专利名称：一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种表达植物抗 性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。
背景技术：
目前全世界毎年因为病虫害而损失的粮食达数亿吨，直接经济损失达数十亿美元，随着人口的不断增长，粮食安全仍然是待解决的一大难题。生物农药与化学农药相比，起作用的是生物活性或产生的活性物质，相对具有无残留、无污染，对环境更加友好的优势，能兼顾生态平衡，且病虫害不容易产生抗药性。由于生物防治能克服化学农药的种种弊端而成为被优先采用的方法，受到了国际社会的极大关注。生物防治菌能够通过各种不同的机制抑制病原菌的生长，故而在学术研究和エ业生产中，都引起了广泛的重视，且被普遍认为是能够替代多种化学农药的最具希望和潜力的生防因子。生防菌通过多种机制包括重寄生作用、溶菌作用、抗生素作用，以及对空间和营养的竞争等达到防治植物病原菌的目的。来源于绿木霉的植物抗性诱导因子已被纯化，该植物抗性诱导因子具有植物抗病作用但目前其编码基因在丝状真菌中表达量较低，纯化后的产量约为150 μ g/L，无法满足其研究与应用。
发明内容
本发明是要解决目前绿木霉的植物抗性诱导因子基因表达量低，无法满足其研究与应用的问题，提供一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。本发明表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，按以下歩骤进行一、将棘孢木霉接种到PDA培养基中进行培养，3天后将孢子用无菌水清洗，接入PDA液体培养基中，28 °C培养3天后离心收集菌丝，用Trizol提取菌丝的总RNA，然后用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ;ニ、以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因EplT4，对目的基因EplT4进行测序鉴定；三、将目的基因EplT4与质粒载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI进行双酶切，将酶切后的目的基因EplT4和酶切后的质粒载体pPIC9K连接，构建重组载体pPIC9K-EplT4 ;四、将重组载体pPIC9K_EplT4转化大肠杆菌ToplO，挑选转化子进行菌落PCR验证，用质粒提取试剂盒提取阳性转化子的质粒，然后将质粒用SalI酶进行单酶切线性化，并将线性化片段进行回收；五、用毕赤酵母GS115制备毕赤酵母感受态细胞，将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混合，电击转化，获得转化细胞；六、将转化细胞涂在MD平板培养基上，于30°C培养至长出重组菌，将重组菌分别转接到含梯度浓度G418抗生素的MD平板培养基上，于30°C培养，在最高浓度G418抗生素的培养基上生长的菌落，即为毕赤酵母基因工程菌株Pp_EplT4 ;其中步骤ニ中PCR扩增所用上游引物Pa为5' -CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3 '，下游引物 Pb 为 5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3 ';步骤四中菌落 PCR 所用上游引物 Pc 为5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'，下游引物 Pd 为 5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。本发明的有益效果本发明方法获得的毕赤酵母基因工程菌株Pp_EplT4可高效表达棘孢木霉的植物抗性诱导因子基因(EplT4)，表达量为20mg/L。本发明从三个层面来证明EplT4能诱导大豆产生抗病性的问题。首先，在基因水平上，EplT4能够诱导大豆的病原相关蛋白基因表达量的上调，几丁质酶，葡聚糖酶等基因的高表达，能有效抑制外来病源的侵染；其次，在生理生化水平上，植物抗性反应的前期是产生过氧化氢和植物抗毒素(往往与产生荧光相关联)，EplT4能分别诱导大豆叶片产过氧化氢和荧光现象说明，大豆已经产生诱导抗性；最后，在抗病原菌水平上，EplT4能抑制大豆灰斑病在叶片上的发病情况，这说明它提高大豆对灰斑病的抗病能力。
图I为具体实施方式
一中分子筛层析后得到的吸收峰图；图2为具体实施方式
一中SDS-PAGE电泳图；图3为具体实施方式
一中实时定量PCR检测病原相关蛋白的基因表达量结果；图4为EplT4蛋白诱导大豆叶片产H2O2結果；图5为H2O诱导大豆叶片产H2O2结果；图6为实验组荧光检测结果；图7为阴性对照组荧光检测结果；图8为阳性对照组荧光检测結果；图9为经EplT4蛋白、水杨酸(SA)和水处理的叶片的病斑生长情况比较图；图10为图9中病斑损伤区域比率的柱状图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、将棘孢木霉接种到PDA培养基中进行培养，3天后将孢子用无菌水清洗，接入PDA液体培养基中，28 °C培养3天后离心收集菌丝，用Trizol提取菌丝的总RNA，然后用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ;ニ、以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因EplT4，对目的基因EplT4进行测序鉴定；三、将目的基因EplT4与质粒载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI进行双酶切，将酶切后的目的基因EplT4和酶切后的质粒载体pPIC9K连接，构建重组载体pPIC9K-EplT4 ;四、将重组载体pPIC9K_EplT4转化大肠杆菌ToplO，挑选转化子进行菌落PCR验证，用质粒提取试剂盒提取阳性转化子的质粒，然后将质粒用SalI酶进行单酶切线性化，并将线性化片段进行回收；五、用毕赤酵母GS115制备毕赤酵母感受态细胞，将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混合，电击转化，获得转化细胞；六、将转化细胞涂在MD平板培养基上，于30°C培养至长出重组菌，将重组菌分别转接到含梯度浓度G418抗生素的MD平板培养基上，于30°C培养，在最高浓度G418抗生素的培养基上生长的菌落，即为毕赤酵母基因工程菌株Pp_EplT4 ;其中步骤ニ中PCR扩增所用上游引物Pa为5' -CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3 '，下游引物 Pb 为 5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3 ';步骤四中菌落 PCR 所用上游引物 Pc 为、5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'，下游引物 Pd 为 5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。本实施方式步骤六中MD平板培养基由13. 4g/L的酵母基本氮源、O. 4mg/L的生物素、20g/L的葡萄糖和蒸馏水组成。本实施方式步骤六所述含梯度浓度G418抗生素的培养基中G418抗生素浓度为O. 5mg/mL> I. 0mg/mL、2. 0mg/mL、3. Omg/mL 和 4. Omg/mL,其中 G418 抗生素浓度为 4. Omg/mL的培养基中菌落无法长出，G418抗生素浓度为3. Omg/mL的培养基中有少许菌落长出，为能够长出菌落的最高浓度G418抗生素的培养基，因此在G418抗生素浓度为3. Omg/mL的培养基中生长的菌落即为毕赤酵母基因工程菌株Pp_EplT4。步骤一所述棘抱木霉为棘抱木霉(Trichoderma asperellum)T4,已在《Expressed sequence tags—based identification of genes in a biocontrol strain Tricnodermaasperellum》(《通过表达序列标签在生物防治菌棘孢木霉鉴定基因》，Mol BiolRep (2010) 37 =3673-3681)文章中公开，并且保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC3. 14975。本实施方式步骤一中Trizol购自Invitrogen公司，Trizol提取RNA的方法參照Trizol说明书；步骤一中反转录试剂盒为购自Takara公司(宝生物工程有限公司)的RNAPCRKit Ver. 3. O ;步骤ニ中使用的胶回收试剂盒为购自Takara公司的Agarose Gel DNAPurification Kit (琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒)；步骤三所用质粒载体pPIC9K和步骤五所述毕赤酵母GS115均购自于Invitrogen公司；步骤四所述大肠杆菌ToplO购自Takara公司。本实施方式步骤五中用毕赤酵母GS115制备毕赤酵母感受态细胞的方法具体參照Invitrogen公司提供的毕赤酵母表达操作手册·。本实施方式步骤ニ中对目的基因EplT4进行测序鉴定的具体操作方法为将目的基因EplT4与TA克隆载体pMD18-T (购买自TaKaRa公司)进行连接，连接方法參照TaKaRaPMD18-T Vector试剂盒说明书，获得连接产物；采用CaCl2法制备大肠杆菌ToplO感受态细胞；将连接产物在大肠杆菌ToplO感受态细胞在无菌条件下混匀，用热激法转化，加入LB培养基，37°C摇床180r/min振荡培养lh，将菌液涂布于含Amp、IPTG、X-GaI的LB平板上进行蓝白斑筛选，用无菌牙签挑取白色菌落于3mL的LB培养基中，置于摇床37°C摇床180r/min振荡过夜培养，然后以菌液为模板，进行阳性克隆的PCR鉴定，反应结束后取5 μ L PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；将鉴定结果为阳性的菌液送至测序公司进行测序；将测序结果用DNAman软件与cDNA文库中的序列进行比对，两者除信号肽和C端的6个His标签外，相似性达100%，可以确定该基因为棘孢木霉的植物抗性诱导因子基因(EplT4)，EplT4基因的喊基序列如SEQ ID NO I所不。步骤五中将线性化片段与感受态细胞混合，电击转化的具体操作方法为将80 μ L毕赤酵母感受态细胞和IOyg线性化片段混合均匀，得混合液，然后把混合液转移入预先冰浴的转化杯中，冰浴5分钟，然后用Eppendorf电转化仪在1100V电压下电击转化，接着立即往转化杯中加入ImL冰浴的IM山梨醇，然后把转化杯中液体转入ー个新的I. 5mL离心管中，30°C静置培养I 2h。为验证本实施方式获得的毕赤酵母基因工程菌株Pp_EplT4的蛋白表达量及EplT4蛋白的功能，进行以下实验(实验中所用大豆的品种为绥农10号，购买自黑龙江省农业科学院)I、对EplT4蛋白进行纯化将本实施方式获得的毕赤酵母基因工程菌株Pp_EplT4在基础盐培养基(配方參照Invitrogen公司的《毕赤酵母发酵过程指南》Pichia Fermentation ProcessGuidelines)中培养48h，1%甲醇诱导培养48h，收集培养基上清，在80 %饱和度的硫酸铵过夜沉淀。于8000r/min离心,将沉淀用平衡缓冲液溶解,用His_bind column (Madison,WI，USA)进行初步纯化。将洗脱缓冲液用NH4CO3透析过夜，得到的产物用Superdex 200进行分子筛层析，分子筛层析后得到的吸收峰图如图I所示，SDS-PAGE电泳图如图2所示，图2中M为蛋白marker, I为纯化前的培养基上清浓缩液,2为经镍柱纯化后的结果,3为SuperdeX200进行分子筛层析后的结果。可见，经两步纯化后，得到较纯的单一条带，为纯度较高的EplT4单体。植物抗性诱导因子(EplT4)基因表达量为20mg/L。2、用EplT4蛋白诱导大 叶片，检测大 病原相关蛋白基因表达量
对培养14d的大豆无菌苗叶片喷洒约50 μ g EplT4蛋白，12小时后，提取大豆叶片的RNA，反转录，进行实时定量PCR检测病原相关蛋白的基因表达量，结果如图3所示。β_1，3葡聚糖酶(Glu)、几丁质酶III(Chi III-A)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)、过氧化物酶(Peroxidase)的表达,均受EplT4蛋白的诱导,说明EplT4蛋白能在基因水平上影响大豆的抗病性。3、用EplT4蛋白诱导大豆叶片，检测大豆产H2O2和荧光反应由于植物产生H2O2和荧光是病原诱导的早期反应，因此常用检测这两种现象说明植物产生抗性反应。将培养14d的大豆无菌苗叶片用无菌针处理小伤ロ，实验组在伤ロ处喷洒约20yg EplT4蛋白；阴性对照组在伤ロ处喷洒H20。12小时后，加入3，3' -diaminobenzidine (DAB)(该试剂在H2O2下会形成红褐色沉淀)，阴性对照组的结果如图4所示，实验组结果如图5所示。可见图5中形成红褐色沉淀，这说明了通过毕赤酵母表达的EplT4能诱导大豆叶片产生H2O2。植物产生植物抗毒素等物质时，常常与产荧光相关联，因此对大豆叶片产荧光进行检测。将培养14d的大豆无菌苗叶片用无菌针处理小伤ロ，实验组在伤ロ处喷洒约20 μ gEp 1T4蛋白；阴性对照组在伤ロ处喷洒H2O ；阳性对照组在伤ロ处喷洒 2,6-dichloroisonicotinic acid(INA ；50nmol) ; 12 小时后用突光显微镜 OlympusBX-51fluorescent microscope进行观察。实验组突光检测结果如图6所示，阴性对照组突光检测结果如图I所示，阳性对照组荧光检测结果如图8所示(图6至图8中，上面为可见光，下面为荧光)。结果表明EplT4和阳性对照(INA)均能诱导叶片产生荧光，而H2O不能诱导大豆叶片产生荧光。4、经诱导的大豆对大豆灰斑病的抗病性检测大豆灰斑病是世界性病害，可使大豆减产甚至绝产，在黑龙江省比较严重，因此对大豆灰斑病的抗性进行了检测。将培养14d的大豆无菌苗叶片用无菌针处理小伤ロ，在伤ロ处喷洒约20 μ g蛋白，然后接种约IO4个大豆灰斑病(Cercosporidium sofinum) 15号生理小种的孢子，在60%的湿度,27°C下培养14天,对叶片进行拍照，并用Image ProPlus6. O软件对病斑面积进行统计，结果如图9和图10所示，经EplT4和水杨酸(SA，做阳性对照)处理的叶片的病斑比例与用H2O处理的有显著性差异。这说明EplT4能诱导大豆产生抗病性，并提高其对大豆灰斑病的抗病能力。所述大豆灰斑病(Cercosporidiumsofinum) 15号生理小种购买自黑龙江省农业科学院。
具体实施方式
ニ 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤ニ中PCR扩增的
反应体系如下
成分用量
cDNA2μ
ΙΟμΜ 引物 PaΙμ
ΙΟμΜ 引物 PbΙμ
IOxEx Taq 缓冲液2μL
IOmmo 丨/LdNTP2μ
5 U/mL Ex Taq DNA 聚合酶O. I μL
无菌水ΙΙ.9μ PCR 扩增条件为94°C变性 5min，94°C变性 30s，54°C退火 30s，72°C延伸 2min，共30个循环，再72°C延伸7min，4°C保温。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或ニ不同的是步骤三中目的基因EplT4的双酶切反应体系如下
成分用量
目的基因EplT44μL
限制性内切酶尺丨0.5μ
限制性内切酶NotlI μι
WxBamH. I buffe2μL
无菌水]2.5μ 酶切反应条件16°C酶切过夜。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤三中质粒载体PPIC9K的双酶切反应体系如下
成分用量
质粒载体pPIC9K4pL
限制性内切酶EcoR I0.5μ
限制性内切酶MWIΙμ
\I buffe2μ
无菌水12.5μ
酶切反应条件16°C酶切过夜。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤三中连
接反应体系如下
成分用量
IOxT4 DNA连接酶缓冲液2pL
酶切后的目的基因Ερ1Τ46μΙ.
酶切后的质粒载体pPIC9K4|iL
T4DNA 连接酶1.5μ
无菌水8.5pL连接反应条件16°C连接过夜。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤四中PCR扩增的反应体系如下
成分用量
单菌落
ΙΟμΜ 引物 Pc2μ
ΙΟμΜ 引物 Pd2μ
IOxEx Taq 缓冲液2μ
2mM dNTP2μΙ
5 U/mL Ex Taq DNA 聚合酶0.5 pL
无菌水11.5μ PCR 扩增条件为94°C变性 5min，94°C变性 30s，54°C退火 30s，72°C延伸 2min，共28个循环，再72°C延伸7min，12°C保温。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
权利要求
1.一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、将棘孢木霉接种到PDA培养基中进行培养，3天后将孢子用无菌水清洗，接入PDA液体培养基中，28°C培养3天后离心收集菌丝,用Trizol提取菌丝的总RNA,然后用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ;二、以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因EplT4，对目的基因EplT4进行测序鉴定；三、将目的基因EplT4与质粒载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI进行双酶切，将酶切后的目的基因EplT4和酶切后的质粒载体PPIC9K连接，构建重组载体pPIC9K-EplT4 ;四、将重组载体pPIC9K-EplT4转化大肠杆菌ToplO，挑选转化子进行菌落PCR验证，用质粒提取试剂盒提取阳性转化子的质粒，然后将质粒用SalI酶进行单酶切线性化，并将线性化片段进行回收；五、用毕赤酵母GS115制备毕赤酵母感受态细胞，将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混合，电击转化，获得转化细胞；六、将转化细胞涂在MD平板培养基上，于30°C培养至长出重组菌，将重组菌分别转接到含梯度浓度G418抗生素的MD平板培养基上，于30°C培养，在最高浓度G418抗生素的培养基上生长的菌落，即为毕赤酵母基因工程菌株Pp-EplT4 ;其中步骤二中 PCR 扩增所用上游引物 Pa 为 5' -CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3'，下游引物 Pb 为 5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3 '；步骤四中菌落PCR所用上游引物Pc为Y -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'，下游引物Pd为5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。
2.根据权利要求I所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系如下
3.根据权利要求I所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中目的基因EplT4的双酶切反应体系如下成分用量目的基因EplT44|iL限制性内切酶AcyA I0.5|iL限制性内切酶iVo/II|iLIOx/^wH 丨 buffe2i^L 无菌水12.5|xL 酶切反应条件16°C酶切过夜。
4.根据权利要求I所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中质粒载体PPIC9K的双酶切反应体系如下 成分用量质粒载体PPIC9K4(iL限制性内切酶Eco/H0.5|iL限制性内切酶iVo/II (iLIOx汝h H 丨 buffe2|iL 无菌水12.5uL 酶切反应条件16°C酶切过夜。
5.根据权利要求I所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中连接反应体系如下成分用量IOxT4 DNA连接酶缓冲液2|_iL酶切后的目的基因EplT46|iL酶切后的质粒载体pPIC9K4jiLT4DNA 连接酶1.5pL无菌水8.5(^L 连接反应条件16°C连接过夜。
6.根据权利要求I所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中PCR扩增的反应体系如下
全文摘要
一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，涉及毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。是要解决目前绿木霉的植物抗性诱导因子基因表达量低，无法满足其研究与应用的问题。方法提取棘孢木霉菌丝总RNA，反转录；PCR扩增，纯化扩增产物得目的基因EplT4；目的基因与载体连接构建重组载体；转化，提取阳性转化子质粒，将质粒线性化并回收；转化；将转化细胞涂在上长出重组菌，将重组菌转接到含梯度浓度抗生素的培养基上，在最高浓度抗生素的培养基上生长的菌落即为基因工程菌株Pp-EplT4。本发明方法获得的毕赤酵母基因工程菌株可高效表达棘孢木霉的植物抗性诱导因子基因，表达量为20mg/L。用于植物抗病领域。
文档编号C12R1/84GK102660469SQ20121017680
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者从华, 刘冰南, 姚琳, 孙艳, 宋金柱, 曹广丽, 杨萍, 杨谦, 王允, 王震宇, 赵磊 申请人:哈尔滨工业大学