专利名称：一种发酵肉制品的发酵剂及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵肉制品的发酵剂及其专用菌株。
背景技术：
发酵肉制品是指在自然或人工控制条件下，利用微生物发酵作用加工而成的一类肉制品，相对于一般肉制品而言，其不仅营养丰富、食用卫生安全强、货架期长，而且风味与质地独特。发酵肉制品起源于古代人们利用腌制与干燥方法保存肉类，伴随着一个多世纪以来冷藏、冷冻等现代食品贮藏技术的应用，发酵肉制品则逐渐演变成为一类传统特色肉制品。
低酸发酵肉制品是一类经过低温(≤22℃)发酵与干燥加工而成的，终产品pH值在5.5以上的发酵肉制品。该类产品不仅与高酸发酵肉制品一样具有营养丰富、食用安全性高、货架寿命长特点，而且因加工过程中碳水化合物降解率低、蛋白与脂肪酶解程度高，更具有口味柔和、风味浓郁等较为适合我国人民饮食消费习惯的特点。此外，法国、意大利、南斯拉夫、匈牙利的萨拉米肠，西班牙火腿、意大利Bresaola、巴西Charqui、西班牙Cecina、瑞士Bundnerfleisch等低酸发酵肉制品在欧洲国家也是主要的高档发酵肉制品。
虽然近些年来，欧美发达国家发酵肉制品生产获得了较大发展，但从目前生产技术状况看，应用商业化生产各类发酵剂与酸化剂实现人工控制发酵还仅限于高酸发酵肉制品生产方面，如何实现低酸发酵肉制品人工控制发酵，解决产品质量不稳定、加工周期长、加工成本高等的问题还处于探索阶段。总体上看，欧美发达国家低酸发酵肉制品生产仍处于以自然发酵为主的阶段，存在加工周期长、质量不稳定、生产成本高等不足，研究与开发低酸发酵肉制品发酵剂是低酸发酵肉制品生产发展亟待解决的重要科技问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种能用于低酸发酵肉制品生产的发酵剂及其专用菌株。
本发明所提供的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1已于2005年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1572。
此菌株为革兰氏阳性球菌，单个菌株直径小于1mm，呈单个或成双及不规则葡萄状排列，无芽孢，无夹膜，无鞭毛。
本发明所提供的低酸发酵肉制品的发酵剂，其活性成分为木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572。
发酵剂中木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572的含量为109-1011cfu/g，优选为1010cfu/g。
发酵剂是将木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572培养后离心，浓缩菌体加入冻干保护剂后，经冷冻干燥制得的；所述冻干保护剂配方为每100ml质量浓度为10-15％的脱脂乳中添加有2-4g甘油，1-3g维生素C，3-5g蔗糖和3-5g碳酸钙。
在上述制备过程中，浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为0.1-10∶1，优选为1∶1。
这里，木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572培养的培养基优选为每100ml麦芽汁培养基中添加0.3～1g葡萄糖、1～2g牛肉蛋白胨、0.1～0.6g牛肉膏、1～3gNaCl，pH为6.5-7.4；培养温度为15-25℃。培养后离心的温度0～4℃，离心转速为4000～6000rpm，离心时间为15～40min。
本发明通过筛选、纯化分离出一株具有高蛋白质酶解活性的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572，将该菌株加入冻干保护剂采用冷冻干燥方法可制备为干粉发酵剂，应用该干粉发酵剂来腌制生产低酸发酵肉制品，能有效缩短生产周期，大大提高产品质量和口感，并且，还能够实现低酸发酵肉制品的生产用发酵剂制备，具有良好的应用前景。
具体实施例方式
实施例1、高蛋白质酶解活性木糖葡萄球菌S1菌株(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572)的筛选1.备选菌株获取过程从北京华安肉类有限公司Bundnerfleisch风干牛肉生产加工过程的腌制阶段开始，第0，6，12，18(腌制阶段)，27，36，48(干燥阶段)天分别无菌获取肉样。从各时间取得的肉样中无菌称取25.0g样品，加入225mL无菌生理盐水中，均质30s，进行不同浓度稀释。然后将不同稀释度菌悬液接种于MRS与PCA+平板培养基中，在30℃二氧化碳培养箱中培养48h后，分别从最高稀释度的培养平板上随机挑取10个菌落，再移接到MRS与营养琼脂斜面培养基中，分别筛选得到乳酸菌、微球菌各70株。
2.备选菌株蛋白酶活性测定无菌吸取0.1ml所分离的140个菌株培养液，涂布均匀在添加有15％脱脂牛乳的MRS和营养琼脂固体培养基上，在30℃二氧化碳培养箱中培养48h。经过培养，若固体培养基上的菌落周围有透明环，则为阳性。然后比较140株菌形成的透明环大小，选择其中透明环最大者，即为本发明高蛋白质酶解活性菌株(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572)。
3.高蛋白质酶解活性木糖葡萄球菌S1菌株安全性测定采用GB4789.3-94～GB4789.14-94食品微生物学检验规定的沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠耶森氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡状芽孢杆菌检验方法检验高蛋白质酶解活性菌株S1的安全性，确定所选菌株安全无害，不属于国内外所限定的致病菌。
4.高蛋白质酶解活性木糖葡萄球菌S1菌株种属鉴定将木糖葡萄球菌S1经过多次纯化，然后采用美国BIOLOG公司Microstation型全自动快速微生物鉴定仪进行鉴定，经鉴定该菌株应属于木糖葡萄球菌。
5.高蛋白质酶解活性木糖葡萄球菌S1菌株可用性测定对菌株进行了耐盐性、耐亚硝酸盐性、蛋白酶活性、脂肪酶活性、抑菌活性等特性测定，发现该菌株具备肉品发酵剂菌种应具备的耐盐、耐亚硝酸盐、抑菌等所需特性。
实施例2、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572的发酵培养1、发酵培养基的确定将所得高蛋白质酶解活性木糖葡萄球菌S1菌株分别在液体营养琼脂培养基、西红柿汁培养基、胡萝卜汁培养基、麦芽汁培养基中进行培养，观察其生长情况，确定出其基础培养基为麦芽汁培养基。向基础培养基中添加牛肉蛋白胨、乳糖等增殖因子，观察木糖葡萄球菌S1菌株在其中的生长情况，通过测定菌株的增殖情况确定出有效的增殖因子，并以此设计正交试验，优化得到了S1菌株的复合增殖培养基的组成配方如下麦芽汁培养基中添加0.3～1％葡萄糖、1～2％牛肉蛋白胨、0.1～0.6％牛肉膏、1～3％NaCl。(这里％指g/100ml)
2、培养条件的确定将菌株在不同温度(10～25℃)、不同培养基起始pH值(5.5～7.5)、不同溶氧的条件下恒温培养，定时取样测定菌株的活菌数，确定了木糖葡萄球菌的适宜培养温度、培养基适宜pH值、溶氧情况及最佳收获期等培养条件温度15～25℃，培养基pH值6.5～7.4，摇床培养18～22h后离心收获菌体。
实施例3、干粉发酵剂的制备将培养好的菌种离心，去除离心上清液，然后，加入冻干保护剂进行冷冻干燥，即可以得到干粉发酵剂。
以下对冻干过程中的一些工艺条件进行优化1、离心条件的优化菌体富集培养后，研究了不同离心温度(0-25℃)、不同离心转速(3000-7500rpm)、不同离心时间(10～40min)等离心条件对菌株存活率影响，确定木糖葡萄球菌S1菌液的适宜离心条件为温度0～4℃，离心转速4000～6000rpm，离心时间15～40min。
2、冻干保护剂配方研究了S1菌株在添加甘油、维生素C等单因子保护剂的情况下冻干存活率的变化；并以筛选出的单因子保护剂为因素项，通过正交试验开展了不同保护剂及其剂量对S1菌株冻干存活率的影响，优化筛选出了S1菌株冻干保护剂的配方每100ml质量浓度为10-15％的脱脂乳中添加2～4g甘油、1～3g维生素C、3～5g蔗糖和3～5g碳酸钙。
3、冻干工艺冻干过程中，离心浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为0.1-10∶1，优选为等质量比。在冻干过程中，菌粉干燥至2～5％含水量时停止干燥，以利于保持菌种的活性。
一个具体的操作过程如下将木糖葡萄球菌S1菌株接种于pH值为7.0的复合增殖培养基中，接种量为1％，于20℃温度下摇床培养20h，然后经4℃、6000rpm、离心30min后，添加与浓缩菌体等质量的冻干保护剂，置于真空冷冻干燥机中，于-30℃，绝压4帕以下干燥24～26h，菌粉含水量降至2.5～3％时停止干燥，即得到干粉发酵剂。
所得干粉发酵剂活菌数量级可达1010cfu/g；在0～4℃贮存60天后，菌粉活菌数仍处于同一数量级，为2.19×1010cfu/g。
这里，麦芽汁复合增殖培养基配方为麦芽汁培养基中加入0.5％葡萄糖、1.5％牛肉蛋白胨、0.1％牛肉膏、1％NaCl。(％指g/100ml)冻干保护剂配方为每100ml质量浓度为12％的脱脂乳中添加3g蔗糖、1.5g维生素C、5g甘油、4g碳酸钙。
实施例4、干粉发酵剂的应用本发明的干粉发酵剂应用于Bundnerfleisch风干牛肉的生产中，可以缩短牛肉的生产周期，提高产品质量。具体发酵过程如下腌制液的配制将1000g食盐、50g葡萄糖、5g亚硝酸钠、150g香辛料溶于10L洁净水中，加热熬煮1.5-2.5小时后补充水分至10L并冷却至0-4℃保存，然后，在注入前加入实施例3所制备的干粉发酵剂100g，腌制液中菌量控制在108cfu/ml。
采用注入方法将菌量为108cfu/ml腌制液300g注入到1.5千克的新鲜冷分割小米龙牛肉中，在0～4℃温度下密封腌制2～3天，然后开始干燥初期干燥温度控制在16～22℃，相对湿度75～85％，干燥时间10～15天；后期干燥温度控制在55～65℃、相对湿度控制在50～60％，时间控制在2～3天。总体加工时间控制在15～20天，即得到Bundnerfleisch风干牛肉，产品pH值为5.60～5.80。
作为对比，采用常规方法来制备Bundnerfleisch风干牛肉，其加工工艺为在0-2℃条件下密闭腌制20天(百公斤腌制剂中食盐为87.25千克、葡萄糖为2.5千克、香辛料为10千克，亚硝酸钠为0.25千克，腌制剂用量为4千克/100千克牛肉)，腌制后在16～20℃、70％～85％相对湿度下干燥30～60天至失重30％，得到风干牛肉，产品pH值为5.70～5.90。
测定两种方法所制备的风干牛肉，结果表明，采用本发明发酵剂所制备的风干牛肉与常规方法所制备的风干牛肉相比，游离氨基酸总含量提高30％以上，游离谷氨酸含量提高60％、亮氨酸含量提高30％、异亮氨酸提高30％、苯丙氨酸含量提高25％以上，显著改进了Bundnerfleisch风干牛肉口感质量，可以实现低酸发酵肉制品的生产，并且可以大大缩短生产周期(生成时间从50天以上降低到16-22天左右)。
权利要求
1.木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572。
2.一种发酵肉制品的发酵剂，其活性成分为木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)S1 CGMCC № 1572。
3.根据权利要求2所述的发酵剂，其特征在于所述发酵剂中木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572的含量为109-1011cfu/g。
4.根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于所述发酵剂中木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572的含量为1010cfu/g。
5.根据权利要求2或3或4所述的发酵剂，其特征在于所述发酵剂是将木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572培养后离心，浓缩菌体加入冻干保护剂后，经冷冻干燥制得的；所述冻干保护剂配方为每100ml质量浓度为10-15％的脱脂乳中添加有2-4g甘油，1-3g维生素C，3-5g蔗糖和3-5g碳酸钙。
6.根据权利要求5所述的发酵剂，其特征在于所述浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为0.1-10∶1。
7.根据权利要求6所述的发酵剂，其特征在于所述浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为1∶1。
8.根据权利要求5所述的发酵剂，其特征在于所述木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572培养的培养基为每100ml麦芽汁培养基中添加0.3～1g葡萄糖、1～2g牛肉蛋白胨、0.1～0.6g牛肉膏、1～3gNaCl，pH为6.5-7.4；培养温度为15-25℃。
9.根据权利要求5所述的发酵剂，其特征在于木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)S1 CGMCC № 1572培养后离心的温度0～4℃，离心转速为4000～6000rpm，离心时间为15～40min。
全文摘要
本发明公开了一种发酵肉制品的发酵剂及其专用菌株。本发明所提供的发酵肉制品的发酵剂，其活性成分为木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC №1572。本发明通过筛选、纯化分离出一株具有高蛋白质酶解活性的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)S1 CGMCC № 1572，将该菌株加入冻干保护剂采用冷冻干燥方法可制备为干粉发酵剂，应用该干粉发酵剂腌制生产发酵肉，能有效缩短生产周期，大大提高产品质量和口感，具有良好的应用前景。
文档编号A23L1/31GK1807591SQ200610000820
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月11日 优先权日2006年1月11日
发明者孙宝忠, 田洪涛, 贾英民, 于辉, 马晓燕, 马爱进, 李海鹏, 种京华, 张守勇 申请人:中国农业科学院畜牧研究所