专利名称：经修饰的树突状细胞及包含该树突状细胞的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及医学领域，具体地，本发明涉及一种经修饰的树突状细胞及包含该树突状细胞的疫苗。
背景技术：
树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前已知抗原递呈能力最强的抗原提呈细胞，引起当前肿瘤免疫治疗的密切关注。DC能摄取、加工抗原，表达高水平MHC分子、共刺激分子、细胞粘附分子ICAM-l、ICAM-3以及淋巴细胞功能相关抗原-3 (lymphocyte functionassociated antigen LFA_3)等有助于抗原提呈的分子，并分泌高水平Thl型细胞因子IL-12，有效地向T淋巴细胞提呈抗原，启动患者自身特异性杀瘤免疫反应。但大量的实验表明肿瘤患者体内的DC处于ー种“无能状态”，在体内对肿瘤抗原的提呈作用较弱。DC与肿瘤的发生发展及预后关系密切，肿瘤的发生可能与肿瘤浸润性DC或宿主DC功能缺陷有·关，此情况下它们无法有效地提呈肿瘤抗原，激活T细胞识别并杀伤肿瘤细胞；产生此情况的机制为肿瘤细胞释放的可溶性因子作用于DC使其表面分子的表达发生变化，引起肿瘤的免疫逃逸。大多数研究表明体内肿瘤抑制了 DC的成熟而非直接抑制DC的功能。Lissoni等在对40例癌症病人的临床研究中发现癌症患者外周血中成熟和不成熟DC百分比均明显低于对照组，且有转移灶者显著低于无转移者，说明DC的缺乏在诱发肿瘤的免疫抑制中起重要作用。故体外诱导功能性DC用于主动免疫治疗有重要的临床应用价值。不同类型的肿瘤抗原刺激DC所诱导的抗肿瘤效应强弱不等，有的甚至无效，因此，寻找合适的肿瘤抗原刺激DC尤为重要。目前主要有以下两种肿瘤抗原刺激DC的方式(I)全细胞性肿瘤抗原致敏方式由于目前大多数肿瘤特异性抗原类型尚未明确鉴定，因而可对DC给予全细胞性肿瘤抗原刺激，由DC去选择肿瘤抗原并对其进行加工、提呈。目前制备全细胞性肿瘤抗原可采用快冻慢融法、照射法、化学药物处理法、加热法等。(2)肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen, TAA)基因转染方式大多数MHC限制性肿瘤抗原肽的半衰期仅2-10h，若要诱导出高水平持久的抗肿瘤免疫效应，则要反复多次回输负载肿瘤抗原肽的DC。若将TAA基因以DNA或RNA的形式导入DC，使DC持续以合适的方式将肿瘤抗原的多个表位与MHC结合，表达于DC的表面，能更有效地激活T细胞产生针对TAA的强烈的、特异性的抗肿瘤免疫反应。以TAA基因转染DC制成DC疫苗进行肿瘤基因免疫治疗已成为当前的研究热点。在基因运载方面，病毒载体以其高效和良好的靶向性在基因治疗中得到广泛的应用。目前用于基因修饰的病毒载体主要有逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)。它们各自的优缺点简述于表I中。表I病毒载体类型I优点[缺点
逆转录病毒持久表达目的基因、宿主范围广、基随机插入，可导致插入哭变、感 因容量较大、免疫原性低染效率低、不能感染非増殖状态
的细胞(不能用于转导单核细胞来源的DC )、!■巴向性差腺病毒宿主范围广、基因转移效率高、对非无靶向性、基因表达持续时间短、_
分裂细胞也有感染性、易制备、遗传病毒载体能引起机体较强的免疫 毒性较低反应
腺相关病毒对人体无致病性、免疫原性低、宿主病毒感染后,外源基因需经较长 范围广(能感染分裂细胞和非分裂细时间后才能表达、对细胞的感染 胞)、外源基因可持续稳定表达和转导效率低_·
慢病毒基因容量大、宿主范围广(能感染分外源基因随机插入宿主基因组，
裂细胞和非分裂細胞)、外源基因可可能导致插入突变持续稳定表达、对细胞的感染和抟导效率高、免疫原性低、安全性较高(经_[过改造的新一代病毒载体)_ __由表I可知，慢病毒载体与其它病毒载体相比有着巨大的优越性，且有研究表明，慢病毒感染后的DC细胞的抗原提呈能力与正常DC细胞相比没有明显差异，因此慢病毒可作为基因修饰DC的良好载体，介导特异性的抗肿瘤免疫应答。视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)，发生于视网膜核层，是儿童眼部最常见的原发性恶性肿瘤，近年来发病率有所上升。目前针对RB的研究显示，原致癌基因SYK(spleen tyrosine kinase)在RB细胞中表达增强，SYK的小分子抑制剂能诱导RB细胞死亡(Zhang 等，Nature，DOI :10. 1038/naturel0733 (2012))。而 SYK 基因在肿瘤疫苗中的应用却未见报道。
发明内容
针对目前视网膜母细胞瘤高发的情況，本发明提供ー种SYK基因修饰的DC细胞及包含该DC细胞的疫苗，用于针对视网膜母细胞瘤的主动免疫治疗。本发明的目的通过以下技术手段得以实现一种经修饰的树突状细胞，包含利用病毒载体转染至其中的SYK基因。ー种用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其活性成分为本发明的经修饰的树突状细胞。本发明的SYK基因修饰的DC疫苗制备エ艺简便，所得的慢病毒转染的DC细胞在以下方面细胞表面⑶80、⑶83、⑶86分子的表达水平，与CIK细胞共培养后得到的LV-DC-CIK细胞中⑶3+⑶56+T细胞的百分比及该LV-DC-CIK的杀瘤率，细胞培养上清液中IFN- y的分泌量，均显著高于对照组，因此本发明的DC疫苗有良好的主动免疫治疗效果。
图I为本发明实施例中获得的LV-DC细胞(a)及对照Con-DC细胞(b)表面⑶80分子的流式检测结果；图2为本发明实施例中获得的LV-DC细胞(a)及对照Con-DC细胞(b)表面⑶83分子的流式检测结果；图3为本发明实施例中获得的LV-DC细胞(a)及对照Con-DC细胞(b)表面⑶86分子的流式检测结果；图4为本发明实施例中获得的LV-DC-CIK细胞(a)及对照Con-DC-CIK细胞(b)中⑶3+CD56+T细胞的流式检测结果；图5为本发明实施例中获得的LV-DC-CIK细胞(a)及对照Con-DC-CIK细胞(b)对RB细胞杀伤作用的流式检测结果；
图6为本发明实施例I中步骤I中的PCR反应条件；
图7为本发明实施例I中步骤9中的PCR反应条件。
具体实施方式
·为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进ー步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用干限定本发明。本发明实施例提供ー种基因修饰的DC细胞，包含利用载体转染至其中的SYK基因。优选地，所述DC细胞来源于哺乳动物外周血，更优选地，所述DC细胞来源于人外周血。优选地，所述载体为病毒载体。病毒载体在基因转染方面具有高效性和非常好的靶向性等优点，在基因修饰领域得到广泛应用。目前用于基因修饰的病毒载体主要有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。更优选地，所述载体为慢病毒载体，在本发明的优选实施例中使用TOPO表达载体。此类慢病毒载体由HIV病毒经基因改造获得，可使外源基因SYK基因持续稳定表达，并具有较高的转导效率及安全性。本发明实施例中使用SYK基因作为长期刺激DC细胞的肿瘤抗原基因，所述基因为人的SYK基因的全长编码序列(SEQ ID NO: I )，其全长编码序列(⑶S)长约I. 9kb，该全长编码序列携帯其全部功能基因，以使得更全面地刺激DC细胞发生抗肿瘤免疫反应。该SYK基因序列可由生产商合成或直接购买自生物公司。本发明实施例中，通过PCR反应进行该SYK基因的扩增，该PCR技术为本领域技术人员所熟知。优选地，用于扩增SYK基因的PCR反应的引物序列为正向引物Pl :5’ -ATGGCCAGCAGCGGCATGGCTG-3，(SEQ ID N0:2)；反向引物P2 :5’-TTAGTTCACCACGTCATAGTAG-3’(SEQ ID NO:3)。本发明实施例中，将SYK基因克隆至慢病毒载体T0P0，构建含SYK基因的TOPO载体。然后将所得TOPO载体转化至感受态细胞，本发明实施例中使用大肠杆菌作为感受态细胞，其为常用的感受态细胞，具有繁殖快速，培养方式简单等优点。将转化有含目的基因的重组慢病毒载体的大肠杆菌扩大培养后提取质粒并鉴定，以确定正确转入，然后将重组慢病毒质粒及其辅助包装质粒共转染至包装细胞中，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在HT1080细胞中测定并标定病毒滴度。
将上述携帯有SYK基因的慢病毒转染至体外诱导获得的树突状细胞中即得到本发明的DC细胞疫苗，对所得DC细胞进行相关的免疫学分析以确定其作为疫苗的效カ，其中所述免疫学分析包括DC细胞成熟度检测，即DC细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达水平的检测，体外杀瘤率检测，细胞表型及分泌细胞因子的检测。本发明实施例还提供ー种用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其活性成分为本发明的树突状细胞。优选地，本发明实施例的疫苗用于预防视网膜母细胞瘤。本发明实施例中获得的转染有SYK基因的DC细胞表面⑶80、⑶83、⑶86分子的表达水平为对照组的I. 61-1. 79倍；在与CIK细胞共培养后得到的LV-DC-CIK细胞中⑶3+CD56+T细胞的百分比约为对照组的4. 8倍，细胞培养上清液中IFN- y的分泌量约为对照组的2倍；在效靶比为40 I时所得LV-DC-CIK对RB细胞的杀瘤率约为对照组的2. 2倍，因此本发明的DC疫苗有良好的主动免疫治疗效果。现以具体的SYK基因修饰的DC疫苗制备及免疫学分析方案为例，对本发明进行详细描述。实施例I一种经修饰的树突状细胞，包含利用病毒载体转染至其中的SYK基因。其中，该经修饰的树突状细胞制备方法如下I. SYK基因片段的扩增PCR扩增模板为携带有SYK基因(NCBI RefSeq:NM 003177. 3)全长cDNA的质粒(PCMV6-XL5)，该质粒购自OriGen生物公司，其中SYK基因的CDS序列(SEQ ID N0:1)长约I. 9kb0 用于PCR扩增弓丨物序列为Pl :5，-ATGGCCAGCAGCGGCATGGCTG-3，(SEQ ID NO:2)P2 :5’ -TTAGTTCACCACGTCATAGTAG-3’ (SEQ ID NO:3)其中Pl为正向引物，P2为反向引物。用于扩增SYK基因的PCR反应体系如下
权利要求
1.一种经修饰的树突状细胞，其特征在于，包含利用病毒载体转染至所述经修饰的树突状细胞中的SYK基因。
2.如权利要求I所述经修饰的树突状细胞，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。
3.如权利要求I所述经修饰的树突状细胞，其特征在于，所述SYK基因序列为如SEQIDNO: I所示的全长编码序列。
4.如权利要求3所述经修饰的树突状细胞，其特征在于，用于扩增所述SYK基因序列的引物序列为正向引物 Pl :5’ -ATGGCCAGCAGCGGCATGGCTG-3’ (SEQ ID N0:2)； 反向引物 P2 :5’-TTAGTTCACCACGTCATAGTAG-3’ (SEQ ID NO:3)。
5.一种用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的活性成分为权利要求1-4任一所述经修饰的树突状细胞。
6.如权利要求5所述的用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述肿瘤为视网膜母细胞瘤。
全文摘要
本发明涉及生物技术及医药领域。本发明提供一种经修饰的树突状细胞，利用病毒载体将SYK基因转染至其中，本发明还提供一种活性成分为该经修饰的树突状细胞的疫苗，该疫苗用于针对肿瘤的预防和主动免疫治疗。本发明的转染有SYK基因的DC细胞成熟度、所得LV-DC-CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的百分比及杀瘤率、细胞培养上清液中IFN-γ的分泌量等方面均高于对照组。
文档编号C12N5/10GK102787097SQ20121017520
公开日2012年11月21日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者李志惠 申请人:李志惠