至45°C恒温下发酵6小时至8小时；第二步，发酵结束后，在18°C至23°C 恒温下成熟72小时至120小时；第三步，勻速搅拌1. 5小时至2小时，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小时至2小时；第四步，分离乳清在18°C至23°C下，经灭菌滤布过滤， 分别得到乳酪和乳清，该乳清为多菌发酵乳品。本发明的技术方案之四通过以下措施来实现的一种上述多菌发酵乳品的生产方法，其按下述步骤进行第一步，首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶加热到50°C至60°C进行均质后经过巴氏杀菌，其次冷却到40°C至45°C加入所需要量的多菌发酵剂，然后在40°C 至45°C恒温下发酵6小时至8小时；第二步，发酵结束后，在18°C至23°C恒温下成熟72小时至120小时；第三步，勻速搅拌1. 5小时至2小时，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮 1小时至2小时；第四步，分离乳清在18°C至23°C下，经灭菌滤布过滤，分别得到乳酪和乳清，该乳清为多菌发酵乳品。上述技术方案之四可进一步进行优化或/和选择如下
上述牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌的操作参数为加热90°C至95°C，保温10分钟至 15分钟杀菌。本发明易操作、生产方法简单，所得多菌发酵乳品营养丰富，含有益生菌、ACE抑制肽、抗氧化肽等成份，具有抗动脉粥样硬化、调节血脂、抗炎、抗氧化等作用，能增强人的体质和整体活力，延缓人的衰老。
附图1为正常组冠脉在显微镜下10倍的放大图。附图2为正常组冠脉在显微镜下40倍的放大图。附图3为模型组在显微镜下10倍的放大图。附图4为模型组在显微镜下40倍的放大图。
附图5为辛伐他汀组在显微镜下10倍的放大图。附图6为辛伐他汀组在显微镜下40倍的放大图。附图7为TFCW小剂量组在显微镜下10倍的放大图。附图8为TFCW小剂量组在显微镜下40倍的放大图。附图9为TFCW中剂量组在显微镜下10倍的放大图。附图10为TFCW中剂量组在显微镜下40倍的放大图。附图11为正常组冠脉ICAM-I在显微镜下倍的放大图。附图12为正常组冠脉ICAM-I在显微镜下40倍的放大图。附图13为模型组冠脉ICAM-I在显微镜下倍的放大图。附图14为模型组冠脉ICAM-I在显微镜下40倍的放大图。附图15为辛伐他汀组冠脉ICA M-I在显微镜下10倍的放大图。附图16为辛伐他汀组冠脉ICA M-I在显微镜下40倍的放大图。附图17为TFCW小剂量组ICAM-I在显微镜下10倍的放大图。附图18为TFCW小剂量组ICAM-I在显微镜下40倍的放大图。附图19为TFCW中剂量组ICAM-I在显微镜下10倍的放大图。附图20为TFCW中剂量组ICAM-I在显微镜下40倍的放大图。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。下面通过实施例对本发明作进一步描述
实施例1，该多菌发酵剂按下述原料重量份发酵得到，发酵菌与牛奶或脱脂牛奶的重量比为1 20至30，发酵菌为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌 (Lactobacillus ρIantarum) > Jfnf dr If lif (Lactobacillus, helveticus)、马季L ？L 杆菌(Lactobacillus kefianofaciens)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)、单孢酿酒酵母 (Saccharomyces unisporus)> ^Tj(Issatchenkia oriental is)，"^胃禾中 tl、S]白勺
重量比为 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 1.0 至 1. 2: 0. 2 至 0. 4: 0. 2 至 0. 4。实施例2，该多菌发酵剂按下述原料重量份发酵得到，发酵菌与牛奶或脱脂牛奶的重量比为1 20至30，发酵菌为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌 (Lactobacillus ρIantarum) > Jfnf dr If lif (Lactobacillus, helveticus)、马季L ？L 杆菌(Lactobacillus kefianofaciens)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)、单孢酿酒酵母 (Saccharomyces unisporus)> ^Tj(Issatchenkia oriental is)，lifft^fB] ^ 重量比为 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 1.0 或 1.2: 0.2 或 0.4: 0.2 或 0.4。实施例3，与实施例1和实施例2的不同之处在于实施例3的多菌发酵剂按下述步骤得到首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌后，其次冷却到42V至45°C加入所需要量的发酵菌，然后在40°C至45°C恒温下发酵8小时至12小时得到多菌发酵剂。实施例4，与实施例1和实施例2的不同之处在于实施例4的多菌发酵剂按下述步骤得到首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌后，其次冷却到42°C至45°C加入所需要量的发酵菌，然后在40°C至45°C恒温下发酵8小时至12小时得到多菌发酵剂。实施例5，与实施例1至实施例4的不同之处在于实施例4在恒温下发酵5小时至12小时时至少搅拌两次。实施例6，该用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品按下述原料发酵得到，按牛奶或脱脂牛奶总重量的3%至5%的比例添加上述实施例1至实施例5制得的多菌发酵剂。实施例7，该用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品按下述原料发酵得到，按牛奶或脱脂牛奶总重量的3%或5%的比例添加上述实施例1至实施例5制得的多菌发酵剂。实施例8，与实施例6和实施例7的不同之处在于实施例8的多菌发酵乳品按下述步骤得到第一步，首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶加热到50°C至60°C进行均质后经过巴氏杀菌，其次冷却到40°C至45°C加入所需要量的多菌发酵剂，然后在40°C至45°C恒温下发酵6小时至8小时；第二步，发酵结束后，在18°C至23°C恒温下成熟72小时至120小时；第三步，勻速搅拌1. 5小时至2小时，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小时至2 小时；第四步，分离乳清在18°C至23°C下，经灭菌滤布过滤，分别得到乳酪和乳清，该乳清为多菌发酵乳品。实施例9，与实施例1至实施例8的不同之处在于实施例9的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌的操作参数为加热90°C至95°C，保温10分钟至15分钟杀菌。实施例10，与实施例1至实施例8的不同之处在于实施例10的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌的操作参数为加热90°C或95°C，保温10分钟或15分钟杀菌。在本发明中％百分比都为重量百分比。上述实施例所得本发明多菌发酵乳品的保健功能成分的试验和药效学试验如下
下述试验数据为上述实施例所得本发明多菌发酵乳品试验的平均数据。本发明多菌发酵乳品的保健功能成分的分析 1. 1营养成分
1.1.1检测方法和依据
蛋白质用凯氏定氮仪测定，检测依据GB/T5413. 1. 3-1997 ； 灰分按 GB/ T5009. 4-2003 测定； 水分按 GB/T5009. 3-2003 测定； 乳糖按 GB/T5413. 5-1997 测定； 按GB/T5413. 22-1997测定磷的含量
矿物质用Avanta-PM型原子吸收分光光度计，按GB/ T5009. 14-2003测定锌的含量； 按GB/T5009. 90-2003测定铁和镁的含量；按GB/T5009. 91，93-2003测定钙和硒的含量；按 GB/ T5009. 91- 2003测定钾和钠的含量
氨基酸类用氨基酸自动分析仪按GB/T5009-2003测定； 脂肪酸用Sigma 115型气相色谱仪按GB/T17377-1998测定。维生素类用1525泵系列高效液相色谱仪，按GB/T6195-1986测定维生素C的含量；按GB/T5009. 82-2003测定维生素AE的含量。1.1.2 结果
1. 1. 2. 1总蛋白及17种氨基酸含量测定
测定结果表明本发明多菌发酵乳品中总蛋白含量为1. 72%，总氨基酸含量为0. 734%， 其中含有9种人体必需的氨基酸(含婴幼儿必需的组氨酸)，含量为0. 296%，占总氨基酸的比例40. 33%，与人乳(43. 0%)相近(见表1-1-2-1)。各氨基酸中，以丝氨酸的含量为最高， 为0.47%，其次为谷氨酸，含量为0. 14%。此外，脯氨酸(0.091%)、赖氨酸(0.056%)、亮氨酸 (0. 047%)、天门冬氨酸(0. 046%)含量也较高。2. 1. 2. 2本发明多菌发酵乳品中脂肪酸组成及含量
本发明多菌发酵乳品中脂肪构成饱和脂酸(棕榈酸、硬脂酸)含量为38. 7%，不饱和脂肪酸含量为61.3%，其中，单不饱和脂肪酸(芥酸未检出)高达46. 0%，多不饱和脂肪酸为 15. 3%，结果见表 2-1-2-2。2. 1. 2. 3本发明多菌发酵乳品中碳水化合物含量
本发明多菌发酵乳品中主要碳水化合物_乳糖含量为5. 58%，高于牛奶，与羊乳相近。2. 1. 2. 4本发明多菌发酵乳品中矿物质组成及含量
本发明多菌发酵乳品中矿物质含量丰富，其中对人体有益的钾元素含量最高，为246. 3 mg/100g，其次为钙，含量为200. 2mg/100g，镁18. 7 mg/100g，显著高于其他乳类，锌为0. 09 mg/100g，并且在本发明多菌发酵乳品中还有硒检出为1.5Pg。结果见表2-1-2-4。2. 1. 2. 5本发明多菌发酵乳品中维生素组成及含量
本发明多菌发酵乳品中主要维生素含量中，维生素C和维生素B2含量较高，但低于其它乳类，结果见表2-1-2-5。2. 1. 3. 1 结果显示
测定结果显示本发明多菌发酵乳品中富含多种营养成分，总蛋白和氨基酸含量丰富， 如总蛋白含量为1. 72%，18种氨基酸中，9种人体必需的氨基酸(含婴幼儿必需的组氨酸)含量为0. 30%,占总氨基酸的比例40. 33% ；各氨基酸中以丝氨酸的含量最高，为0. 47g/100g, 其次为谷氨酸为0. 14 g/100g。2. 1. 3. 2在脂肪酸分析中，本发明多菌发酵乳品中单不饱和脂肪酸高达46. 0%
近期的许多研究证实，顺式单不饱和脂肪在降低胆固醇方面的能力与多不饱和脂肪酸 (PUFA)相同，具有调节血脂作用、降胆固醇作用、降低氧化应激等多种生物学作用。本发明多菌发酵乳品中单不饱和脂肪酸含量很高，且丝氨酸含量也较高、对防治老年痴呆、高血脂等心脑血管疾病可能不失为一种好的选择。2. 1. 3. 3本发明多菌发酵乳品中乳糖含量
本发明多菌发酵乳品中乳糖含量为5. 58%，高于牛奶，与羊乳相近。乳糖对于促进钙的吸收，调节肠道环境具有良好功效。2.2益生菌检测方法
对本发明多菌发酵乳品中发酵菌进行分离纯化，然后结合形态学、生理生化特性和 16SrDNA、16SrRNA、26SrDNADl/D2区基因序列分析方法进行鉴定。结果从本发明多菌发酵乳品中分离到两种有价值的微生物一类为乳酸菌，另一类为酵母菌；分别归属为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌 (Lactobacillus ρIantarum)、Jfnf dr If lif (Lactobaci 1 lus. helveticus)马？L ？LIf 菌(Lactobacillus kefianofaciens)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)禾口香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)；单孢酿酒酵母 (Saccharomyces unisporus)禾口东力·!^!^·(Issatchenkia orientalis)02.3 ACE抑制肽、抗氧化肽
方法通过对本发明多菌发酵乳品的血管紧张素转化酶(ACE)、2，2-二苯基-1-苦胼基自由基(DPPH ·)、羟自由基(· OH)和超氧阴离子自由基(02_ ·)的体外清除能力进行测定。结果研究证实本发明多菌发酵乳品通过发酵菌的胞外蛋白酶，肽酶的水解作用， 乳蛋白中具有生理活性的肽片段释放出来，例如ACE抑制肽、抗氧化肽等，详见表2-3。结论ACE抑制肽是一类具有降血压活性的多肽物质，属竞争性抑制剂，它们对 ACE活性区域的亲和力大于血管紧张素I和缓激肽对ACE的亲和力，并且它们一旦和ACE 活性区域结合，就难于释放出来，从而阻碍血管紧张素I转化为血管紧张素II以及缓激肽分解为失活片段，达到降血压功能。高血压是引起动脉粥样硬化的危险因素之一，本发明多菌发酵乳品能够抗动脉粥样硬化。本发明多菌发酵乳品总抗氧化功能是由本发明多菌发酵乳品中各抗氧化组分的协同作用的结果，使较长期服用本发明多菌发酵乳品的人能增强体质和整体活力，延缓衰老。3.本发明多菌发酵乳品药效学试验
3. 1本发明多菌发酵乳品调节血脂、抗动脉粥样硬化作用
3. 1. 1材料与方法
3. 1. 1. 1实验动物与试剂
健康雄性新西兰兔50只，体重(2士0. 05) kg，3个月龄，购自新疆医科大学实验动物中心(合格证号SYXK新2003 - 0001)。胆固醇(分析纯)、胆酸钠均购于北京奥博星生物技术责任有限公司，丙基硫氧嘧啶购于上海化学试剂公司，辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司)。ICAM-I试剂盒为ADL (No. QRCT_3103223EIA\UTL)产品，VCAM-I定量酶联检测试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司，用本发明实施例1至实施例10所得的多菌发酵乳品来做试验。3. 1. 1. 2新西兰兔动脉粥样硬化模型的建立
健康新西兰兔50只，雌雄各半，体重2kg左右，随机分为正常组(喂饲普通颗粒饲料)，动粥模型组、阳性对照组、本发明多菌发酵乳品小剂量组和本发明多菌发酵乳品中剂量组。除正常组外，其余各组采用高脂颗粒饲料。高脂颗粒饲料喂养8w后，正常组及动粥组给纯净水作对照，实验组给予本发明多菌发酵乳品，即本发明多菌发酵乳品的用量按照人和动物体表面积折算的等效剂量的比值表计算，中剂量组给予本发明多菌发酵乳品50mg · kgl，小剂量组给予本发明多菌发酵乳品25mg · kgl，阳性对照组给予辛伐他汀 20mg*kgl，共28d。全程实验第87d，最后一次灌胃后6h，戊巴比妥麻醉新西兰兔，腹主动脉插管取血，测定各种指标。3. 1. 1.3各种指标的测定
3. 1. 1. 3. 1血脂与肝组织勻浆脂质全程实验第87天，戊巴比妥麻醉新西兰兔，腹主动脉插管取血，取肝右叶lg，4 °C以0. 9%生理盐水制成10 %的勻浆，离心15min，留取上清液，用贝克曼自动生化仪测定血清及肝组织勻浆总胆固醇(Tc)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量，血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)由换算得。3.1.1.3.2体重与肝系数及C-反应蛋白在喂予高脂饲料前、12w后及麻醉前各称重一次，计算兔体重增长情况，处死兔后，称取肝脏重量，肝系数为肝脏重量与兔体重之比。散射测浊法(速率法)速率散射法应用Beckman Coulter Image测定血清高敏C-反应蛋白含量。3. 1. 1. 3. 3 ICAM和VCAM含量的测定全程实验第87天，戊巴比妥麻醉新西兰兔， 腹主动脉插管取血，离心15min，留取血清，VCAM-I的测定采用双抗体夹心ABC-ELISA法。 用抗人sVCAM-1与单抗结合，加入生物素化的抗人sVCAM-1抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物标记的Sti^ptavidin与生物素结合，加入酶底物0PD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，sVCAM-Ι浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中sVCAM-Ι浓度。定量根据酶联检试剂盒要求测定其含量
3. 1. 1. 3. 4免疫组织化学动脉组织石蜡切片-20°C丙酮固定5 min，然后按照免疫组织化学ABC法进行组织染色，一抗采用抗兔VCAM- 1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司提供，1 200稀释)。用DAB显色，苏木精衬染，封片后在显微镜下观察。另设 PBS阴性对照组。胞膜或胞浆处有棕黄色或棕褐色颗粒状物质，呈网格状或环状沉淀者为阳性细胞。在高倍显微镜下(10X40)任选5个视野进行阳性细胞百分数计数，求平均值。3. 1.2统计学处理
数据以表示，各组间均
数比较首先进行方差齐性检验，如结果满足方差齐性，则采用单因素方差分析或t检验方法，如不满足方差齐性，则采用秩转换检验方法。全部过程均通过SPSS11. 5统计分析软件进行，以P < 0. 05作为差异具有统计学意义的界限。3.1.3.实验结果
3. 1. 3. 1.本发明多菌发酵乳品对实验性动脉粥样硬化兔血脂的影响动粥模型组与正常组相比，血清胆固醇值、甘油三酯值及低密度脂蛋白水平升高。本发明多菌发酵乳品中、小剂量组及辛伐他汀组(20 mg-kgl)的胆固醇(Tc)水平降低，LDL-C 水平降低；TG水平降低。动粥模型组、辛伐他汀组、本发明多菌发酵乳品小剂量组、本发明多菌发酵乳品中剂量组及与正常组比较均可升高HDL—C，差异有统计学意义，结果见表 3-1-3-1。3. 1. 3. 2本发明多菌发酵乳品对实验性动脉粥样硬化兔体重、肝指数和C反应蛋白的影响。与正常组相比，动粥模型组C反应蛋白含量升高，本发明多菌发酵乳品25 mg.kgU50 mg*kgl组和辛伐他汀组显著降低。肝指数、体重无统计学意义，结果见表 3-1-3-2。3. 1. 3. 3对实验性动脉粥样硬化兔动脉病理的影响
肉眼观察，见正常家兔主动脉内膜光滑，未见粥样斑块形成。显微镜下正常组(图1、图 2)血管壁三层结构清晰，内膜光滑完整，平滑肌细胞排列整齐。动粥模型组(图3、图4)家兔血管壁弥漫性隆起，突向管腔，内膜不完整，并有粥样斑块形成。主动脉内膜增厚尤为明显，内膜和中膜均可见大量泡沫细胞和少量的纤维母细胞，平滑肌细胞排列紊乱。大部分冠状动脉形成典型动脉粥样硬化病变，心肌组织脂质沉积较严重。辛伐他汀组(图5、图6)内膜和中膜均可见泡沫细胞，但未见粥样斑块形成，本发明多菌发酵乳品两个剂量组(图7至图10)内膜完整，内膜和中膜可见少量泡沫细胞，但未见粥样斑块形成。3. 1.3.4免疫组织化学检测
正常组(图11、图12)兔冠状动脉内膜光滑，内皮细胞胞浆未见黄染，动粥模型组(图 13、图14)内膜内皮细胞和平滑肌细胞胞浆有明显棕黄色颗粒，阳性细胞面积的百分比为(30. 12士9. 95)%，阳性对照组动脉内皮有少量ICAM-I表达，阳性细胞面积的百分比为 (2. 77士0. 53)%，本发明多菌发酵乳品小、中剂量组(图17-20)可见内皮细胞膜染色，内皮细胞胞浆内棕黄色颗粒很少，主要在内皮细胞外表达，阳性细胞面积的百分比为分别是 (6. 46士 1. 55)%,(2. 49士0. 53)%，动粥模型组与给药各组相比差异均有显著性(P < 0. 01)。 ICAM-I和VCAM-I定量则根据酶联检试剂盒要求测定，结果见表3_1_3_4及图11至图20。在本实验通过给予兔12w高脂饮食，血清TC、TG、LDL_C含量和CRP水平显著升高， 成功建立动脉粥样硬化新西兰兔模型。实验数据与文献报道相附。本实验结果显示本发明多菌发酵乳品能明显降低血清TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C水平，明显降低血清CRP水平。本发明多菌发酵乳品能明显降低血清ICAM-I和VCAM-I含量，免疫组化结果可见动粥模型组ICAM-I在兔冠状动脉斑块病灶内的细胞、内皮细胞及平滑肌细胞均有的表达。 在粥样斑块脱落时，ICAM-I在腔面内皮表达呈最低水平或消失，主要以平滑肌细胞表达为主，给药各组VCAM-I表达最多在内皮细胞表面，细胞浆中较少。病理组织学结果也可见，本发明多菌发酵乳品两剂量组，内皮细胞尚完整，可见少量泡沫细胞，粥样硬化斑块明显减小，血管壁纤维化程度轻，炎性细胞少。TFCE中、小剂量组具有调节血脂及减少粘附分子表达，提示本发明多菌发酵乳品抗实验性动脉粥样硬化作用与其内皮保护作用及抗炎作用有关。3. 2细胞内皮保护作用 3. 2. 1材料与方法
3. 2. 1. 1实验动物与试剂
健康雄性SD大鼠50只，体重(200士 10) g，3个月龄，购自新疆医科大学实验动物中心 (合格证号:SYXK 新 2003 — 0001)。用本发明多菌发酵乳品直接给药。3. 2. 1. 2大鼠动脉粥样硬化模型的建立
SD大白鼠动脉粥样硬化模型的建立健康SD大白鼠50只，雌雄各半，体重200g左右，3个月龄，随机分为正常组(喂饲普通颗粒饲料)，动粥模型组、阳性对照组、本发明多菌发酵乳品小剂量组、本发明多菌发酵乳品中剂量组及本发明多菌发酵乳品大剂量组。除正常组外，其余各组采用高脂乳剂灌胃.同时在高脂乳剂灌胃开始一周后，一次性腹腔注射维生素D3 60万IU*kgl。喂食高脂乳剂4周后，正常组及动粥组给纯净水作对照，实验组给予本发明多菌发酵乳品，即本发明多菌发酵乳品的用量按照人和动物体表面积折算的等效剂量的比值表计算，大剂量组给予本发明多菌发酵乳品IOOmg · kgl，中剂量组给予本发明多菌发酵乳品50mg · kgl，小剂量组给予本发明多菌发酵乳品25mg · kglg，阳性对照组给予辛伐他汀20mg · kglg，每天下午共灌胃给药共28d。全程实验第57d，最后一次灌胃后6h，戊巴比妥麻醉大鼠，颈动脉插管取血，测定各种指标。3. 2. 1.3各种指标的测定
TC、TG、HDL-C, LDL-C ；放射免疫法测定内皮素(ET)、血栓烷B2 (TXB2)、肿瘤坏死因子 (TNF-α )、白细胞介素一 8 (IL-8) 3. 2. 2实验结果
3. 2. 2. 1本发明多菌发酵乳品对实验性动脉粥样硬化大鼠血脂的影响动粥模型组与正常组相比，血清胆固醇值、三酰甘油值及低密度脂蛋白水平升高。本发明多菌发酵乳品大、中、小剂量组及辛伐他汀组(20mg/kg)的胆固醇(TCH)水平降低， LDL-C水平降低；TG水平降低，动粥模型组与正常组及各给药组均对高密度脂蛋白水平无影响，差异没有统计学意义，结果见表3-2-2-1。
3. 2. 2. 2本发明多菌发酵乳品对实验性动脉粥样硬化大鼠内皮功能的影响。 动粥模型组中内皮素(ET)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)及白细胞介素-8 ( IL-8)等炎性因子均高于正常组，辛伐他汀组可显著降低ET、TNF_a、IL_8的水平，本发明多菌发酵乳品小剂量组可显著降低ET、IL-8的水平，本发明多菌发酵乳品大剂量组可显著降低IL-8及 TNF-α的水平，本发明多菌发酵乳品中剂量组可显著降低ET、IL-8的水平。本发明多菌发酵乳品小剂量组在降低ET方面效果优于辛伐他汀组的。本发明多菌发酵乳品各剂量组对 TXB2没有统计学意义。结果见表3-2-2-2。实验证明喂食胆固醇可引起高脂血症，损伤血管内皮，内皮损伤或血清胆固醇水平过高导致典型粥样硬化病变。本实验通过高脂饮食及注射大剂量维生素D3，造成内皮损伤，成功建立动脉粥样硬化大鼠模型。实验数据与文献报道相附。本实验结果显示本发明多菌发酵乳品能明显降低血清Tch、TG、LDL-C含量，升高HDL-C水平，有利于将胆固醇送到肝脏代谢分解，抑制细胞摄入LDL-C，缓解AS。本发明多菌发酵乳品组与阳性对照药辛伐他汀比较，在降低血清胆固醇、降低C反应蛋白含量方面有优势。3. 3抗炎、抗氧化作用 3. 3. 1材料与方法
动物健康雄性SD大鼠100只，体重(200 士 10) g，3个月龄，购自新疆医科大学实验动物中心(合格证号SYXK新2003-0001)。药物阿司匹林(新疆西域药业股份有限公司)，布洛芬(湖北百科亨迪药业有限公司)，本发明多菌发酵乳品(来自本发明的实施例1至实施例10所得的本发明多菌发酵乳品即 TFCW)。角叉菜胶致小鼠足肿胀模型的制备50只小鼠，随机分为4组，盐水对照组，阿司匹林阳性对照组(15mg · kg-1)，TFCW小、中剂量组(25，50 mg · kg_l)。各组动物每天灌胃给药，共7d。于末次给药后Ih在每只小鼠右后肢皮下注射1%角叉菜胶混悬液0. 11 m L 致炎，并分别在致炎后lh、2h、3h和4h用游标卡尺测右足肿胀程度(足肿胀度=致炎后足周径_致炎前足周径)，计算抑制率。大鼠棉球肉芽肿形成模型的制备40只大鼠，随机分为4组，每组10只。各组动物戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下在大鼠腋下植入棉球(每个棉球重20 mg，高压灭菌后，60 °〇烤箱烘干)，分组及给药同上，然后各组动物分别灌胃给药，连续10d，dll，戊巴比妥钠麻醉大鼠，取出棉球，剥离肉芽组织，置60 ！烤箱烤至恒重。肉芽肿干重=植入棉球肉芽肿重量-植入棉球重量。按照下式计算肉芽肿形成抑制率。抑制率？%=盐水组棉球肉芽肿重量 (mg)-给药组棉球肉芽肿重量(mg)/盐水组棉球肉芽肿重量(mg) X 100%。角叉菜胶致大鼠气囊滑膜炎模型的制备40只大鼠分4组生理盐水对照组、布洛芬组、TFCW小剂量组、TFCW中剂量组。于实验dl在各组大鼠背部皮下注射经过滤器过滤的空气20ml，使大鼠背部形成气囊，待d3在原气囊处再注射经过滤器过滤的空气20ml，同时于当天各组大鼠开始分别灌胃给药，即给予生理盐水lml/100g，布洛芬组15mg -kg-1,TFCff 小、中剂量组25，50mg · kg-1，连续给药7d。实验d8在各组大鼠背部皮下注射经过滤器过滤的空气IOml后，再在气囊内注射2%角叉菜胶2ml致炎。在致炎24h后，采静脉血，并将大鼠处死，用Hank’ s液Iml灌洗气囊，收集灌洗液，离心，分别收集上清液，供各项指标测定。渗出液中WBC测定行常规涂片法白细胞计数连续观察3 5个10X40视野，取平均值；采用散射测浊法(速率法)，速率散射法应用Beckman Coulter Immage测定血清hs_CRP 含量。抗氧化作用的测定利用上述角叉菜胶致大鼠气囊滑膜炎慢性炎症模型，在致炎 24h后，采静脉血，并将大鼠处死，根据总抗氧化能力测定试剂盒说明，采用比色法测定总总抗氧化能力，丙二醛(MDA)的测定采用TBA法。3. 3. 2 结果
3. 3. 2. 1本发明多菌发酵乳品对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响与生理盐水组比较，本发明多菌发酵乳品小、中剂量组和阿司匹林组(除外阿司匹林组致炎后2 h)，在致炎后lh、2h、3h、4h各时间段，肿胀度均明显减轻，特别是本发明多菌发酵乳品小剂量组的足肿胀度显著减轻，结果见表3-3-2-1。
3.3.2.2对大鼠棉球肉芽肿形成的影响
与生理盐水组比较，本发明多菌发酵乳品小、中剂量组及布洛芬组的棉球肉芽肿干重均显著降低，且给药各组与布洛芬组比较无显著差异。布洛芬组对肉芽肿形成的抑制率为24. 17%，本发明多菌发酵乳品小、中剂量组对肉芽肿形成的抑制率分别为17. 11%和 17. 18%。与生理盐水组比较，本发明多菌发酵乳品小、中剂量组及布洛芬组对大鼠体重的影响，无统计学意义，结果见表3-3-2-2。3. 3. 2. 3本发明多菌发酵乳品对角叉菜胶致大鼠气囊滑膜炎模型渗出液体量的影响，见表3-3-2-3。与盐水组比较，布洛芬组及本发明多菌发酵乳品剂量组小、中、大剂量组对角叉菜胶致大鼠气囊滑膜炎的渗出液体量有显著抑制作用，差异有统计学意义。
3. 5 本发明多菌发酵乳品对角叉菜胶致大鼠气囊滑膜炎血清中hs-CRP、总氧化能力和MDA的影响。与盐水组比较，布洛芬组、本发明多菌发酵乳品小剂量和中剂量组对气囊滑膜炎大鼠血清中CRP有显著抑制作用，差异有统计学意义。与模型组比较，本发明多菌发酵乳品50mg. kg—1组显著提高角叉菜胶致气囊滑膜炎大鼠的血清中总抗氧化能力，差异有统计学意义0°值为0. 047)，阳性组布洛芬组对血清中总抗氧化能力无明显影响Gd值为0. 231)。 与模型组比较，本发明多菌发酵乳品中、小剂量组对角叉菜胶致气囊滑膜炎的大鼠血清中MDA的含量有显著抑制作用，差异有统计学意义Gd值分别为0. 019,0. 048)，但各组之间差异无统计学意义0°>0. 05)。而阳性对照布洛芬组则对MDA的含量无明显影响Od 值分别为0. 197)。结果见表3-5。
权利要求
1.一种多菌发酵剂，其特征在于按下述原料重量份发酵得到，发酵菌与牛奶或脱脂牛奶的重量比为1 20至30，发酵菌为短乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、 干酪乳杆菌、香肠乳杆菌、乳酸乳球菌、单孢酿酒酵母、东方伊萨酵母，各菌种之间的重量比为 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 1.0 至 1.2: 0. 2 至 0. 4: 0. 2 至 0. 4。
2.根据权利要求1所述的多菌发酵剂，其特征在于按下述步骤得到首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌后，其次冷却到42°C至45°C加入所需要量的发酵菌，然后在40°C至45°C恒温下发酵8小时至12小时得到多菌发酵剂。
3.种根据权利要求2所述的多菌发酵剂，其特征在于恒温下发酵5小时至12小时时至少搅拌两次。
4.一种根据权利要求1所述的多菌发酵剂的生产方法，其特征在于按下述步骤进行 首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌后，其次冷却到42°C至45°C加入所需要量的发酵菌，然后在40°C至45°C恒温下发酵8小时至12小时得到多菌发酵剂。
5.根据权利要求4所述的多菌发酵剂的生产方法，其特征在于恒温下发酵5小时至12 小时时至少搅拌两次。
6.根据权利要求4或5所述的多菌发酵剂的生产方法，其特征在于牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌的操作参数为加热90°C至95°C，保温10分钟至15分钟杀菌。
7.一种利用权利要求1或2或3所述的多菌发酵剂的用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品，其特征在于按下述原料发酵得到，按牛奶或脱脂牛奶总重量的3%至5%的比例添加上述制得的多菌发酵剂。
8.根据权利要求7所述的多菌发酵乳品，其特征在于按下述步骤得到第一步，首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶加热到50°C至60°C进行均质后经过巴氏杀菌，其次冷却到 40°C至45°C加入所需要量的多菌发酵剂，然后在40°C至45°C恒温下发酵6小时至8小时； 第二步，发酵结束后，在18°C至23°C恒温下成熟72小时至120小时；第三步，勻速搅拌1. 5 小时至2小时，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小时至2小时；第四步，分离乳清在 18°C至23°C下，经灭菌滤布过滤，分别得到乳酪和乳清，该乳清为多菌发酵乳品。
9.一种根据权利要求7所述的多菌发酵乳品的生产方法，其特征在于按下述步骤进行第一步，首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶加热到50°C至60°C进行均质后经过巴氏杀菌，其次冷却到40°C至45°C加入所需要量的多菌发酵剂，然后在40°C至45°C恒温下发酵6 小时至8小时；第二步，发酵结束后，在18°C至23°C恒温下成熟72小时至120小时；第三步，勻速搅拌1. 5小时至2小时，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小时至2小时；第四步，分离乳清在18°C至23°C下，经灭菌滤布过滤，分别得到乳酪和乳清，该乳清为多菌发酵乳品。
10.根据权利要求9所述的多菌发酵乳品的生产方法，其特征在于牛奶或脱脂牛奶经过巴氏杀菌的操作参数为加热90°C至95°C，保温10分钟至15分钟杀菌。
全文摘要
一种多菌发酵剂和用于抗动脉粥样硬化的多菌发酵乳品及其生产方法，该多菌发酵乳品按下述步骤得到第一步，首先将所需要量的牛奶或脱脂牛奶加热到50℃至60℃进行均质后经过巴氏杀菌，其次冷却到40℃至45℃加入所需要量的多菌发酵剂，然后在40℃至45℃恒温下发酵6小时至8小时；第二步，发酵结束后，在18℃至23℃恒温下成熟72小时至120小时；第三步，匀速搅拌1.5小时至2小时，抽提脂肪，剩余部分在50℃至60℃煮1小时至2小时；第四步，分离乳清在18℃至23℃下，经灭菌滤布过滤，分别得到乳酪和乳清，该乳清为多菌发酵乳品。本发明易操作、生产方法简单，所得多菌发酵乳品营养丰富，含有益生菌、ACE抑制肽、抗氧化肽等成份，具有抗动脉粥样硬化、调节血脂、抗炎、抗氧化等作用，能调节肠道菌群平衡，延缓人的衰老。
文档编号C12R1/25GK102286397SQ20111014929
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者刘红梅, 古丽孜娅·卡克巴依, 拉提帕·艾尔肯, 新华·那比, 沙依拉·哈马力拜, 王晓杰, 马春燕 申请人:新疆医科大学