专利名称：具有抑制病毒感染作用的反义核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抑制病毒，尤其CVA24感染作用的反义核酸及其应用。
背景技术：
出血性结膜炎(Epidemic Haemorrhagic Conjunctivitis)是一种传染性很强的疾病，它可在公众场合造成大范围的感染流行。其症状为眼睑肿胀，显著滤泡增生。半数病例于病后2-3天病情达到高峰时，可有球结膜出血呈点状或片状和角膜上皮损害，出血严重者可遍及整个球结膜，有些病例常发生角膜上皮反复剥脱，持续数年之久甚为顽固。该病特点是潜伏期短，传染性强。该病的传染源主要为柯萨奇A组病毒和肠道病毒70型，特别是CVA24常引起暴发流行，造成大量人群的出血性结膜炎。根据报道，70年代以来，CVA24分别在亚洲、非洲、美洲的一些国家引起出血性结膜炎的暴发流行。其中，1985～1989年在台湾发生了4次CVA24引起的出血性结膜炎的暴发流行。1985年7～11月在日本冲绳CVA24引起的出血性结膜炎的暴发流行，仅三个月眼科诊所就接收病人9952例。
柯萨奇A24病毒(CVA24)为小RNA病毒科，肠道病毒属。基因组含一个单、正链RNA，即具有mRNA活性的核苷酸序列。全长7402个核苷酸，这里不包括3’端的多聚腺苷酸尾。在CVA基因组各功能区的排列顺序依次为5’端非编码区(NTR)，P1区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。5’端是病毒基因组的非编码区，含741个核苷酸。是病毒增殖周期中起着非常重要作用的功能区，它包括与病毒毒力有关的区域、与病毒复制有关的起始信号区等。根据本专利作者前期对柯萨奇病毒基因组的研究发现在5’端非编码区362-569的区域内存在病毒蛋白翻译的起始信号区，宿主细胞的核糖体(18SRNA)就结合到病毒基因组的这段区域，开始向基因组的3’端滑行，在AUG位点开始进行病毒结构蛋白和非结构蛋白的翻译(该论文发表在国际刊物Virology，99年265卷12期206-17页)。在经研究发现是与宿主细胞内18sRNA互补的，这一能与使真核细胞的核糖体直接结合的位点称作IRES(Internal RibosomeEntry Site)。
柯萨奇病毒RNA含有一个单一、较长的开放读码框架，编码一个较长的多聚蛋白链，这个多聚蛋白通常在形成过程中就开始解链。P1区是结构蛋白基因编码区，P2、P3区是病毒非结构蛋白的基因编码区。它的解链主要依靠病毒编码的蛋白酶来完成，最终产生11个终末产物(如
图1所示)。
多年来对病毒感染所造成的疾病缺乏有效的预防和治疗手段，传统的化学药物治疗病毒感染存在着特异性差、疗效不佳的缺陷。因此，研究有效的特异性抗病毒新型药物具有重要的意义。反义核酸技术应用在医学疾病的基因治疗中，是利用具有专一顺序的寡聚脱氧核苷酸(ODNs)特异封闭对于人体有害基因，是一种全新的治疗方法。反义核酸进行抗病毒治疗旨在破坏病毒的基因组，又能以碱基配对的方式决定这一抗病毒基因治疗的高度特异性。作用原理主要为阻断病毒基因组的复制、转录，阻断RNA的转录和加工，阻断翻译复合体的形成和翻译过程。反义核酸与靶RNA结合成杂种分子激活内源性的Rnase H等，将其分解，而破坏病毒的基因组结构。所以，从核苷酸水平上寻找抗病毒治疗的方法也是抗病毒治疗的最佳途径。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种采用了反义核酸互补和结合到基因组中的相对区域的原理，合成病毒基因组特定部位的反义核酸，以此结合到病毒基因组的特定区域阻断病毒转录、复制及翻译。故具有高度特异性。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为1、针对柯萨奇A24病毒基因组5’端非编码区核糖体结合位点(病毒蛋白翻译起始信号区)所设计的一组反义寡核苷酸序列，在病毒感染细胞中，与病毒mRNA的碱基互补，特异性阻断病毒遗传信息流动，抑制该病毒颗粒攻击细胞，达到治疗和预防该病毒感染的目的。
2、根据以上1项所述的反义寡核苷酸序列，其中所述柯萨奇A24病毒基因组核糖体结合位点的基因区序列是tattgagcta cttaagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac
catggagcag gtagttgcaa tccagcagcc agcctgtcgt aacgcgcaagtccgtggcgg aaccgactac tttgggtaac cgtgtttcct tttattctttgtatggctgc ttatggtgac aatcattgat tgttatcata gagcgacttggattggcc3、根据以上1项所述的一组反义寡聚核苷酸序列，其特征在于，针对不同的区域设计的序列为SCA5475’ACACGGTTACCCAAAGTAGT 3’SCA5515’GGAAACACGGTTACCCAAAG 3’SCA5545’AAAGGAAACACGGTTACCCA 3’SCA5585’AATAAAAGGAAACACGGTTA 3’SCA5685’CCATACAAAGAATAAAAGGA 3’4、根据以上1-3项中任一项的反义寡聚核苷酸序列的修饰型。
5、根据以上1-3项中任一项的反义寡聚核苷酸序列，特征在于它与病毒mRNA的碱基互补，有效地阻断病毒遗传信息流动。
6、根据以上1-3项中任一项的反义寡聚核苷酸序列作为治疗和/或预防病毒性疾病的基因药物的应用。
7、根据以上1-3项中任一项的反义寡聚核苷酸序列在医学中的应用。
8、根据4项的反义寡聚核苷酸序列的修饰型作为治疗和/或预防病毒性疾病的基因药物的应用。
经过不同基团修饰后的反义核酸具有稳定性强和细胞毒性低的特点。国外也在探讨抗病毒的基因治疗，实验研究主要集中在艾滋病病毒感染上，本研究在国内外首先进行和报道了针对柯萨奇病毒感染进行反义核酸的基因治疗。故本实验具有源头创新和自我知识产权。创新之二是在实验中我们采取的柯萨奇A24病毒是国内出血性结膜炎流行期间从病人分离出的流行株，具有流行病学意义。所以针对该病毒所设计的反义核酸及抗病毒研究的实验资料有较强的实用价值(局部用药)。
本研究的关键是1、掌握柯萨奇病毒生物学特性，详细地分析病毒感染周期中基因组重要功能区结构及特性，使其反义寡聚核苷酸作用准确、特异。利用稳定的细胞感染模型使反义核酸抗病毒感染的实验得到稳定、可靠的实验数据。2、对于细胞自然摄取寡聚核苷酸能力较低的不足，采取天然脂类化合物能悬浮在水中形成双层磷脂膜的囊泡，反义核酸包裹其内，既能加速进入细胞又能降低使用药物浓度，充分发挥作用。3、保持反义寡聚核苷酸在实验中的稳定，不宜被降解而失去其抑制效能，采用硫代形式的修饰型反义寡聚核苷酸，以增加其稳定性。
根据本发明，提供了针对柯萨奇A24病毒基因组5’端非编码区核糖体结合位点(病毒蛋白翻译起始信号区)(Seq ID No.9)所设计的一组反义寡核苷酸序列，在病毒感染细胞中，所述反义寡核苷酸序列与病毒mRNA的碱基互补，特异性阻断病毒遗传信息流动，抑制该病毒颗粒攻击细胞，达到治疗和预防该病毒感染的目的。
根据本发明的第二个方面，提供了上述反义核苷酸序列的应用，尤其作为病毒预防和治疗药物的应用。在以下的实验中，发明人设计了SeqID No.1-5的本发明反义核苷酸序列，其中Seq ID No.6-8作为对比反义核苷酸提供。结果表明，本发明的反义核苷酸显示了较强的病毒抑制作用。
图2是不同反义核酸在5μM浓度下对病毒空斑形成的影响。其中全黑栏(Virus)为不加反义核酸的对照，图中显示，在10-1、10-3和10-5病毒滴度下，本发明的反义核苷酸均显示了较显著的对病毒空斑形成的抑制作用。
图3是SCA547抑制病毒感染的量效曲线图，图中显示在0.3-0.6μm/ml浓度之间，浓度上升与病毒抑制率呈直线上升，0.6μm/ml以上成平稳上升状态。
图4是SCA568抑制病毒感染的量效关系曲线图，图中显示，在0.3-5μm/ml浓度之间，均呈现了较高的病毒抑制率。
图5是SCA554抑制病毒感染的量效关系曲线图，图中显示，在0.3-1.25μm/ml浓度之间，浓度上升与病毒抑制率呈直线上升，1.25μm/ml以上呈平稳状态。
图6是SCA551抑制病毒感染的量效关系曲线图，图中显示，在0.3-0.6μm/ml浓度之间，SCA551浓度与病毒抑制率呈直线上升，0.6μm/ml以上呈平稳上升。
图7是SCA558抑制病毒感染的量效关系曲线，图中显示，在0.3-2.5μm/ml之间，SCA558浓度与病毒抑制率呈较陡的峰上升，2.5-5μm/ml之间趋于平稳。
2、细胞及病毒实验所用Hela细胞株由本研究所生化免疫室提供。细胞培养液为MEM(Minimum Essetial Medium)，含5～10％新生牛血清、100u/ml青霉素、链霉素0.1mg/ml、L-谷氨酰胺0.297mg/ml。实验所用病毒株为本室从病人标本中分离，在Hela细胞中传代后，其病毒滴度为4×107pfu/ml，-80℃低温冰箱保存。使用时，用无血清MEM(青霉素、链霉素、谷氨酰胺含量同前)稀释病毒。
3、病毒空斑形成实验为了估计反义核酸抑制CVA24的能力，我们先用病毒空斑形成实验来确定感染量。将Hela细胞以每孔5×105密度接种于6孔细胞培养板中，细胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃，5％CO2孵育18-24小时。用不含血清MEM稀释CVA24病毒为10-1至10-5，分别加入6孔细胞培养板，每孔细胞数为2×106，病毒量200μl/孔，含一对照孔，37℃，5％CO2孵育1小时，每10分钟振荡一次。用PBS(无Ca++、Mg++)洗细胞3次，去掉未结合病毒。加入0.7％琼脂(1ml/孔)，再孵育48小时。1％结晶紫染色，观察结果。
4、病毒空斑阻断实验用病毒空斑阻断实验检测反义核酸抑制CVA24的能力。将Hela细胞以每孔5×105密度接种于6孔细胞培养板中，细胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃，5％CO2孵育18-24小时。其后，用浓度为5μmol/L的SCA373、SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568、SCA723和SCA746分别加入Hela细胞培养孔中，每孔加入1ml MEM培养基，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，细胞对照孔只加入1ml MEM培养基。37℃、5％CO2孵育18小时。PBS(无Ca++、Mg++)洗细胞3次。用不含血清的MEM稀释CVA24病毒至10-2，每孔加入0.2ml。细胞对照孔加入0.2mlMEM，不含反义核酸。于37℃、5％CO2中感染1小时，每10分钟振荡一次。用PBS洗细胞3次，去掉未结合病毒。每孔加入2ml含0.7％Ager的MEM固体培养基，37℃、5％CO2中孵育48小时。固定细胞，1％结晶紫染色后，观察结果。
5、病毒致细胞病变效应(CPE)将Hela细胞以每孔5×105密度接种于6孔细胞培养板中，细胞溶于2ml MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小时。稀释病毒使最后细胞的感染量为10、1、0.1、0.01MOI四种病毒稀释滴度，分别加入细胞孔中，每孔200μl，同时设正常细胞对照孔，37℃、5％CO2孵育1小时，每10分钟振荡一次。用PBS洗细胞3次，去掉未结合病毒。每孔加入2L的MEM(含10％新生牛血清、100u/ml青霉素、链霉素0.1mg/mL、L-谷氨酰胺0.297mg/ml)。37℃、5％CO2孵育72小时。显微镜下观察结果。
6、反义核酸抑制病毒致细胞病变效应(CPE实验)
将Hela细胞以每孔5×105密度接种于6孔细胞培养板中，细胞溶于2ml MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小时。其后，用浓度为5μmol/L的SCA373、SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568、SCA723和SCA746分别加入Hela细胞培养孔中，每孔加入1ml MEM培养基，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，细胞对照孔只加入1mL MEM培养基。37℃、5％CO2孵育18小时。PBS(无Ca++、Mg++)洗细胞3次。用不含血清的MEM稀释CVA24病毒至10MOI，分别加入细胞孔中，每孔200μl。同时设正常细胞对照孔，细胞对照孔加入0.2mL MEM，不含反义核酸。于37℃、5％CO2中感染细胞1小时，于37℃、5％CO2中孵育1小时。用PBS细胞洗3次，去掉为结合病毒。每孔再加入上述反义核酸5μmol/L，2ml，37℃、5％CO2中孵育48小时。将合成的寡聚核苷酸稀释至5μmol％，分别加入培养板的细胞孔中，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，每孔1ml，细胞对照孔只加入1ml MEM培养基。37℃、5％CO2孵育18小时。PBS(无Ca++、Mg++)洗细胞3次。用不含血清的MEM稀释CVA24病毒至10MOI感染Hela细胞，37℃、5％CO2孵育1小时，同时设正常细胞对照孔。其后，将合成的寡聚核苷酸SCA373、SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568、SCA723和SCA746分别稀释至5μmol/L，再加入已感染不同滴度病毒的细胞孔，每孔加入2ml的MEM(含10％新生牛血清、100u/ml青霉素、链霉素0.1mg/ml、L-谷氨酰胺0.297mg/ml)。37℃、5％CO2孵育72小时，观察结果。
7、反义核酸抗病毒量效关系曲线的测定将Hela细胞以每孔5×105密度接种于6孔细胞培养板中，细胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小时。其后，将合成的5种有效抑制CVA24的寡聚核苷酸SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568均稀释至0.3125、0.625、1.25、2.5、5μmol/L，5个浓度，分别加入Hela细胞培养孔中，每孔加入1ml MEM培养基，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，细胞对照孔只加入1mL MEM培养基。37℃、5％CO2孵育18小时。PBS(无Ca++、Mg++)洗细胞3次。用不含血清的MEM稀释CVA24病毒至10-2，分别加入细胞孔中，每孔200μl。同时设正常细胞对照孔，细胞对照孔加入0.2ml MEM，不含反义核酸；及病毒感染对照孔，细胞只感染病毒，不加入反义核酸。于37℃、5％CO2中感染细胞1小时，37℃、5％CO2孵育1小时。用PBS洗细胞3次，去掉未结合病毒。每孔再分别加入上述浓度的5种反义核酸，每孔加入2ml的MEM(含10％新生牛血清、100u/ml青霉素、链霉素0.1mg/ml、L-谷氨酰胺0.297mg/mL)。37℃、5％CO2孵育48-72小时，观察结果，至病毒对照孔出现50-70％细胞死亡时，回收各细胞对照孔上清，-20℃保存。
将Hela细胞以每孔5×105密度接种于6孔细胞培养板中，细胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小时。将上述回收上清液稀释至10-3，分别加入细胞孔中，每孔200μl，含病毒对照孔，37℃、5％CO2孵育1小时，每10分钟振荡1次。用PBS洗细胞3次，去掉未结合病毒。每孔加入2mL含0.7％Ager的MEM固体培养基，37℃、5％CO2中孵育48小时。固定细胞，1％结晶紫染色后，观察结果。
8、结果①在CPE抑制实验中，在针对CVA24的一组反义核酸序列中，5条序列在5μM和2.5μM的浓度下显示出有抑制病毒感染细胞的作用(见下表)。根据下列公式计算出CPE的抑制率。
CPE抑制率＝(病毒对照细胞死亡率-反义核酸治疗后细胞死亡率/病毒对照组细胞死亡率)×100％
②在病毒空斑形成抑制实验中，反义核酸均采用5μM，病毒采用三种不同的稀释度。同样发现上述5条反义核酸序列具有明显的抗病毒效果。根据空斑形成的数量，利用下列公式计算得出病毒空斑形成抑制率。见图2。
病毒空斑形成抑制率＝(病毒对照空斑数-反义核酸治疗后空斑数/病毒对照空斑数)×100％③病毒抗病毒量效关系根据药效学研究，我们采用病毒空斑形成抑制实验，对每一个有抗病毒效果的反义核酸进行了量效关系的研究，结果见图3至图7。
序列表Seq ID No.1(i)序列特征a序列长度20个碱基b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA5475’ACACGGTTACCCAAAGTAGT 3’Seq ID No.2(i)序列特征a序列长度20个碱基b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA5515’GGAAACACGGTTACCCAAAG 3’Seq ID No.3(i)序列特征a序列长度20个碱基b类型核苷酸c链型单链
d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA5545’AAAGGAAACACGGTTACCCA 3’Seq ID No.4(i)序列特征a序列长度20个碱基b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA5585’AATAAAAGGAAACACGGTTA 3’Seq ID No.5(i)序列特征a序列长度20个碱基b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA5685’CCATACAAAGAATAAAAGGA 3’Seq ID No.6(i)序列特征a序列长度20个碱基
b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA3735’TCCCATTGTGATGGTGCTGT 3’Seq ID No.7(i)序列特征a序列长度20个碱基b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA7235’TGCTGTCTTATCAGTAGTAC3’Seq ID No.8(i)序列特征a序列长度20个碱基b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述SCA7465’CACCTGGGCTCCCATTGTGA 3’Seq ID No.9(i)序列特征a序列长度208个碱基b类型核苷酸c链型单链d拓扑结构线性(ii)序列描述tattgagcta cttaagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaaccatggagcag gtagttgcaa tccagcagcc agcctgtcgt aacgcgcaagtccgtggcgg aaccgactac tttgggtaac cgtgtttcct tttattctttgtatggctgc ttatggtgac aatcattgat tgttatcata gagcgacttggattggcc
权利要求
1.针对柯萨奇A24病毒基因组5’端非编码区核糖体结合位点(病毒蛋白翻译起始信号区)所设计的一组反义寡核苷酸序列，在病毒感染细胞中，与病毒mRNA的碱基互补，特异性阻断病毒遗传信息流动，抑制该病毒颗粒攻击细胞，达到治疗和预防该病毒感染的目的。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸序列，其中所述柯萨奇A24病毒基因组核糖体结合位点的基因区序列是tattgagcta cttaagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaaccatggagcag gtagttgcaa tccagcagcc agcctgtcgt aacgcgcaagtccgtggcgg aaccgactac tttgggtaac cgtgtttcct tttattctttgtatggctgc ttatggtgac aatcattgat tgttatcata gagcgacttggattggcc
3.根据权利要求1所述的一组反义寡聚核苷酸序列，其特征在于，针对不同的区域设计的序列为SCA5475’ACACGGTTACCCAAAGTAGT 3’SCA5515’GGAAACACGGTTACCCAAAG 3’SCA5545’AAAGGAAACACGGTTACCCA 3’SCA5585’AATAAAAGGAAACACGGTTA 3’SCA5685’CCATACAAAGAATAAAAGGA 3’
4.权利要求1-3中任一项的反义寡聚核苷酸序列的修饰型。
5.根据权利要求1-3中任一项的反义寡聚核苷酸序列，特征在于它与病毒mRNA的碱基互补，有效地阻断病毒遗传信息流动。
6.根据权利要求1-3中任一项的反义寡聚核苷酸序列作为治疗和/或预防病毒性疾病的基因药物的应用。
7.根据权利要求1-3中任一项的反义寡聚核苷酸序列在医学中的应用。
8.根据权利要求4的反义寡聚核苷酸序列的修饰型作为治疗和/或预防病毒性疾病的基因药物的应用。
全文摘要
本发明针对柯萨奇A24病毒基因组5’端非编码区核糖体结合位点(病毒蛋白翻译起始信号区)所设计的一组反义寡核苷酸序列，在病毒感染细胞中，所述反义寡核苷酸序列与病毒mRNA的碱基互补，特异性阻断病毒遗传信息流动，抑制该病毒颗粒攻击细胞，达到治疗和预防该病毒感染的目的。
文档编号A61P31/12GK1392154SQ0212418
公开日2003年1月22日 申请日期2002年7月16日 优先权日2002年7月16日
发明者刘哲伟, 孙红妹, 张霆, 肖宗惠 申请人:首都儿科研究所