专利名称：冬虫夏草中国被毛孢合成代谢次黄嘌呤核苷酸的酶及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的参与腺嘌呤核苷酸出发合成代谢次黄嘌呤核苷酸的AMP脱氨基酶(adenosine deaminase),编码这个酶的基因及其应用。
背景技术：
冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armor icanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。天然虫草具有严格的寄生性以及特殊的生态环境，故其产量很低，价格高昂。野生冬虫夏草由于受生长环境等因素制约，资源匮乏。由于近几年在人工栽培上进展不大，野生冬虫夏草代用品研究多集中在液体发酵上。利用液体深层发酵培养冬虫夏草菌丝体、提取物或发酵液，是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。虫草发酵生产虫草替代品，既可有效保护虫草这一珍贵资源，又不受气候、地理环境和虫草寄生条件严格的限制，适合于工业化大规模生产。生产出的替代品如菌丝体其成分和药效也与天然虫草相似，因而国内外一直致力于虫草菌丝体的发酵培养。人工发酵培养冬虫夏草中国被毛孢得到的菌丝，经毒理、药理、植化研究，证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可代替天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺，通过对发酵条件的优化，菌丝体生物量和代谢产物的量均有明显提闻。近年来，随着天然产物化学和现代色谱技术的飞速发展，在对虫草产品研发中已逐步由虫草原料或粗提物的直接利用转向更深层次的功能性代谢产物研究。国内外已对虫草代谢产物做了大量的研究，代谢产物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等几大类化合物，其中嘌呤类核苷、虫草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代谢产物在生物合成、药理作用等方面的研究初见成效。核苷类是虫草最主要的活性物质之一，其中嘌呤类核苷包括腺苷和鸟苷及它们的前体类物质次黄嘌呤核苷(肌苷)和黄嘌呤核苷等。研究表明腺苷可作为心脏病治疗药物，还可用于诊断冠心病，其类似物具有抗病毒活性和抗肿瘤作用；肌苷可用于心脏病、肝病、白血球减少症、血小板减少症、视神经萎缩和中心性视网膜炎等疾病的治疗，能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用；鸟苷则可作为三氮唑核苷、无环鸟苷等许多抗病毒药物的合成原料。由于嘌呤核苷及其类似物的重要生理作用，国内外有关微生物生产嘌呤类核苷已有很多石开究° Matsui 等(Matsui, Sato et al. Mutation of an inosine-producingstrain of Bacillus subtilis to DL—methionine sulfoxide resistance for guanosineproduction[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997, 34(4):337-341.)对肌苷生产菌B. subtilisl411进行诱变处理得到鸟苷高产菌AG169。为了进一步提高生产水平，国内有研究人员对生产菌中嘌呤核苷合成途径的遗传背景进行了研究(Qian，Caiet al. Analysis of three nucleotide seque nces involved in purine nucleotidesbiosynthesis in inosine and guanosine-producing bacilus subtilis. ActaMicrobiologica Sinica, 2003,43(2) :200-205.)。该研究从分子水平揭示了生产菌的部分遗传特性，有助于在基因水平理解产物在生产菌中的积累。目前，所应用的嘌呤类核苷生产菌以枯草芽孢杆菌为主，而作为重要合成代谢嘌呤类核苷的冬虫夏草菌，还只停留在代谢产物成分分析和功效的研究上，对冬虫夏草菌嘌呤类核苷合成代谢途径中相关基因和蛋白的研究还很少见。
发明内容
本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢次黄嘌呤核苷酸的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与腺嘌呤核苷酸出发合成代谢次黄嘌呤核苷酸的酶、编码基因及其应用。本发明采用的技术方案是一组来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与腺嘌呤核苷酸出发合成代谢次黄嘌呤核苷酸的AMP脱氨基酶序列为SEQ ID No. I的punDl蛋白和序列为SEQ ID No. 2的punD2蛋白；该酶可催化腺嘌呤核苷酸制备次黄嘌呤核苷酸。由腺嘌呤核苷酸合成代谢获得次黄嘌呤核苷酸的路径参见如下所示
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Il苷酸次黄嘿時核苷酸本发明还涉及所述的AMP脱氨基酶在生物催化腺嘌呤核苷酸制备次黄嘌呤核苷酸中的应用。
本发明还涉及上述AMP脱氨基酶的编码基因，即AMP脱氨基酶基因序列为SEQ IDNo. 3的punDl基因和序列为SEQ ID No. 4的punD2基因。所述的基因可用于构建能够生物催化腺嘌呤核苷酸制备次黄嘌呤核苷酸的基因工程菌，以扩大次黄嘌呤核苷酸或其衍生物的产量。本发明的有益效果主要体现在本发明从原理上对腺嘌呤核苷酸合成次黄嘌呤核苷酸代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节次黄嘌呤核苷酸生物合成基因的表达，赋予宿主次黄嘌呤核苷酸的高表达性，为扩大次黄嘌呤核苷酸或其衍生物的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。
图I为“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；图2为嘌呤代谢途径注释图；图3为AMP脱氨基酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图；图4为克隆载体pMD18-T Vector与表达载体pET_28b物理图谱；图5为重组克隆质粒pMD18_T/punC物理图谱；图6为重组表达质粒pET_28b/punC构建过程示意图；图7为重组表达质粒pET_28b/punC物理图谱；图8为AMP脱氨基酶蛋白SDS-PAGE图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养菌株来源首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了 L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutella Sinensis),该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No M 2011278，已在在先专利申请CN102373190A 中披露。将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)为葡萄糖2. 0%(w/v, 1%表示IOOmL培养基中含有lg，下同)、玉米粉I. 0%、土豆汁O. 5%、糊精O. 5%、酵母粉O. 5%、麸皮I. 0%、蚕蛹粉2. 0%、蛋白胨I. 0%、硫酸镁O. 05%、磷酸ニ氢钾O. 05%、琼脂粉I. 0%，余量为水，在12 16°C培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖I. 0%、糖蜜I. 0%、蚕蛹粉O. 5%、黄豆饼粉I. 0%、酵母膏O. 5%、硫酸镁O. 01%、磷酸ニ氢钾O. 02%，余量为水，置于摇床上，温度12 16°C培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。实施例2 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取用TRIzoI试剂提取总RNA，步骤具体为I)液氮研磨取Ig新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的I. 5mL离心管中，加入ImLTRIzol试剂,混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。2)RNA分离加入O. 2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2 3min，4°C、12000rpm离心15min，分层，取上层水相，约600 μし3) RNA沉淀加入500 μ L异丙醇,在冰上静置IOmin,4°C、12000rpm离心IOmin,弃上清。4)RNA洗漆加入ImL 75% (v/v)こ醇，将沉淀悬起,冰上静置IOmin, 4°C、7500rpm离心15min ;重复上面洗涤步骤，再洗一遍。5)溶解RNA :将离心管置于冰上敞开干燥5 10min，加适量DEPC水溶解。实施例3 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序提取样品总RNA后，用带有Oligo (dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段(20(T700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链,然后合成第二条cDNA链,再经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina GAIIx进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads,备以后续分析。实施例4 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装使用短reads 组装软件 SOAPdenovo (Li, Zhu et al. De novo assemblyof human genomes with massively parallel short read sequencing[J]. benomeRes, 2010, 20:265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的不含N的Contig片段。然后将reads比对回Contig,通过paired-endreads确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进ー步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理,最后得到含N最少,两端不能再延长的Unigene序列。最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(evalue〈0. 00001),取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，贝丨』按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的 Unigene 用软件 ESTScan (Iseli, Jongeneel et al. ESTScaniaprogram ior detecting, evaluating, and reconstructing potential coding regions mEST sequenceslJ」· In Proceedings of 9th InternationalConference on IntelligentSystems for Molecular Biology. AAAIPress, Menlo Park, CA, pp. 1999，138-148.)预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5’到3’方向的序列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。实施例5 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和Gene Ontology (GO)功能注释。首先,通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss_Prot、KEGG和C0G(evalue〈0. 00001),得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进ー步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对,预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息，使用Blast2G0软件(Conesa, Gotz et al. Blast2G0:auniversal tool for annotation, visualization and analysis m functional genomicsresearch [J]. Bioinformatics, 2005, 21 (18) : 3674-3676.)得到 Unigene 的 GO 注释信息。得到姆个Unigene 的GO注释后，用 WEGO软件(Ye, Fang et al. WEGO: a web tool for plottingGO annotations [J]. Nucleic Acids Research, 2006，34:293-297.)对所有 Unigene 做 GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。实施例6 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢次黄嘌呤核苷酸代谢途径分析图2是KEGG代谢途径注释中的嘌呤代谢(map00230)，已注释的酶是已检测到的“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢嘌呤代谢途径相关酶类，从图中可以看出，检测到了从腺嘌呤核苷酸出发合成次黄嘌呤核苷酸的AMP脱氨基酶2个Unigene。通过NCBI中的ORFFinder软件在线检测，找出了这个 基因的开放阅读框(SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2)。实施例7 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢AMP脱氨基酶基因引物设计运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的基因开放阅读框DNA序列设计引物，用于克隆“百令”生产菌中国被毛孢合成代谢次黄嘌呤核苷酸的AMP脱氨基酶基因，引物由上海生エ生物工程有限公司合成，引物序列如下所列punD I 基因正向引物 5 ’ ATTGAGCTCATGGTGAAGACGAACGTGC3 ’反向引物5 ’ ATTAAGCTTCTAGTTCCGTACCCTGCCAC3 ’punDl 基因长度为 378bppunD2 基因正向引物 5 ’ ATTGAATTCATGCTGCTGGCCAAGCTGG3 ’反向引物5 ’ ATTAAGCTTCTAGCCGGCCTCGAAGAG3 ’punD2 基因长度为 1032bp实施例8 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的制备先按照实施例I提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。米用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(TaKaRa)从 TotalRNA中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下I)在Microtube管中配制下列混合液。
权利要求
1.ー组来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的參与腺嘌呤核苷酸合成代谢次黄嘌呤核苷酸的AMP脱氨基酶序列为SEQ ID No. I的punDl蛋白和序列为SEQ ID No. 2的punD2蛋白。
2.如权利要求I所述的AMP脱氨基酶在生物催化腺嘌呤核苷酸制备次黄嘌呤核苷酸中的应用。
3.编码权利要求I所述AMP脱氨基酶的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因为序列为SEQID No. 3的punDl基 因和序列为SEQ ID No. 4的punD2基因。
5.如权利要求3或4所述的基因在构建能够生物催化腺嘌呤核苷酸制备次黄嘌呤核苷酸的基因工程菌中的应用。
全文摘要
本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与腺嘌呤核苷酸出发合成代谢次黄嘌呤核苷酸的AMP脱氨基酶，编码这个酶的基因及其应用。所述AMP脱氨基酶，包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的蛋白，其编码基因分别对应为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本发明从原理上对腺嘌呤核苷酸合成次黄嘌呤核苷酸的代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节次黄嘌呤核苷酸生物合成基因的表达，赋予宿主次黄嘌呤核苷酸的高表达性，为扩大次黄嘌呤核苷酸的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。
文档编号C12N9/14GK102690801SQ20121017519
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者吴晖, 李邦良, 柳志强, 王鸿艳, 薛亚平, 袁水金, 许峰, 许静, 郑裕国, 陈丽芳 申请人:杭州中美华东制药有限公司, 浙江工业大学