专利名称：利用减毒伤寒沙门菌递送的hbv-热休克蛋白70融合基因疫苗及制法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用减毒伤寒沙门菌递送的HBV突变型preC/C基因疫苗和一种HBV-热休克蛋白70融合基因疫苗及其制备方法和应用，具体为利用减毒伤寒沙门菌递送的一种HBV突变型preC/C基因疫苗、一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗和一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗及其制备方法和应用，属于乙肝疫苗的设计制造及免疫效果检测的生物学领域。
背景技术：
慢性乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段。乙肝病毒(HBV)感染人体后发生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答，不能清除体内病毒。由于DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势，已作为针对慢性乙肝 具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦点在于(I)如何诱导足够强的特异性细胞免疫，以达到抑制或消灭病毒、治疗乙肝的目的；(2)改良接种方式，易于为患者接受。使用分枝杆菌热休克蛋白70羧基端(HSP70c)或T细胞刺激表位(HSP70t)基因构建融合基因疫苗可以起到佐剂的作用，同时减少机体针对HSP70的免疫应答。利用携带DNA质粒的减毒伤寒沙门菌口服，可直接将DNA质粒递送至抗原呈提细胞，极大提高DNA疫苗的利用率，同时口服的免疫方式安全方便，易于为患者接受。本发明针对热休克蛋白融合基因疫苗和利用减毒伤寒沙门菌递送DNA疫苗的诸多特性和优点，采用现代分子生物学技术和手段对其进行了进一步的研究和改进。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种以HBV突变型preC/C基因为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VC)、一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VCC)和一种以HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VCT)。本发明的第二个目的在于提供一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVC)、一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVCC)和一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVCT)。首先将目的基因使用真核表达载体，构建质粒，然后采用电转化的方法，转化减毒伤寒沙门菌SL7207，得到携带目的基因的重组减毒伤寒沙门菌。本发明的第三个目的在于提供一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌、一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌和一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌用于乙型肝炎的预防和治疗。该重组减毒伤寒沙门菌能有效诱导特异性体液免疫和细胞免疫，可用于乙型肝炎的预防和治疗。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种HBV突变型preC/C基因疫苗(VC)，其包括HBV突变型preC/C基因(简称preC/C)，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。所述的HBV突变型preC/C基因是HBVpreC/C基因经人工引入4个点突变，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示。一种构建HBV突变型preC/C基因疫苗(VC)的方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示。
一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因疫苗，其包括HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因是HBV突变型preC/C_热休克蛋白70羧基端融合基因(简称preC/C-HSP70c)。即一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗(VCC)，其包括HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因。一种构建HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗(VCC)的方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示；再以含有分枝杆菌热休克蛋白70基因的质粒PT-HSP70为模板，PCR扩增热休克蛋白70羧基端基因，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，克隆筛选得到HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗质粒。所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因是HBV突变型preC/C_热休克蛋白70T细胞表位融合基因(简称preC/C-HSP70t)。即一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗(VCT)，其包括HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因。一种构建HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗(VCT)的方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示；再以含有分枝杆菌热休克蛋白70基因的质粒pT-HSP70为模板，PCR扩增热休克蛋白70T细胞表位基因，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，克隆筛选得到HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗质粒。一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVC)，其稳定携带如上所述的HBV突变型preC/C基因疫苗VC。一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌SVC的构建方法，其步骤如下使用电转化仪，将HBV突变型preC/C基因疫苗VC转化至减毒伤寒沙门菌SL7207，克隆筛选得到稳定携带VC的重组减毒伤寒沙门菌SVC。一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVCC)，其稳定携带如上所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗 VCC。一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌SVCC的构建方法，其步骤如下使用电转化仪，将HBV突变型preC/C-热休克蛋白70 羧基端融合基因疫苗VCC转化至减毒伤寒沙门菌SL7207，克隆筛选得到稳定携带VCC的重组减毒伤寒沙门菌SVCC。一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVCT)，其稳定携带如上所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗VCT。一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌SVCT的构建方法，其步骤如下使用电转化仪，将HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗VCT转化至减毒伤寒沙门菌SL7207，克隆筛选得到稳定携带VCT的重组减毒伤寒沙门菌SVCT。基于此，本发明人设计构建了一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌、一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌和一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌，用于乙型肝炎的防治。DNA疫苗载体选用质粒VR1012，为美国FDA已批准用于人体基因治疗的真核细胞表达载体，我国FDA近期也批准其作为HIV DNA疫苗载体用于人体，其具有多克隆位点包括Pst I和BamH I等，含有CMV启动子，卡那霉素抗性基因等。DNA疫苗递送载体选择减毒伤寒沙门菌SL7207，伤寒沙门菌株SL7207是aroA基因突变株，aroA编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，该酶催化2，4- 二羟基苯甲酸盐的分支酸途径的中间反应，产生芳香族氨基酸。而哺乳动物不具备该合成途径，故细菌从宿主体内获得这些化合物的可能性极小，使得aroA突变株在体外培养时依赖上述化合物生长，但在宿主体内只能有限生长繁殖从而得到减毒。应用该类重组减毒伤寒沙门菌作为疫苗递送载体，具有如下优点①具有培养简便、繁殖迅速等优越性；②可口服或鼻饲接种，方法简单无痛苦该疫苗株在体内产生的靶抗原的传送无需附加任何免疫佐剂；④将疫苗直接递送于抗原呈提细胞，极大提高疫苗生物利用率；⑤该类菌株可较长时间定居于肠相关淋巴组织，持续表达外源抗原，增强免疫原性，并可产生强大的黏膜免疫反应；⑥通过分子生物学技术便于构建成多价疫苗，易被接种人群接受；⑦一次免疫后在相当长时间内有效免疫用疫苗无需在体外产生、分离、纯化和鉴定对四环素敏感，如发生严重副作用可以用四环素控制。分别用VR1012 (对照组)、VC、VCC和VCT于0、7、14、21天肌注方式免疫BALB/C小鼠，同时分别用携带VR1012的重组减毒伤寒沙门菌SV(对照组)、SVC、SVCC和SVCT于O、7、14、21天灌胃方式免疫Balb/c小鼠。每次免疫前I天割尾取血分离血清行抗体效价测定，免疫结束后(第28天)取小鼠脾细胞用ELISpot方法检测特异性细胞免疫功能，证实6种疫苗(VC、VCC、VCT、SVCC^PSVCT)均能引发特异性体液和细胞免疫反应。本发明的优点是本发明改建了 HBV DNA-热休克蛋白70融合基因疫苗，同时改良了 DNA疫苗接种方法，采用口服减毒伤寒沙门菌的方式递送DNA疫苗。实验研究证实，SVC、SVCC组和SVCT组使小鼠肽刺激脾淋巴细胞中Y干扰素产生细胞数增多，与对应的VC、VCC组和VCT组相当。上述结果表明本发明构建的携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌SVC、携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌SVCC和携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌SVCT确实能诱导小鼠产生不错的体液免疫应答和细胞免疫应答。
下面通过附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
图I为突变型HBV preC/C基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图2为热休克蛋白70羧基端基因和热休克蛋白70T细胞表位基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图3为pGEM-T Easy/HBV preC/C PCR产物重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图。图4 为 pGEM-T Easy/HSP70c PCR 产物重组质粒和 pGEM-T Easy/HSP70tPCR 产物重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图。图5为重组质粒VC酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图。图6为重组质粒VCC、VCT酶切后琼脂糖凝胶电泳分析。图7为各重组减毒伤寒沙门菌提取质粒酶切结果。图8为重组减毒伤寒沙门菌SVC提取质粒酶切结果。图9为各组小鼠ELISpot检测脾淋巴细胞IFN-Y代表图，其中图9_1至图9_10依次为VR1012、VC、VCC、VCT、SV、SVC、SVCC, SVCT组、阳性对照孔和阴性对照孔的代表图。
具体实施例方式菌株、细胞、试剂及实验器材限制性核酸内切酶NEB公司LA Taq酶，T4 DNA连接酶宝生物公司pGEM-T Easy 载体Promega 公司X-gal、IPTG鼎国公司质粒小量提取试剂盒博大泰克生物公司DNA胶回收、纯化试剂盒Qiagen公司DNA Marker (Trans 2K plusDNA marker)全式金公司质粒大量提取试剂盒Qiagen公司
卡那霉素鼎国生物公司感受态Trans Tl菌博大泰克生物公司其余常用生化试剂(国产分析纯)上海华美生物公司等!fepG2细胞三〇二医院病毒研究室保存DMEM、RPMI 1640北京钮因华信公司胎牛血清GIBICO公司转染试剂-LipofectinInvitrogin 公司6孔细胞培养板美国Becton Dickinson Labware公司 IOml细胞培养瓶北京小鼠淋巴细胞分离液达科为公司小鼠IFN- Y ELISpot检测试剂盒MABTECH公司流式抗体BD公司HBeAg、HBeAb、HBcAb ELISA检测试剂盒北京科卫诊断试剂公司其余常用生化试剂为国产分析纯上海华美公司等主要仪器MJMini PCR 扩增仪美国 Bio-Rad 公司LG15-W高速微量离心机北京低温高速离心机日本HITACHI公司PH 仪Hanna 公司Gene-Ρ μ Iser 和 Gene-Ρ μ Ise-Controller美国 Bio-Rad 公司DYY-III型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂THZ-C电热恒温摇床江苏太仓仪器厂超净工作台北京哈东联设备厂SmartSpec Plus分光光度计美国Bio-Rad公司⑶2恒温孵箱德国Heraeus公司BHC-1360II A2型超净工作台北京哈东联仪器公司LD5-2A离心机北京通用离心机厂C02恒温孵箱德国Heraeus公司超净工作台北京哈东联ELlSpot酶联斑点分析仪北京赛智创业公司680 型 ELISA 读板机BI0-RAD 公司ZMX-988B全自动酶标洗板机北京天石医疗用品制作所实施例I. HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗和HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗的构建I、PCR扩增获得所需基因(I)PCR扩增获得HBV突变型preC/C基因以质粒VEC4作为模板，分别以上游引物 CF:5’ -CTGCAG IATGl CAACTTTTTCACCTC-3 (Pst I)，下游引物 CRl :5’ -TCTAGA jTCA丨ACATTGAGATTCCCGAGA-3’ (Xba I)或 CR2:5， - TCTAGAACATTGAGATTCCCGAGA-3， (Xba I )为引物，采用PCR方法扩增模板I μ I、引物(25μ Μ)各2μ l、10mM dNTP 2μ 1U0XPCRBuffer 5 μ I, LA Taq 酶 0· 5 μ I、H2O 37. 5 μ L，反应条件94°C预变性 5min — 94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环一72°C延伸lOmin。如图I所示，为突变型HBVpreC/C基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，获得的PCR产物HBV突变型preC/C基因(含或者不含终止密码子)片段，经I %琼脂糖凝胶电泳鉴定大小约640bp，符合预期长度，图I左侧为DNA Marker，右侧为HBV突变型preC/C基因片段。(2) PCR扩增获得热休克蛋白70羧基端基因和热休克蛋白70T细胞表位基因以质粒 pT-mtHSP70 为模板，分别以引物 HSPF :5’ - TCTAGA (GGAGGAGGAGGAAGT) 3GAGGTGAAAGAC
GTT-3’ (Xba I)+HSPRl :5，-GGATCC jTCA! CTTGGCCTCCCGGC-3，(BamH I)和 HSPF+HSPR2 :5’_
GGATCCItcaIAATGCCGTTGGCGTCG-3，(BamH I)为引物，PCR 扩增模板 2. 5 μ I、引物(25 μ Μ)各 2μ IUOmM dNTP 2 μ 1U0XPCR Buffer 5 μ I、LA Taq 酶 O. 5 μ I、H2O 36 μ 1，反应条件为94°C 预变性 5min — 94°C 变性 lmin，57°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min，共 10 个循环一94°C变性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸2min，共25个循环一72°C延伸lOmin。如图2所示，为热休克蛋白70羧基端基因和热休克蛋白70T细胞表位基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，获 得的PCR产物热休克蛋白70羧基端基因和热休克蛋白70T细胞表位基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小分别850bp和350bp，符合预期长度，图2左侧为DNAMarker，中间为热休克蛋白70羧基端基因，右侧为热休克蛋白70T细胞表位基因片段。2、重组质粒的构建(I)构建 pGEM-T Easy/PCR 产物重组质粒=PCR 产物 3 μ 1，pGEM-T Easy 载体1μ 1，2XBuffer 5 μ 1，T4DNA连接酶I μ 1，混匀后室温(20°C _25°C，下述室温均为此温度)放置lh，4°C过夜。(2) pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒转化感受态DH5 α菌_60°C保存，取出后置冰浴中备用。上述连接产物共10μ I加入ΙΟΟμ I感受态细菌中(同时设阳性及阴性对照)轻轻混匀，冰浴 30min，42°C热激 30sec，冰浴 2min,加 LB 400μ 1,37°C 250rpm 摇床 lh，取100 μ I转化菌涂于含氨苄青霉素(25 μ g/ml)、X-gal和IPTG的固体LB培养板，待表面液体晾干后，将培养板倒置于37°C孵箱中培养过夜(12-18h)。(3)pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒克隆筛选及扩增提取挑取培养板中阳性菌落，置于3ml含氨苄青霉素(25 μ g/ml)的LB中，37°C 250rpm摇床过夜(12_18h)。取I. 5ml菌液提取质粒，使用博大泰克B型小量质粒快速提取试剂盒，按说明书操作，步骤如下①用干净的I. 5ml离心管收集约I. 5ml菌液,室温12，OOOrpm离心3min ;弃尽上清；②加入100 μ I溶液I (含RNase Α)，震荡充分悬浮细菌；③加入150 μ I溶液2，上下颠倒混匀，静置Imin ；④加入150 μ I溶液3,上下颠倒混勻，静置5min,室温12，OOOrpm离心5min ；⑤吸附柱置于2ml离心管中，吸附柱中加入420 μ I结合缓冲液，将步骤④取得的上清小心移入，混勻后室温静置lmin,室温12，OOOrpm离心lmin,弃去液体；⑥加入700 μ I漂洗液(已用乙醇稀释)，室温12，OOOrpm离心30sec，弃去液体；⑦重复步骤⑥；⑧空管室温12，OOOrpm离心2min ；⑨取出吸附柱置于干净的1.5ml离心管中，加入50μ1 EB溶液，室温静置l_2min ；⑩室温12，OOOrpm离心lmin收取液体。(4)pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒酶切，回收目的片断用M13、M13R引物测序pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒，确认连接片断为所需目的基因后，分别使用Pst I+Xba I和Xba I+BamH I双酶切，37°C水浴2h。如图3、图4所示，分别为pGEM_T Easy/HBV preC/CPCR产物重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图，及pGEM-T Easy/HSP70c PCR产物重组质粒和pGEM-T Easy/HSP70tPCR产物重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图。pGEM_T Easy/PCR产物重组质粒，经双酶切后琼脂糖凝胶电泳分析，左侧为DNA Marker,右侧为pGEM_TEasy/PCR产物重组质粒酶切，上方条带为载体pGEM_T Easy，下方条带为各目的基因片断。图3中，pGEM-T Easy/HBV preC/C PCR产物重组质粒，经Pst I、Xba I酶切后琼脂糖凝胶电泳分析，左侧为DNA Marker，右侧为pEASY-T ISimple/HBV preC/C PCR产物重组质粒酶切，上方条带为载体pGEM-T Easy, 3015bp,下方条带为HBV preC/C片断,640bp。图4中，pGEM-T Easy/HSP70c PCR 产物重组质粒和 pGEM-T Easy/HSP70tPCR 产物重组质粒，经 BamH
I、Xba I酶切后琼脂糖凝胶电泳分析，左侧为DNA Marker，右侧为重组质粒酶切，上方条带为载体 pEASY-TlSimple，3015bp，下方条带为 HSP70c 或 HSP70t 片断，800bp、350bp。使用DNA纯化试剂盒纯化回收，步骤如下①酶切产物100 μ I加入琼脂糖凝胶加样孔中。②电压80V，电泳 15min。③紫外线灯下切胶，取酶切片断，称重。④加等量(mg/ml)MembraneBinding Solution,6CTC水浴 lOmin。⑤加样至吸附柱，室温12000rpm离心2min,弃离心液。⑥加700 μ I Membrane Wash Solution, 12000rpm 离心 lmin,弃离心液。⑦加500 μ I Membrane Wash Solution, 14000rpm 离心 3min,弃离心液。⑧加无菌去离子水50 μ l，12000rpm离心lmin，洗脱目的片段DNA。(5)构建重组质粒VC、VCn (VCn不含终止密码子)Pst I.BamH I双酶切载体VR1012，按照步骤(4)回收约5000bp的载体片段。连接回收的酶切约640bp目的片段和酶切载体片段T4DNA连接酶I μ 1，IOXBufferl μ 1，酶切片断+酶切载体共8μ I (根据电泳结果评估载体与酶切片断浓度，按片断载体 3 I比例加样)。连接产物10 μ 1，按前述方法转染感受态菌，涂于含卡那霉素的半固体LB培养板上，37°C孵育12-18h后挑取阳性菌落，加入3ml含卡那霉素的液体LB37°C培养12_18h。按前述方法提取质粒，如图5所示，为重组质粒VC酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图，载体VR1012插入基因片段为突变型HBV preC/C，经限制性核酸内切酶Pst I.BamH I双切后，琼脂糖凝胶电泳分析确认酶切片断大小为4913bp和640bp，证实连接片断为所需目的基因，左侧为DNA Marker ;右侧为重组质粒VC和VCn酶切，上方条带为载体VR1012，下方条带为突变型HBV preC/C片断。电泳分析确认酶切大小正确后测序，其核酸及氨基酸序列结果与模板序列完全一致。HBV突变型preC/C的核苷酸序列如序列表中的序列I所示。(6)构建重组质粒VCC、VCT Xba I、BamH I双酶切VCn，按照步骤(4)回收约5000bp的片段。按照步骤(5)分别连接回收的酶切约850bp、约350bp目的片段和酶切载体片段T4DNA连接酶I μ 1，IOXBuffer I μ 1，酶切片断+酶切载体共8 μ I (根据电泳结果评估载体与酶切片断浓度，按片断载体 3 I比例加样)。连接产物10 μ 1，按前述方法转染感受态菌，涂于含卡那霉素的半固体LB培养板上，37°C孵育12-18h后挑取阳性菌落，加入3ml含卡那霉素的液体LB37°C培养12-18h。按前述方法提取质粒，如图6所示，为重组质粒VCC、VCT酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图，载体VR1012插入基因片段为突变型HBV preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因和突变型HBV preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因，经限制性核酸内切酶Pst I.BamH I双切后，琼脂糖凝胶电泳分析确认酶切片断大小分别为4913bp和1500bp、IOOObp,证实连接片断为所需目的基因，中间为DNAMarker ;左侧为重组质粒VCC酶切，上方条带为载体VR1012，下方条带为突变型HBV preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因片断；右侧为重组质粒VCT酶切，上方条带为载体VR1012，下方条带为突变型HBVpreC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因片断。电泳分析确认酶切大小正确后测序，其核酸及氨基酸序列结果与模板序列完全一致。HBV突变型preC/C-HSP70c的核苷酸序列如序列表中序列2所示，HBV突变型preC/C-HSP70t的核苷酸序列如序列表中序列3所示。3、重组质粒VC、VCC、VCT的大量提取 使用QIAGEN公司大量提取质粒试剂盒(mega kit)提取重组质粒,步骤如下(I)将测序正确的质粒所对应的菌液Iml转入含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培养液 500ml 中，37°C摇床 300rpm 摇振 12_16h ；(2) 6000 Xg 4°C离心 15min 收获细菌；(3)加Buffer Pl 50ml充分重悬细菌，加入Buffer P2 50ml，颠倒4-6下混匀，室温放置5min,再加Buffer P3 50ml,颠倒4_6下混勻，冰浴30min ;(4) 20000 Xg以上4°C离心30min，上清移入干净离心管，再20000 X g以上4°C离心15min,将上清依靠重力过柱(吸附柱Buffer QBT 35ml预处理)；(5) Buffer Qff 200ml 过柱，漂洗；(6) Buffer QF 35ml 过柱，洗脱 DNA ；(7)加入24. 5ml异丙醇，混匀，立刻以上4°C离心30min ；(8)加入7ml 70%乙醇，混悬后15000 Xg室温离心lOmin，小心弃去上清；(9)加500 μ I去离子水溶解DNA，精密分光光度仪测浓度及260/280nm比值。实验例I. VR1012、VC、VCC和VCT的真核细胞转染I、真核细胞转染HepG2细胞复苏，2次传代后以IO5细胞/孔的浓度加入I块六孔培养板，用质粒VCC, VCT各转染2孔，另2孔作空白对照，严格按转染试剂说明书操作(I)无菌条件下2 μ g质粒溶于100 μ I无血清及抗生素的DMEM中；2 μ I转染试剂Lipofectin溶于100 μ I无血清及抗生素的DMEM中，室温静置30_45min。将质粒复合物滴加到转染试剂复合物中，边滴加边混匀，室温放置15-20min。(2)弃去6孔板里的培养基，并使用2ml无血清及抗生素的DMEM洗I次，弃去培养基。(3)向质粒-转染试剂复合物中加入O. 8ml无血清及抗生素的DMEM，混匀后滴加到六孔板对应的孔中。⑷37°C CO2孵箱中培养4h后，使用2ml含抗生素和血清的DMEM置换原有的培养基，继续37 °C CO2孵箱中培养至满48h。(5)细胞至于冰上，加少量PBS后用细胞刮收集细胞，1000 Xg离心3min后弃上清，加PBS200 μ I混悬细胞，冻融3次后取上清(细胞裂解液)。2、ELISA 检测 HBeAg :使用乙肝HBeAg检测试剂盒(酶联免疫法):检验方法(I)加样及酶每次实验设空白对照I L，阴、阳性对照各2孔。在各孔依次加入待检标本及阴、阳性对照50 μ I，每一标本加2孔，然后每孔加酶结合物50 μ I (空白对照孔不加)，混匀，贴上不干胶标签，置37 °C避光温育30min。(2)洗板弃去反应孔内液体，将20倍洗涤液用蒸馏水稀释20倍后注满各孔，静 置10-20S，甩掉洗涤液，重复洗板共5次，最后拍干。(3)显色依次在每孔加显色剂A液、B液各50μ 1，混匀，置37°C避光温育lOmin。(4)终止依次在每孔加终止液50 μ I，混匀。(5)测定用酶标仪对空白孔调零，单波长450iim读取各孔的OD值。取2孔均值为该标本检测值。参考值(I)阴性对照OD平均值< O. I且阳性对照OD平均值彡O. 8时实验正常，否则为实
验无效。(2)临界值(cutoff值)计算临界值(cutoff值)=阴性对照OD平均值X 2. I注阴性对照OD平均值低于O. 05时，按O. 05计算，高于O. 05时按实际计算。检测结果的解释待检标本OD值彡临界值(cutoff值)者，为阳性。待检标本OD值<临界值(cutoff值)者，为阴性。表I ELISA法检测细胞冻融上清液中的HBeAg OD均值
VR1012 VCVCCVCT阳性对阴性对
眧眧
OD 值 0·061±0·005 0.198±0.01 0.145±0.00 0.144±0.00 3.496 0.061
3I3本实施例将构建好的VC、VCC、VCT质粒分别转染真核细胞，体外培养48h后采用ELISA法检测细胞裂解液，结果二者均成功表达各自的目的蛋白。通过本实施例，我们验证了 VCC、VCT在真核细胞能够成功表达预期蛋白，为进一步免疫动物，了解该疫苗刺激机体产生特异性免疫的能力打下了基础。实施例2.分别携带VR1012、VC、VCC、VCT的重组减毒伤寒沙门菌的构建使用电转化仪，将VR1012、HBV突变型preC/C基因疫苗、HBV突变型preC/C_热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗转化至减毒伤寒沙门菌，克隆筛选得到稳定携带VR1012、HBV突变型preC/C基因疫苗、HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗的重组减毒伤寒沙门菌。I、电感受态减毒伤寒沙门菌的制备(I)使用2. 5ml培养物(静止期)接种250ml无抗生素的液体LB，37°C培养至菌液 0D600 = O. 6。(2)冰浴30min，2500Xg、4°C离心15min，使用冰预冷的水重悬沉淀。(3)再次离心后，小心弃去上清，使用O. 4倍体积的冰预冷的水重悬沉淀。(4)再次离心，使用O. 02倍体积的冰预冷的10%甘油重悬沉淀。(5)最后一次离心，然后用O. 002倍体积的冰预冷10%甘油重悬。
(6)按每管40ul分装，并使用液氮冻结，_80°C保存。2、电感受态细胞的转化(I)感受态细胞在冰上溶解，加入Iug重组质粒，轻轻混合后转入电转杯中。(2)使用 Gene-Pulser 和 Gene-Puls-Controller 进行转化。设置为25uF,2. 5KV,200 Ω。(3)电击后，立即加入400ul预热至室温的LB培养基，37°C摇床培养lh。(4)取IOOul菌液涂布于含硫酸卡那霉素的LB平板，37°C培养16_18h。3、重组减毒伤寒沙门菌的鉴定挑取单克隆菌落转接于3ml含硫酸卡那霉素的液体LB，37°C摇床培养8-10h后，提取质粒行酶切鉴定并送测序。SVC、VCC, SVCT测序结果与预期完全一致。图7为各重组减毒伤寒沙门菌提取质粒酶切结果，左侧为DNA Marker，右侧为重组减毒伤寒沙门菌SV、SVCC, SVCT提取质粒后经Pst I、BamH I双酶切后结果，上方条带为载体 VR1012，约 4911bp，下方条带为无条带，1500bp 的 HBVpreC/C+HSP70c，IOOObp 的 HBVpreC/C+HSP70to图8为重组减毒伤寒沙门菌SVC提取质粒酶切结果，左侧为DNA Marker，右侧为重组减毒伤寒沙门菌SVC提取质粒后经Pst I、BamH I双酶切后结果，上方条带为载体VR1012，约 4911bp，下方条带为 640bp 的 HBV preC/C。结果如图7、图8所示，SV、SVCC、SVCT、SVC提取质粒经Pst I+BamH I双酶切后琼脂糖凝胶电泳，SV、SVCC, SVCT和SVC提取质粒酶切后，上方可见约4911bp的VR1012载体条带，下方依次为无条带、约1500bp、IOOObp和640bp的条带。通过本实施例，我们成功构建了能够分别携带各质粒的重组减毒伤寒沙门菌SV、SVC、SVCC、SVCT。实验例2. SVC、SVCC和SVCT的免疫效果研究I、免疫动物48只雌性6 8周龄Balb/c小鼠，18 25克，SPF级。随机分为8组，每组6只。参见表2，第I组和第5组为对照组，其余是实验组。免疫方式为肌肉注射组取DNA质粒ΙΟΟμ I(IOOyg)双侧胫骨前肌注射(每侧50μ 1)，口服减毒沙门菌组为菌液ΙΟΟμ I(IXlO9CFU)灌胃。免疫流程为每周免疫I次，口服减毒沙门菌组免疫当天至免疫后Ih禁食，各组每次免疫前I天割尾取血100 μ I分离血清。末次免疫后I周摘眼球取血后断颈处死小鼠，分离血清及取脾进行检测。
表2动物实验分组和免疫程序
权利要求
1.一种HBV突变型preC/C基因疫苗，其包括HBV突变型preC/C基因，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。
2.—种构建HBV突变型preC/C基因疫苗的方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒。
3.—种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因疫苗，其特征在于其包括HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。
4.根据权利要求3所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因疫苗，其特征在于所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因是HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因。
5.权利要求4所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因疫苗的构建方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒；再以含有分枝杆菌热休克蛋白70基因的质粒pT-HSP70为模板，PCR扩增热休克蛋白70羧基端基因或热休克蛋白70T细胞表位基因，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，克隆筛选得到HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗质粒或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗质粒。
6.一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌，其特征在于其稳定携带HBV突变型preC/C基因疫苗。
7.权利要求6所述的携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌的构建方法，其步骤如下使用电转化仪，将HBV突变型preC/C基因疫苗转化至减毒伤寒沙门菌，克隆筛选得到稳定携带HBV突变型preC/C基因疫苗的重组减毒伤寒沙门菌。
8.一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因的重组减毒伤寒沙门菌，其特征在于其稳定携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗。
9.权利要求8所述的携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌的构建方法，其步骤如下使用电转化仪，将HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗转化至减毒伤寒沙门菌，克隆筛选得到稳定携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗的重组减毒伤寒沙门菌。
10.一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌、一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌和一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌在制备治疗和预防乙型肝炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种利用减毒伤寒沙门菌递送的HBV突变型preC/C基因疫苗和HBV-热休克蛋白70融合基因疫苗及制备方法和应用。其分别包括突变型HBVpreC/C基因与HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因，目的基因的真核细胞表达载体均为VR1012。首先将目的基因使用真核表达载体，构建质粒，然后采用电转化的方法，转化减毒伤寒沙门菌SL7207，得到携带目的基因的重组减毒伤寒沙门菌。该重组减毒伤寒沙门菌能有效诱导特异性体液免疫和细胞免疫，可用于乙型肝炎的预防和治疗。
文档编号C12N15/51GK102805872SQ20111014919
公开日2012年12月5日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者貌盼勇, 刘泽, 辛绍杰, 胡燕, 白冰珂, 沈宏辉, 高蓉, 侯俊, 王志杰, 罗声栋, 柴艳涛 申请人:中国人民解放军第三〇二医院, 北京绿竹生物制药有限公司