专利名称：miRNA-361及其反义核苷酸的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新药用途，具体涉及一种miRNA-361及其反义核苷酸的用途，尤其涉及一种miRNA-361及其反义核苷酸在制备用于诊断、防治心脏疾病的药物中的用途，属于心脏疾病的诊断、预防和治疗领域。
背景技术：
心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国， 随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新统计结果表明，我国18 岁及以上居民高血压患病率为18. 8%，估计全国患病人数I. 6亿多，由此造成的心肌肥厚、 心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、防治。
miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。 单一的miRNA可以同时作用于多个祀基因的mRNA的表达,这样药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，因此可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。
细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下， 如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等，心肌细胞会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这一点可能是一些心脏疾病发病的机理。
目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达参与细胞凋亡的发生， 这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的 miRNA,阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。发明内容
本发明的目的是确定或发现调控心肌细胞凋亡的心脏特异性性表达的miRNA，进一步确定其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。
除非特别指明，本文中的“miR-361”均指“miRNA-361”，其序列为下述SEQ ID NO: I 所示的核苷酸序列
5 ‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3，。
除非特别指明，本文中的“I/R”均指“心肌缺血/再灌注”。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一方面，本发明提供了一种单链非编码miRNA-361反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途，所述miRNA-361反义核苷酸的序列为下述SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列5’ -GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’。
优选地，所述miRNA-361反义核苷酸的核苷酸序列在每个碱基均进行了 2’ -甲氧基修饰。
优选地，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
还一方面，本发明还提供了一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包含有效剂量的上述本发明所述的miRNA-361反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。
优选地，所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
优选地，所述药物组合物的给药方式选自口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。
另一方面，本发明还提供了一种单链非编码miRNA-361核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物组合物中的用途，其中，以所述miRNA-361核苷酸序列作为靶点或检测对象，所述miRNA-361核苷酸的序列为下述SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列 5 ‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3’。优选地，所述的心脏疾病包括心肌梗死、心肌缺血损伤、 心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
本发明还提供了一种诊断或预后心脏疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包含有效剂量的本发明上述所述的miRNA-361核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。
优选地，所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
本发明人通过实验发现miRNA-361在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-361表达显著上调。通过转染和注射miRNA-361反义核苷酸抑制miRNA-361 的表达可以抑制心肌细胞凋亡及心肌缺血损伤，心肌梗死面积减少。
以上实验说明miRNA-361反义核苷酸通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-361反义核苷酸对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。而升高miRNA-361 的表达则可以诱导心肌细胞凋亡，心肌缺血损伤会更加严重。
具体的，本发明人发现miRNA-361 反义核苷酸(5’ -GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’ ) 通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。在心肌细胞缺氧或心肌缺血损伤过程中， miRNA-361表达显著上调，miRNA-361的上调可能诱导了心肌细胞凋亡的发生。miRNA-361 在缺血再灌注动物模型的心肌组织中表达上调；抑制小鼠的内源性的miRNA-361，可以抵抗心肌缺血再灌注损伤，使心肌梗死面积减少，心功能显著改善。将miRNA-361反义核苷4酸与适当的载体结合形成药物，导入心脏或体内，对许多心脏疾病将具有预防及治疗作用。 可以考虑将miRNA-361反义核苷酸与壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等组合形成药物分子，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式，用于防治心脏疾病、改善心脏功能、阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中
图I示出了实施例I中心肌缺血损伤及低氧诱导的心肌细胞凋亡过程中 miRNA-361表达水平的变化，其中A示出了原代心肌细胞缺氧处理miRNA-361表达水平， 其中，纵坐标表示以未处理的原代心肌细胞为基准，在缺血处理过程中原代心肌细胞中 miRNA-361的表达水平；B示出了小鼠心肌缺血miRNA-361表达水平；
图2示出了实施例2中抑制内源性的miRNA-361对心肌细胞凋亡的抵抗作用，其中，A示出了原代心肌细胞转染miRNA-361反义核苷酸抑制内源性的miRNA-361的表达情况示出了 miRNA-361反义核苷酸对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响；
图3示出了实施例3中miRNA-361反义核苷酸对心肌缺血损伤的抵抗作用，其中， A和B分别示出了小鼠心肌注射miRNA-361反义核苷酸后实施心肌缺血再灌注手术，检测 miRNA-361反义核苷酸对心肌梗死面积及心肌凋亡的影响；
图4示出了实施例4中小鼠静脉注射miRNA-361 antagomir抑制内源性 miRNA-361后缺血再灌注后24小时与对照组相比的心功能状况，其中的A、B和C分别示出了对左室舒张末内径(LVIDd)、左室收缩末内径(LVIDs)和短轴截短率(FS)的指标检测情况；
在以上附图中，为简便起见，361反义核苷酸表示miRNA-361反义核苷酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。
除非特别指明，以下实施例中采用的小鼠和大鼠乳鼠购自北京医科大学，其中，小鼠品系为C57小鼠，大鼠品系为Wistar大鼠。
除非特别指明，以下实施例中所用的试验方法均为本领域中所用的常规方法。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例I心肌细胞缺氧及心肌缺血诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-361表达情况检测
在该实施例中，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，用以进行心肌细胞凋亡实验模型的构建，制备大鼠乳鼠原代心肌细胞的具体步骤参见文献: W. -Q. Tan,Kun Wang, et al.，Foxo3a InhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase. J Biol Chem. 2008 October 31;283 (44):29730-29739。
利用大鼠乳鼠原代心肌细胞建立心肌缺氧模型，具体为，在低氧培养箱中(氧浓度低于1%)对大鼠乳鼠原代心肌细胞进行培养，培养规模为IOcm培养皿，每个培养皿的细胞量约为IX IO6个，培养时间持续0、1、2、3、4小时。随培养时间的不同来提取RNA，并利用实时荧光定量PCR技术检测miRNA-361的表达水平，其具体操作参见文献W. -Q. Tan, Kunffang, et al. , Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy throughTransactivating Catalase. J Biol Chem. 2008 October 31;283 (44):29730-29739。
具体为，PCR扩增 miRNA-361 编码序列(GAAGCTTATCAGAATCTCCAGGGGTACT TATTATTTGAAAAGTCCCCCAGGTGTGATTCTGATTCGTTTC, SEQ ID NO:3)及其上下游两端各将近200个bp的序列，扩增片段约562bp,具体为(ΤΓ「(ΚΠΤ 'Α('Α(;Α(Κ ΤΤ(;(' T TAGGCCTATTGCCTCAGTACTTCAGGGCAAGAATGAGGCTAACAGGTGAGTCATGTTACCATCTACCAGAC TGCCAGAACTGGGCCTAAATAATAGTCACCTCCCTGTGTTCAGATGTGCGTCATTTCTCTCAGTCTGGAG CCCTTTACTTTTCTCACACAACATAGAGATGCAGCAGTAGCAGAGGCTTCACTATGATTCTTTCTTGGGA CTCG GAAGCTTATCAGAATCTCCAGGGGTACTTATTATTTGAAAAGTCCCC CAGGTGTGATTCTGATTCGTTTC CCTCTCCTGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCCTTGGAAATCAGTTTC ATCTGAAGCTTCTGCATAAACAGGCACATTCATTAGCATCTTATCCTGCATAGTTGAGCTTGCATTATTTACTCTCT GCGTTATCTTCATTAATTCTTTCTAATGCTGAAACACCTGAAATCAGTGTCTGCCGGTCACCAAAGGATCTCTATTA GACTTTGGAAGCAAACAAAGCAGCAAAGACTTCATA AAC TI GA (77 GAA GiK 'TAGCiT (SEQ IDNO: 4，其中加黑并带下划线标记为miRNA-361的编码序列；其余的为它的上下游序列，斜体带下划线标记的为上下游引物序列，
PCR 体系 50ul，PCR 条件如下95。C 3min 一个循环；95。C 30sec，56。C30sec, 72。C Imin共28个循环；最后72。C延伸5min，PCR引物设计如下
上游引物5，-CCTTGGTTTACAGAGCTTTGC-3’(SEQID NO:5);
下游引物5，-ACCTAGCCTTCAAGTCAAGTT-3’(SEQID N0:6)。
检测到的miRNA-361表达水平如图IA所示，在低氧处理4h_8h的区间内， miRNA-361的表达显著上调。
本实施例采用结扎大鼠冠状动脉建立心肌缺血模型结扎大鼠冠状动脉的操作步骤参见文献Kun Wang, Bo Long, et al. , miR-484 regulatesmitochondrial network through targeting Fisi. Nature Communications. 2012April 17;781 (3) :256-265。在 0-120分钟的区间内分别自心脏缺血区(危险区)组织及非缺血区心肌(远端区)组织提取总RNA，并利用实时荧光定量PCR技术检测miRNA-361的表达水平(检测方法及条件同上)， 其中，以自非缺血区心肌(远端区)组织提取的RNA为对照组。结果如图IB所示，表明缺血 30min-120min的心肌缺血组织中的miRNA-361表达水平较之非缺血组织及非缺血模型组表现出显著的上升。
实施例2miRNA_361反义核苷酸抑制心肌细胞凋亡的实验
本实验中使用实施例I中原代培养的心肌细胞为模型。对心肌细胞(细胞量约为 I X IO6)进行miRNA-361反义核苷酸转染处理(通过脂质体lipfectin2000按照试剂盒操作说明书进行转染，购自Invitrogen公司),转染24小时后,在低氧培养箱(氧浓度低于1%) 中对该细胞培养处理3小时，以诱导细胞凋亡。同时，以未经miRNA-361反义核苷酸转染的原代心肌细胞为阴性对照，利用台盼兰染色方法检测心肌细胞凋亡情况。
实验结果如图2所示，表明抑制内源性miRNA-361可以显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。
实施例3miRNA_361反义核苷酸抑制心肌缺血损伤实验
小鼠经冠状动脉注射miRNA-361反义核苷酸可显著抑制心肌缺血再灌注损伤。以C57小鼠为实验对象，按照如下方法注射miRNA-361反义核苷酸和它的阴性对照 (5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，(SEQ IDN0:7)，并且每一个碱基均进行了 2’-甲氧基修饰，由上海吉马公司合成，)(NC):小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区。 颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏。稀释miRNA-361反义核苷酸于PBS中，终体积为200 μ 1，终浓度为30mg。利用26号导管从心尖进入动脉根部，注射miRNA-361反义核苷酸时同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒(每只小鼠注射量为30mg/kg/天)。监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中。心电图监测整个手术过程。
注射miRNA-361反义核苷酸3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测。颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2_处进针，进针深度O. 5_ ;以 6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定IOmin后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)。以I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于O. Imv并持续O. 5hr以上作为结扎成功的标志。缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注。以ST段下降为标志。 清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。再灌注24小时后用Evansblue/TTC 双染测定心肌梗死面积。同时，以每只小鼠的注射量为30mg/kg/天的miRNA-361反义核苷酸阴性对照(5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’ (SEQ ID NO: 7)，并且每一个碱基均进行了 2’ -甲氧基修饰，由上海吉马公司合成)的I/R组作为阴性对照组(NC)。
结果如图3A所示，注射miRNA-361反义核苷酸的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低，有统计学差异(P〈0. 01)。
心梗面积按如下方法计算左心室面积(left ventricle, LV)、危险区总面积 (area at risk, AAR)和梗死区面积(infarct area, INF)之间的关系为(请发明人改变描述方式，避免使用颜色作表述)危险区面积(AAR/LV，%)=(危险区总面积/左心室面积)X 100%,心梗面积(INF/AAR, %)=(梗死区面积/危险区总面积)X 100%。同时又检测了注射miRNA-361反义核苷酸对I/R所诱导的凋亡的影响，用TUNEL试剂盒(购自Sigma公司)，按照试剂盒操作说明书进行检测，结果如图3B所示，miRNA-361反义核苷酸能减小I/ R所诱导的凋亡。
实验例4抑制内源性的miRNA-361能降低缺血再灌注所致心功能失调。
此实验所用的miRNA-361的抑制剂均为经过修饰的miRNA-361反义核苷酸，修饰方式为对miRNA-361反义核苷酸的每个碱基都进行了 2,-甲氧基修饰用以增加miRNA-361 反义核苷酸在体内的稳定性。反义核苷酸的修饰及合成都是由上海吉玛公司完成的。
将实验小鼠分成4组，每组6只小鼠。向各组别小鼠注射miRNA-361的抑制剂(注射量为30mg/kg/天)，用以抑制内源性的miRNA-361，3天后进行心脏缺血再灌注手术，以每只小鼠的注射量为30mg/kg/天的miRNA-361反义核苷酸阴性对照(的I/R组作为阴性对照组(NC) (5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’ (SEQ ID NO: 7)，并且每一个碱基均进行了 2’-甲氧基修饰，由上海吉马公司合成)，再灌注一周后进行超声心动的功能检测，检测指标包括左室舒张末内径(LVIDd)、左室收缩末内径(LVIDs)、和短轴截短率(FS)，结果如图4所示，miRNA-361的抑制剂能够减小缺血再灌注引起的心脏功能的损伤。
权利要求
1.一种单链非编码miRNA-361反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途，所述miRNA-361反义核苷酸的序列为下述SEQID NO: 2所示的核苷酸序列5，-⑶ACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3，。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于，所述miRNA-361反义核苷酸的核苷酸序列在每个碱基均进行了 2’ -甲氧基修饰。
3.按照权利要求I或2所述的用途，其特征在于，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
4.一种预防或治疗心脏疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效剂量的权利要求I至3中任一项中所述的miRNA-361反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料，优选地，所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种，还优选地，所述药物组合物的给药方式选自口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。
5.根据权利要3或4所述的药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。
6.一种单链非编码miRNA-361核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，所述miRNA-361核苷酸的序列为下述SEQID NO: I所示的核苷酸序列5， -UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3，。
7.按照权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
8.一种用于诊断或预后心脏疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效剂量的权利要求6或7中所述的miRNA-361核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物在用于制备诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种miRNA-361及其反义核苷酸的用途，具体为所述miRNA-361反义核苷酸序列在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途，所述miRNA-361核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。本发明人通过大量的实验证明miRNA-361反义核苷酸在心肌缺血损伤及心肌细胞凋亡中的变化及其心肌保护作用。本发明所述的miRNA-361反义核苷酸具有抑制心肌缺血损伤及抑制心肌细胞凋亡的功能。miRNA-361反义核苷酸可以作为一种新型的药物作用靶点，对于由心肌缺血引起的心肌纤维化、冠心病及心衰等心脏疾病的预防及治疗在临床上具有重要意义。
文档编号A61P9/10GK102921021SQ20121048700
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者李培峰, 王昆 申请人:中国科学院动物研究所