专利名称：与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的snp标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记及其应用。
背景技术：
奶业的发展对于改善人们的膳食结构，增强国民体质，促进经济发展等方面，都具有重要作用。奶牛产业是奶业发展的龙头产业，而我国奶牛产业的发展水平明显落后于世界发达国家，总产奶量占世界总量的不足6%，人均占有量仅为世界平均水平的四分之一，奶牛单产不到世界发达国家的一半。以扩充奶牛数量提高产奶总量的传统发展模式易受到空间和发展规模的限制，影响了奶农养殖的积极性。因此，培育高产奶牛群体已成为我国奶牛产业发展的关键。只有不断改良奶牛群体的遗传水平，才能从根本上提高其经济性状的生产性能，从而促进我国奶牛产业持续健康发展。 随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究被广泛开展，并在畜禽育种中应用，产生了巨大的影响。PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)是在PCR技术基础上发展起来的，其基本原理是用PCR扩增目的DNA片段，扩增产物用特异性限制性内切酶消化切割成不同大小片段，直接利用凝胶电泳图进行分析。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带，从而达到鉴定不同基因型的目的。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良畜禽重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为家畜育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在家畜育种中的作用将日益突出。在奶牛育种中，人们希望选择与产奶性状密切相关，且与数量性状紧密连锁的DNA标记，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快遗传育种进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记及其应用。本发明的另一目的是提供用于检测所述与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记的引物及含有该引物的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记，其位于中国荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列的227bp处，此处碱基为T的中国荷斯坦奶牛的产奶量、乳蛋白含量显著高于此处碱基为G的中国荷斯坦奶牛，而乳脂率前者显著低于后者。本发明还提供用于检测上述与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记的引物，包括正向引物 F5’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3’和反向引物 R5' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3'。本发明还提供上述与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记在鉴定产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种中的应用，其包括步骤1)提取待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA ；2)以待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA为模版，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出中国荷斯坦奶牛PTK2基因496bp片段；3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中227bp处的碱基为T，则待测中国荷斯坦奶牛属于产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种。前述应用中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25 ill计为50ng/ill模板DNAl u 1，10pmol/u I 弓I物 F 和 R 各 I y 1，IOmmoI/L dNTPmix2. 0 u l,5U/u L Taq DNA 聚合酶0. 125 iil，IOXPCR反应缓冲液2.5 iil，余量为水。前述应用中，步骤2)中PCR反应的条件为94°C5分钟；94°C 30秒，47. 5°C 35秒，72 0C 35秒，34个循环；72°C 10分钟。前述应用中，步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为用内切酶NlaIII对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如果检测结果仅为一条带，则待测中国荷斯坦奶牛属于产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种，检测结果出现两条带，则待测中国荷斯坦奶牛属于普通品种。本发明还提供含有所述引物F和R的用于检测中国荷斯坦奶牛产奶性状的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。优选所述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一步提供所述与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用。本发明利用中国荷斯坦奶牛的PTK2基因的SNP位点进行基因分型，并对该基因的T227G与奶牛的产奶性状进行关联分析，通过SAS9. 0软件Mixed过程进行线性模拟分析发现，TT基因型个体的产奶量、乳蛋白量显著高于TG、GG基因型个体(P < 0. 05)，乳脂率显著低于GG基因型个体(P<0.05)。该多态位点的检出，既为分子育种提供了新的素材，又为中国荷斯坦奶牛产奶性状的标记辅助选择提供了科学依据。本发明提供了一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记及其应用，既采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测中国荷斯坦奶牛的基因型，根据基因型进行产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种的选育，从而加快中国荷斯坦奶牛的育种进程。本发明优点在于(一)本发明提供的分子遗传标记不受中国荷斯坦奶牛的年龄、性别等限制，可用于中国荷斯坦奶牛的早期选育，甚至在中国荷斯坦奶牛刚出生时就可准确地进行筛选，可大大加快中国荷斯坦奶牛的育种进程；(二)检测方法准确。
图I为PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，M DL2000DNAMarkero图2为本发明中国荷斯坦奶牛三种基因型的测序峰图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记的获得I. I中国荷斯坦奶牛血液DNA提取
本实施例中使用的牛血样为_20°C保存的凝结牛全血，全血分为血凝块和血清，血凝块为黯红色,血清呈清亮黄色,血液中只有白细胞内含有DNA，白细胞主要存在于血凝块部分。采用天根血液DNA提取试剂盒从血块中提取基因组DNA，按照试剂盒说明稍作调整，具体步骤如下I)预备2mL已灭菌的圆底离心管，每个管内放置一颗洁净钢珠(直径约 5mm-6mm)；2)取出血液样品，融化后，用手术剪刀剪取约200 ii 1-300 U I凝血块于离心管中。加入600 u I细胞裂解液CL，放入Qiangen组织研磨器中，以30次/秒的频率研磨5分钟，放置在55°C烘箱中处理2-3分钟，其间颠倒混匀数次，取出钢珠丢弃；3) 10, OOOrpm离心lmin，弃去暗红色上清；4)再次加入600 U I细胞裂解液CL，振荡器振荡使沉淀物散开悬浮，10，OOOrpm离心lmin,弃去上清；5)加入200 U I缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；6)加入20 ill蛋白酶K，220 ill缓冲液GB，充分晃动混匀；7) 55°C转炉中过夜消化，消化初始阶段，要颠倒混匀数次以促进消化过程，直至溶液变澄清透明，一般为浅棕色；8)加入200 U I冰镇无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，5000转/分离心2分钟，将杂质如牛毛等沉淀至管底。将离心管中液体转移到吸附柱中，12，OOOrpm离心30s，弃去收集管中的废液，未离心完全的再次离心；9)向吸附柱中加入500 ill去蛋白液⑶，静置2分钟，12，OOOrpm离心30s，弃去收
集管中废液；10)向吸附柱中加入700 U I漂洗液PW，静置2分钟，12，OOOrpm离心30s，弃去废液；11)重复上一步；12) 12, OOOrpm 离心 2min ；13)将吸附柱转移到新的I. 5mL离心管中，开口在55°C烘箱中晾置2分钟，至乙醇挥发完全；14)加入100 U I预热的洗脱缓冲液TB，盖盖在55°C烘箱中静置2min ；15) 12, OOOrpm 离心 2min,弃吸附柱。基因组DNA存在于离心管溶液中，4°C保存备用或_20°C长期保存。 I. 2目的片段和SNP位点的获得以及PCR-RFLP分型(I)扩增含SNP位点的核苷酸片段根据Ensembl数据库收录的PTK2基因(ENSBTAG00000009578)序列设计引物，包括正向引物 F5 ’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3，和反向引物 R5 ' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3 '，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO. I所示。该SNP位点位于该PCR扩增片段的227bp处，该处碱基可以为T或G，当该处碱基为G时，可被NlaIII内切酶(识别序列为CATG)识别。其中，PCR反应体系以25 ill计为50ng/ill模板DNA I yl，IOpmol/引物F和R各 I ii 1，lOmmol/L dNTP mix2. O u l,5U/u L Taq DNA聚合酶0. 125 y I，IOXPCR反应缓冲液2.5 yl，余量为水。PCR 反应条件为94°C 5 分钟；94°C 30 秒，47. 5°C 35 秒，72°C 35 秒，34 个循环；72 0C 10 分钟。(2)针对第227位碱基的不同选择适当的内切酶进行PCR-RFLP该PCR产物用NlaIII内切酶酶切，反应体系以20ul计为IOU/ii LNlaIII内切酶0. 5ul，10 X NEB 缓冲液 2ul，10ug/ul 100 X BSAO. 2ul，上述 PCR 产物 12ul，余量为水。反应条件为37°C温育4小时。然后，将得到的酶切产物在琼脂糖凝 胶中电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察(图I)。3、基因型判定及关联分析根据PCR-RFLP的结果判定该位点在检测群体中的基因型。当扩增片段的227bp处碱基均为G时，NlaIII内切酶可识别该位点，即可将PCR扩增片段切成两个片段，一个为227bp，另一个片段为269bp，该基因型记为GG型；当227bp处的碱基都为T时，NlaIII内切酶不可识别，即PCR扩增片段不能被切开，凝胶中只有一条带，长度为496bp，该基因型记为TT型；当227bp处既含有G碱基又含有T碱基时，即凝胶电泳中含有三条带，长度分别为496bp、227bp和269bp，该基因型记为杂合型TG型。即，该位点可分为3种基因型TT :496，TG :496/227/269, GG :227/269。3种基因型测序峰图见图2。实施例2中国荷斯坦奶牛不同基因型与产奶性状的关联分析及检测应用按照实施例I的方法，对采自北京地区不同奶牛养殖场的14个公牛家系共608头中国荷斯坦奶牛进行PCR-RFLP检测，PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列227bp位点的分析结果如表I所示。运用SAS9. 0软件Mixed程序进行线性模拟分析SNP多态位点的基因型与产奶性状的关联关系，分析时以个体育种值(EBV)代表表型值，采用的模型如下Yijk = U +G^ajIeijk其中，Yijk为个体育种值，U为育种值群体均值，Gi为基因型效应，Bj为微效多基因效应，eijk为随机误差效应。表ISNP位点在中国荷斯坦奶牛群体中的基因型频率及等位基因频率
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Gtl44(j0.:. 由表I可知，TT纯合型个数体显著高于TG型、GG型，T等位基因为优势基因。进行卡方适合性检验，( 1 )期望值与观测值差异不显著，可知该位点在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。表2中国荷斯坦奶牛PTK2基因SNP位点与产奶性状进行关联分析
权利要求
1.ー种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记，其特征在于，其位于中国荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列的227bp处，此处碱基为T的中国荷斯坦奶牛的产奶量、乳蛋白含量显著高于此处碱基为G的中国荷斯坦奶牛，而乳脂率前者显著低于后者。
2.用于检测权利要求I所述与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3’和反向引物R5' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3'。
3.权利要求I所述与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记在鉴定产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种中的应用，其包括步骤 1)提取待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA; 2)以待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA为模版，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应扩增出中国荷斯坦奶牛PTK2基因496bp片段； 3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中227bp处的碱基为T，则待测中国荷斯坦奶牛属于产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以 25 μ I 计为50ng/ μ I 模板 DNAl μ 1，IOpmoI/d 弓I 物 F 和 R 各 I μ 1，IOmmoI/L dNTPmix2. Ομ l,5U/y L Taq DNA 聚合酶 O. 125 μ I，IOXPCR 反应缓冲液 2. 5 μ I，余量为水。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的条件为94°C5分钟；94°C 30 秒，47. 50C 35 秒，72°C 35 秒，34 个循环；72°C 10 分钟。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为用内切酶NlaIII对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条帯，则待测中国荷斯坦奶牛属于产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种，检测结果出现两条带，则待测中国荷斯坦奶牛属于普通品种。
7.含有权利要求2所述引物的用于检测中国荷斯坦奶牛产奶性状的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的ー种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10.权利要求I所述与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记及其应用，其位于中国荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO.1所示序列的227bp处，此处碱基为T的中国荷斯坦奶牛的产奶量、乳蛋白含量显著高于此处碱基为G的中国荷斯坦奶牛，而乳脂率前者显著低于后者。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测中国荷斯坦奶牛的基因型，根据基因型进行产奶量高的中国荷斯坦奶牛优势品种的选育，从而加快中国荷斯坦奶牛的育种进程。
文档编号C12N15/11GK102676514SQ20121017547
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者刘剑锋, 张勤, 张胜利, 王海飞, 赵红梅 申请人:中国农业大学