抗体人源化改造方法

专利名称：抗体人源化改造方法
技术领域：
本发明涉及一种人源化抗体及其人源化改造方法。
背景技术：
P185是由癌基因Her2/erbB_2编码的一种细胞表面的重要的受体酪氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族。P185/Her2受体与该家族其他成员类似，由胞外区，跨膜区和胞内区三个结构域组成，其中胞外区(ECD)又分为四个亚区，其中的I、III亚区为亮氨酸富含区，II、IV亚区为半胱氨酸富含区(Carpenter G. (1987) Receptors of epidermal growthfactor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Biochem. 56:881-914)。表皮生长因子家族受体广泛地分布于多种组织，尤其在上皮组织、间质组织以及神经发生组织中表达，在调节细胞的増殖、分化、发育、黏附和迁移中起到了重要的作用。P185/Her2作为表皮生长 因子受体家族的信号转导网络中最重要的ー员，其表达水平的异常与细胞信号转导紊乱、肿瘤的发生和恶性发展紧密相关(Nancy EH, Heidi A, Lane N. (2005) ErbB receptors andcancer:the complexity of targeted inhioitors Nat. Rev. Cancer 5:341-354)。近年来P185/Her2 —直作为肿瘤治疗领域中的热点被广泛研究。1985年，Greene M. I.研究组发现,抗P185/Her2胞外区的单克隆抗体能够使已经转化的Her2高表达的NIH3T3表型逆转，使肿瘤细胞的表型趋于正常化，同时可以下调Her2受体的表达水平(Drebin JA, Link VC, Stern DF, Weinberg RA, Greene, MI. (1985)Down-modulationof an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype bymonoclonal antibodies. Cell 41:695-706)。随后该实验室又发现，抗Her2的单克隆抗体能抑制移植入裸鼠体内的Her2转化的NIH3T3肿瘤细胞的生长，从而第一次通过体内实验证明了抗Her2单抗可能对Her2高表达肿瘤有临床治疗的价值(Drebin JA, LinkVC, Weinberg RA, Greene MI. (1986) Inhibition of tumor growth by a monoclonalantibody reactive with an oncogene-encoded tumor antigen. Proc Natl Acad Sci USA83:9129-9133)。这ー发现大大促进了抗Her2单克隆抗体的抗肿瘤作用的研究，也掲示了抗体在肿瘤治疗上应用的前景。但是，由于目前杂交瘤技术制备的单克隆抗体都是鼠源抗体，应用于人体时会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，所以不能直接用于人体内的疾病治疗。因此必须对单克隆抗体进行人源化改造，以减少和消除鼠源蛋白的免疫原性。最早用于单克隆抗体人源化改造的方法是构建嵌合抗体(Vaughan TJ, OsbournJK, Tempest PR. (1998)Human antibodies by design. Nat. Biotechnol 6:535-539)。该方法是将鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区通过基因工程技术连接起来，即将鼠源抗体的恒定区基因替换为人抗体恒定区基因，与抗原结合的可变区部分仍然是鼠源抗体。此方法构建出的工程化嵌合抗体最大限度的保留了识别靶抗原能力的鼠源抗体可变区，同时又拥有了人抗体所有的恒定区的免疫学杀伤效应，而且由于这种嵌合抗体的免疫原性相比原始的鼠源抗体降低了 2/3，所以可以应用于人体治疗(Davis TA. (1999) Final reporton the saiety and elficacy of retreatment with rituximab lor patients withnon-Hodgkin’s lymphoma. Blood 94:88a)。但由于其分子中还保留了 1/3的鼠源部分,用于长期临床治疗还有可能发生人抗鼠抗体反应。因此，为了进ー步降低嵌合抗体的免疫原性，需要对嵌合抗体的鼠源可变区进行进ー步的人源化改造，获得全人源化抗体。目前应用较多的全人源化方法是将鼠源抗体可变区内參与抗原结合的部分与选择用于做模板的人抗体可变区的框架区重新拼接，使抗体可变区中除高度可变的互补决定区(CDR)来源于鼠抗体外，其余部分都换成人源的。由于抗体可变区中參与抗原结合的一般是其6个互补决定区(CDR)，故此过程也被称为“CDR移植”，然后为了克服由于“CDR移植”可能导致的亲和カ下降，需通过一系列对框架区残基的突变，逐步恢复或提高抗体的抗原结合能力，从而得到人源化程度更高的重构抗体(JonesPT,Dear PH, Foote J. u986)Replacing the complementarity-determining regions ina human antibody with those from a mouse,Riechmann L, Clark M, Waldmann H. (1988)Reshaping human antibodies for therapy, Chothia C, Lesk AM, Tramontano. (1989)AConformations of immunoglobulin hypervariable regions)。已手艮道的构建重构抗体的方法依照其人源化改造使用的模板的选择和回复抗体结合能力的方法，主要又可以分成两种。其一，通过序列対比，以序列相似性为标准分别选择相似性最高的抗体轻链和重链可变 区的人源抗体为模板序列，在经过CDR移植后的轻、重链序列基础上，针对可能影响结合能力的框架残基分别构建一系列突变体，鉴别合适的突变组合。这些突变体需各自独立制备及测试其抗原结合能力，然后将较好的突变组合起来，即需要对各个可能的残基的突变、筛选的重复循环实验，所以步骤繁复，效率低，效果不理想。其ニ，也是目前抗体人源化的ー种通用方法。具体的做法是，将非人源(例如鼠源)抗体的CDR移植于通用的人源抗体可变区模板VL K I -VH III的构架上，通过对ー组选定的关键框架区残基进行随机诱变，构建抗体Fab的噬菌体文库，再通过噬菌体亲和カ筛选鉴别出最佳框架序列。此方法相比第一种可以更快速地获得优化的框架序列，并可在此基础上进ー步提高抗体的抗原亲和カ；但是由于其选用的是通用模板，虽有普适性，但对不同抗体来讲可能不是最优的，另外通过构建噬菌体库筛选高亲和カ抗体的方法也比较复杂，费时费力。

发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，是如下任一所述蛋白质a)由序列表中序列3中自N末端起第1_253位氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl_2 Vl+Linker+Vh)b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(Hl-2 VL+Linker+VH+Fc)C)将a)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；d)将b)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第254-489位(Fe片段)氨基酸经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；e)由序列表中序列I中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；(H1-1 Vl+Linker+Vh)
f)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(m-1 VL+Linker+VH+Fc)g)将e)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；h)将f)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第254-489位(Fe片段)氨基酸经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；i)由序列表中序列5中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；(H1-V1 VL+Linker+VH)j)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(H1_V1 VL+Linker+VH+Fc)k)将i)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸经过ー个或几 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质；I)将j)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第254-489位(Fe片段)氨基酸经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白质。所述编码基因为如下任一所述I)编码所述a)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列4自5'末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；2)编码所述b)所不蛋白的编码基因为核昔酸序列是序列表中序列4所不DNA分子;3)编码所述e)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；4)编码所述f)所不蛋白的编码基因为核昔酸序列是序列表中序列2所不DNA分子;5)编码所述i)所示蛋白的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列6自5'末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；6)编码所述j)所不蛋白的编码基因为核昔酸序列是序列表中序列6所不DNA分子;7)在严格条件下与I)-6)任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；8)与I) -6)任一限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。所述重组载体是在pSectag2A载体的多克隆位点插入所述编码基因得到的。本发明的另ー个目的是提供ー种抗体。本发明所提供的抗体，由两个相同的上述任一所述蛋白組成；所述两个相同的蛋白通过ニ硫键连接。上述任一所述蛋白在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述抗体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另ー个目的是提供ー种抗体的人源化改造的方法。本发明提供的抗体的人源化改造的方法包括如下步骤(I)、按照如下I或II所述方法选择得到人源化抗体模板I、选择重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人源化抗体作为人源化抗体模板；
II、选择满足如下i )和ii )所示条件的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板；i )重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；ii)重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区分别与待改造抗体的重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人源化抗体作为人源化抗体模板；所述可变区空间结构为如下a)和/或b)所示a)重链可变区和轻链可变区一起构成的空间结构；b)重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结构；未知空间结构的抗体，可通过软件模拟出其空间结构，包括重链可变区和轻链可变区一起构成的空间结构，和重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结构。(2)、按照如下III或IV所示方法获得被置換后的人源化抗体模板III、用所述待改造抗体的重链可变区和轻链可变区中的至少ー个⑶R氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的CDR氨基酸序列，获得被置換后的人源化抗体模板；(未知⑶R区的抗体,可通过综合Kabat等人和Chothia等人的序列定义进行鉴定，将两种方法鉴定结果的综合值作为最终值，即取两鉴定结果中的最小值至最大值区段作为CDR 区)。IV、用所述待改造抗体的抗原结合区氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的抗原结合区氨基酸序列，获得被置換后的人源化抗体模板；(3)、将所述步骤(2)中的被置換后的人源化抗体模板作为改造后的目的人源化抗体；(4)用基因工程方法表达得到所述改造后的目的人源化抗体。上述方法中，在所述步骤(2)后，所述步骤(3)前，包括如下回变步骤将所述步骤
(2)得到的抗体的框架区的至少ー个氨基酸残基替换为所述待改造抗体中相应位置的氨基酸残基，至得到的抗体空间结构稳定，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。(回变满足如下两个条件1)人源化程度高，2)使得到的抗体结构稳定；所述可变区为重链可变区和/或轻链可变区；)上述方法中，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基为影响步骤(2)得到的抗体的CDR区结构稳定性或影响步骤(2)得到的抗体的抗原结合区结构稳定性的氨基酸残基；上述方法中，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2 )得到的抗体的游标区和/或被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2)得到的抗体的侧链中距离所述CDR氣基酸残基3埃以内；上述方法中，在所述回变后，所述步骤(3)前，包括如下人源突变步骤将所述回变得到的抗体的框架区内非人源的且不同于所述待改造抗体中相应位置氨基酸的氨基酸残基突变为人源氨基酸残基，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。由上述任一所述方法得到的人源化抗体也属于本发明的保护范围。本发明的抗体是特异识别肿瘤表面抗原P185HdkbB-2的嵌合抗体ChA21的人源化抗体变异体。本发明所提供的ChA21的人源化抗体变异体包括原嵌合抗体ChA21中鼠源的单链 抗体被完全人源化的scFv、铰链区和人源的Fe区。其中被人源化的scFv的氨基酸序列为DIVLTQSPDSLAVSLGERVTINC KSSQTLLYSNNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIS ffAFTRKS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYC QQYSNYPffT FGAGTKLEIKR GGGGSGGGGS GGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKAS GYSFTGYFIN WVKQNPGQRLEffIG HISSSYATSTYNQKFKG KATLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVR SGNYEEYAMDY WGQGTLVTVS.下划线部分分别为抗体的3个轻链和3个重链顺序排列的共6个互补决定区(⑶Rs)，黑体部分为轻重链可变区之间的连接区(Linker)。本发明改造后的抗体构架未改变的最初的嵌合抗体相比，与抗原的亲和カ相近，并已经达到了完全的人源化，具有更好的临床应用前景。本发明的人源化抗体改造方法包括如下步骤基于目标抗体的可变区序列和结构信息的人源抗体模板的选择首先，将需人源化的目标抗体(ChA21)轻、重链可变区的序列分别通过IgBLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)进行序列相似性搜索,将轻、重链均有较高相似性(大于50%)且有晶体结构的若干个人源抗体作为候选的人源化模板；再通过分子叠合比较候选模板抗体和目标抗体框架区的结构相似性，选择结构相似度最高的一种作为抗体人源化的模板。如果目标抗体没有晶体结构数据，可以通过同源模拟获得模拟分子结构再进行比较。抗原结合区的移植首先，选择目标抗体的抗原结合区段。对于没有晶体结构数据的抗体，一般是选择其互补决定区(⑶R);(抗体的⑶R序列可以通过综合Kabat等人和Chothia等人的序列定义加以鉴定)对于有抗体和抗原复合物晶体结构的抗体，可以综合CDR序列和结构数据获得其抗原结合区域。然后，将选择的区段残基替换人源模板抗体相应位置上的残基，得到最初版本的人源化抗P185/Her2抗体序列命名为为H1，并通过计算机同源模拟得到Hl的模拟的空间结构。框架区残基回复突变位点的选择基于模拟的Hl结构，采用计算生物学方法，对ー些重要的框架区残基进行突变方向的筛选。这些残基包括所有游标残基(Vernier)和所有侧链距离⑶R残基3埃以内的框架区残基，选择更符合抗体结构稳定性的位点为需要突变的方向。具体到本例中，最初人源抗体Hl的轻链可变区VL的第4和49位残基以及重链可变区VH的第71和93位残基，被选择需突变为目标抗体上的相应残基，即VL第4残基甲硫氨酸被亮氨酸取代，第49位残基酪氨酸被丝氨酸取代的第71残基丙氨酸被缬氨酸取代，第93位残基苏氨酸被缬氨酸取代。由此获得人源化的 抗P185/Her2抗体序列H1-1。根据改造后亲和カ分析结果和进ー步提高人源化程度的需要，还可对ー些CDR区以外的非抗原结合残基进行人化修饰，如具体到本例子为Hl-I中VL区的残基5、21和106以及VH区的残基61、62、80和91，则选择数据库中人源抗体相应位置上出现频率较高的残基将它们分别替换，最終获得比最初版本人源化程度更高的抗P185/Her2抗体序列H1-2。本发明所提供的方法与现有抗体人源化改造方法相比，有如下优点和特异性首先，本方法在人源化模板抗体的选择上，不同于以往方法分别选择与轻链和重链相似的的两个人源模板序列，而是选择轻重链均与目标抗体有较高相似度的ー种人源抗体作为模版，且候选模板抗体尽量选择有晶体结构数据的，通过比较候选模版抗体和目标抗体的整体结构的相似性，最终决定出模板抗体。这种将抗体的轻重链作为ー个整体来考虑，所选轻重链模板来自于同一个抗体，本身就是来自天然构架，相比以往人为组合轻重链的方法更有利于轻重链框架区结构的稳定性，而且在选择框架区残基突变时，可以不用再考虑是否需要突变轻重链界面残基来使轻重链相互作用更稳定的问题。其次，按结构相似性选择模板相比以往单纯的通过序列相似性筛选模板更具有结构合理性。因为抗体与抗原的结合直接取决于抗体互补决定区的构象，而互补决定区又是搭建于框架区所构建的平台之上的，所以人源模板与目标抗体的空间结构相似性越高越利于移植后的互补决定区构象的維持，即越利于保持抗体结合抗原的能力。序列相似性虽然在一定程度上可以代表结构相似性，但并不很精确。例如本发明实施例一中，具有最闻序列相似性的若干模板却不是结构相似性最好的。再次，在选择框架区残基突变时，结合抗体结构数据分析，可以直观迅速的作出应突变位点的选择。根据结构稳定的需要来选择游标残基中的那些有可能影响CDR区结构的残基以及决定其他一些位于抗体分子表面且可以进ー步人源化的残基是否突变以及突变的方向，将以往需要多轮突变筛选或是通过噬菌体库筛选突变的方式大大简化，将所有突变选择集中在一起进行结构分析及其可行性，直接一步获得最終的突变方案。因此相比以往方法，本方法更加简捷明确。最后，相比于现有人源化方法，本方法的改造效果也更高ー些。通过本方法得到的ChA21抗体人源化的版本H1-2具有与原始抗体相当的抗原结合活性，相对亲和力约为原始抗体的93%左右。而已报道的通过通用抗体人化方法改造后的抗体的亲合力有高有低，水平很不稳定(Carter P，Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, RowlandAM, Kotts C, Carver ME, Shepard HM. (1992)Humanization of an anti_pl85HER2 antibodyfor human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289，Presta LGj Chen H，0Connor SJ，Chisholm V，Meng YGj Krummen L, Winkler M，Ferrara N，(1997)Humanizationof an anti-VEGF monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and otherdisorders, Cancer Res. 57:4593 - 4599)。为直接比较本方法和通用方法的改造效果，在本发明实施例中同时应用通用人源化方法中的通用人源模板VL K I -VHIII对ChA21进行人源化改造，得到ChA21的另ー个人源化版本H2-1，通过亲和力測定发现H2-1的亲和カ相比原始抗体下降了一倍以上，说明就本例中的抗体ChA21而言，本发明中的人化方法的改造效果明显好于现有其他方法。本领域已知有各种不同方法可用于表达和纯化人源化的抗体。如大肠杆菌表达系统，操作简单快速，成本低，但是可溶性抗体表达量低(100ug/L)，表达产物不能正确修饰，容易形成包含体，纯化困难，不同突变体克隆之间表达量差异很大，使下一歩抗体亲和カ的测定受抗体浓度影响，不易判断；酵母表达系统，如pPIC9K载体,分泌表达,可用His-tag柱纯化，纯化较方便，但需要构建稳定细胞株，周期长，表达量虽然比大肠杆菌系统高(一般在mg/L级别)，但不同突变体克隆之间表达量差异也很大；而本发明中采用的293T真核瞬时表达系统，以pSectag2A为载体,可分泌表达,产物可用His_tag柱或蛋白A柱纯化，因此将设计好的人源化抗体的重组质粒DNA经脂质体瞬时转染293T细胞，表达产物能正确修饰，纯化简单，表达量较高(3 — 10mg/L)，且不同突变体克隆之间表达量差异小，虽然花费相对较高，但用此系统表达纯化的抗体性质测定结果明确、稳定。另外，应用ELISA法測定抗体表达量和相对亲和力，结果准确，重复性好，且无需对表达上清进行纯化，便于快速鉴定筛 选出人源突变体。


图I为抗体ChA21轻链和重链的可变区氨基酸序列，序列编号依照Kabat规则排序。下划线部分为综合Kabat和Chothia的序列定义划分出的互补决定区(⑶Rs)。图2为抗体ChA21的单链可变区(scFv，PDB号2GJJ)同选定的人源模板抗体huCC49 (PDB号1ZA6)的可变区的空间结构比对結果。图3为抗体ChA21的单链可变区与其识别抗原部分亚区的复合物结构。图4用于说明通过ChA21的抗原结合区移植获得的最初版本的人源化抗体Hl的氨基酸序列，以及同原始鼠源抗体和人源模板抗体的可变区ー级序列比对。图5是通过计算机同源模拟得到的人源化抗体Hl-I的分子模型。图6用于说明在人源化抗体Hl序列及结构基础上进行一系列的框架区残基突变的选择結果，以及和获得的新的人源化抗体变异体Hl-I和H1-2的序列的比较。互补决定区用方框标出。图7用于说明以基于通用模板VL K I -VH III获得的人源化抗体hu4D5 (PDB号1FVC)为人源模板对ChA21进行人源化改造，以及获得的人源化抗体H2-1的氨基酸序列。图8为人源化抗体Hl-I和H1-2重组表达载体的构建示意图。图9为抗体ChA21和其各种人源化突变体的抗原结合曲线。将各种转染的293T细胞的上清中的抗体的起始浓度都配制成lug/ml，再通过ELISA检测各种突变体与抗原的结合曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、嵌合抗体chA21的人源化改造
嵌合抗体chA21的序列早已由L. S. Cheng等人描述(Chen L. S. , Liu A. P. , Liu.J. Construction,expression and characterization of the engineered antibodyagainst tumor surface antigen P185c_erbb_2. Cell Res. 2003，13:35-48),如图 I 所不。嵌合抗体chA21的结构两条相同的蛋白链通过在Fe区形成的ニ硫键结合。姆条蛋白链依次由轻链可变区(\)、linker、重链可变区(Vh)和Fe区依次连接组成，其氨基酸序列如SEQ IDN0:9 所示，其中，第 1-114 位为第 115-134 位为 linker，第 135-253 位为 Vh，第 254-489位为Fe。一、人源抗体模板的选择序列相似性比对将chA21的轻链可变区与人源化抗体的轻链可变区进行氨基酸序列相似性比对，将chA21的重链可变区与人源化抗体的重链可变区进行氨基酸序列相似性比对。通过 IgBLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)在蛋白数据库(PDB,Protein Data Bank)中分别进行序列相似性搜索。具体选择搜索參数如下程序blastp ；提交序列来源mouse ;数据库pdb ;比对序列来源human。显示比对结果的数量可以根据 比对结果来具体选择，其他參数可选择默认參数。在搜索的结果中，选择与轻、重链均有较高序列相似性的抗体作为候选人源化抗体模板，一般选择相似性在50%以上作为选择阈值，也可以根据具体的搜索结果选择不同的阈值。在ChA21的比对结果中，由于序列相似性高于50%的候选模板太多，所以提高选择阈值，选择两条链相似性均高于60%的抗体作为候选人源化抗体模板；结构相似性比对再应用PyMOL软件通过分子叠合(align)比较候选人源化抗体模板和ChA21的可变区(scFv，PDB号2GJJ)的整体空间结构相似性(即蛋白中重链可变区和轻链可变区一起组成的空间结构)和框架区空间结构相似性(即蛋白中重链可变区中框架区和轻链可变区中框架区一起组成的空间结构)(由RMS表示其结构间差异的大小)，各候选模板的序列比对和空间结构比对结果见表I (所有表中的序列编号均采用Kabat序列编号)。选择结构相似度最高的huCC49 (PDB 1ZA6)(表中看应该是最低)作为嵌合抗体ChA21人源化的模板，两抗体空间结构的比对见图2。其中模板IFVC是抗体4D5基于通用人源抗体模板VL k I -VHIII进行人源改造而获得的已经人源化的抗体hu4D5，其框架区序列与VLk I -VHIII基本一致，基于此通用模板结构对ChA21同时进行人源化改造，用以比较本发明方法和通用方法的人化改造效果。表I、ChA21可变区与各候选模板序列和结构相似性比对候选模板轻链可变重链可变轻链框架 s:链框架整体空间框架区空 结构区序列相 K序列相区序列相区序列相结构差异间结构差
—(PDB号)—似度％__似度％__似度％__似度％__(RMS)—异(RMS)
—1ZA6__78. I__61.7__79__73. 6 —_ 0. 666 0. 646 —— 1B4J__64__60. 5__76.5__73. 6__0. 679 __ 0. 662 _
—1I9R__62. 3__61. 7__76. 5__74. I__0. 705 __ 0. 675 _
—3DIF__65. 8__66. I__79__79. 3__0. 778 __0. 691 _
_3FCT__63. 2__60. 8__71. 6__73. 6__0. 841__ 0. 765 _
_ IFVC _58. 8 47. 5 J_71 b J_54 _|_ 0. 881 0. 866 _ ニ、抗原结合区的移植选择ChA21的抗原结合区段。抗体ChA21的⑶R序列可以通过结合Kabat等人和Chothia等人的序列定义加以鉴定，CDR序列划分结果见表2。最终划定的各CDR区为图I中带下划线的区段。表2、ChA21的互补决定区(⑶R)序列划分结果
CDR LOOPKabatChothiaCombine
LIL24-L34L24-L34L24-L34
L2L50-L56L50-L56L50-L56
L3L89-L97L89-L97L89-L97
HlH31-H35BH26-H32. . 34 H26-H35B
H2H50-H65H52-H56H50-H65
H3H95-H102H95-H102H95-H102由于抗体ChA21的单链可变区与其识别抗原部分亚区的复合物晶体结构数据已经获得解析，其抗原结合区段可以直观地从复合物结构上获得，如图3所示。可以看出重链CDR2的后半段位于抗体分子的表面，既不參与抗原结合，对其他CDR区结构也没有影响，也不參与抗体轻重链之间的相互作用，所以从提高序列人源化程度的要求考虑，将其作为非抗原结合区，而不移植ChA21的重链⑶R2上的此段序列。将其余⑶R区域的残基替换抗体huCC49 (1ZA6)相应位置上的⑶R区域的残基，得到最初版本的人源化抗体序列Hl (序列比较结果见图4)，并应用蛋白结构模拟软件MODELLER通过同源模拟得到其模拟的空间结构。(表3中给出的H3为H95-H102，此序列编号为Kabat序号，而非序列实际顺序编号，如图I中所标识的⑶R区H3序列为H95-H102 (SGNYEEYAMDY)，相对图4中其位置为101-111(SGNYEEYAMDY)这一段。)三、Hl框架区残基的突变选择(回变)
基于最初版本人源化抗体Hl的模拟的空间结构，对ー些重要的框架区残基进行突变方向的筛选首先考虑的ー类残基是可能影响互补决定区构象或结构的残基，或是可能直接影响抗原结合的残基，根据之前对于此类框架残基的研究，列出此类残基的清单(见表3)，这些残基包括近30多种对⑶R结构有潜在贡献的游标残基(Vernier);另外，在模拟的Hl结构中选择所有侧链距离CDR残基3埃以内的残基，从结构角度考虑这些残基也可能直接影响CDR区残基的构象，而且它们恰好都包括在表3所列的游标残基之中。通常需要将这些残基全部突变为原始抗体ChA21的相应位点的残基，称为“回变”，但这样做有可能会因为添加了非人源序列的元件而导致免疫原性増大的危险，因此，在对游标残基的回变选择过程中，可保留ー些侧链位于抗体分子表面的游标残基，同时对于回变之后可能会导 致回变的残基与其周围残基发生结构冲突的残基也应选择不回变，例如H69Leu->Phe。通过选择回变得到人源化序列H1-1，其模拟结构如图5所示。表3、游标残基突变选择
权利要求
1.抗体的人源化改造的方法，包括如下步骤 (1)、按照如下I或II所述方法选择得到人源化抗体模板 1.选择重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板； 从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人源化抗体作为人源化抗体模板； II、选择满足如下i)和ii )所示条件的人源化抗体，将其作为预人源化抗体模板； i)重链可变区和轻链可变区分别与待改造抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上； ii)重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区分别与待改造抗体的重链可变区的框架区和轻链可变区的框架区的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上； 从所述预人源化抗体模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性值最高的人源化抗体作为人源化抗体模板； 所述可变区空间结构为如下a)和/或b)所示a)重链可变区和轻链可变区一起构成的空间结构山)重链可变区中的框架区和轻链可变区中的框架区一起构成的空间结构； (2)、按照如下III或IV所示方法获得被置換后的人源化抗体模板 III、用所述待改造抗体的重链可变区和轻链可变区中的至少ー个CDR氨基酸序列置換所述人源化抗体模板中对应的CDR氨基酸序列，获得被置换后的人源化抗体模板； IV、用所述待改造抗体的抗原结合区氨基酸序列置换所述人源化抗体模板中对应的抗原结合区氨基酸序列，获得被置換后的人源化抗体模板； (3)、将所述步骤(2)中的被置換后的人源化抗体模板作为改造后的目的人源化抗体； (4)用基因工程方法表达得到所述改造后的目的人源化抗体。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步骤(2)后，所述步骤(3)前，包括如下回变步骤将所述步骤(2)得到的抗体的框架区的至少ー个氨基酸残基替换为所述待改造抗体中相应位置的氨基酸残基，至得到的抗体空间结构稳定，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基为影响步骤(2)得到的抗体的CDR区结构稳定性或影响步骤(2)得到的抗体的抗原结合区结构稳定性的氨基酸残基； 和/或，所述回变步骤中，被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2)得到的抗体的游标区和/或被替换的氨基酸残基位于所述步骤(2)得到的抗体的侧链中距离所述CDR氨基酸残基3埃以内； 和/或，所述方法中，在所述回变后，所述步骤(3)前，包括如下人源突变步骤将所述回变得到的抗体的框架区内非人源的且不同于所述待改造抗体中相应位置氨基酸的氨基酸残基突变为人源氨基酸残基，将得到的抗体作为改造后的目的人源化抗体。
4.由权利要求1-3中任一所述方法得到的人源化抗体。
全文摘要
本发明公开了一种人源化抗体及其人源化改造方法。该抗体是如下任一所述蛋白质a)由序列表中序列3中自N末端起第1-253位氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明改造后的抗体构架未改变的最初的嵌合抗体相比，与抗原的亲和力相近，并已经达到了完全的人源化，具有更好的临床应用前景。
文档编号C12N15/63GK102863533SQ201210175279
公开日2013年1月9日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者肖卫华, 刘兢, 胡思怡, 常亮 申请人:中国科学技术大学