专利名称：大豆光受体蛋白GmZTL2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种大豆光受体蛋白、其编码基因及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。
背景技术：
大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源。因为大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区域间的优异品种不能相互引种、生育期也受环境光周期的制约(Zhang等，2008)。如果能降低大豆对光周期的敏感性，突破光周期对大豆开花的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种育种方法具有对亲本的依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应性品 种。通过拟南芥对外界光周期反应的研究发现,拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，蓝光受体ZEITLUPE(ZTL)通过对生物钟核心成员HMING OF CAB EXPRESSION I (TOCl)的特异降解，实现对生物钟振荡器的调节。ZTL基因突变会影响生物钟周期，从而在光周期影响的开花途径中发挥重要作用。连续光照或连续黑暗条件下，过表达ZTL引起生物钟节律丧失，生物周期缩短(Kiyosue等,2000 ；Schultz等,2001 ；Somers等,2004)。ztl突变体生物周期延长至27h，并且在低光强红光或蓝光照射下，突变体的生物钟周期相较于高光强延长。在长日条件下，过表达ZTL引起下游CO和FT表达量下降影响开花(Kiyosue等，2000 ;Somers等，2004)。如果将ZTL突变体的研究应用于大豆育种工作中，有可能突破光周期对大豆开花的限制，就能解决大豆的引种问题，实现各区域间优质品种的相互交换，提高大豆产量和品质。
发明内容
本发明的目的是提供一个大豆光受体蛋白、其编码基因及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。包括(I)克隆一个大豆光受体基因GmZTL2 ;(2)提供基因及其蛋白的序列；(3)提供该基因在育种中的应用，尤其是在调节植物光周期以及开花时间中的应用。为了实现本发明目的，本发明提供一种大豆光受体蛋白GmZTL2，其氨基酸序列为a) SEQ ID No. I所示的氨基酸序列；b)SEQ ID No. I所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的大豆光受体蛋白GmZTL2的氨基酸序列(SEQ ID No. I)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第13位的谷氨酸(E)替换为天冬氨酸(D)，将第17位的甘氨酸(G)替换为丝氨酸(S)，将第11位的甘氨酸(G)缺失，将第515位增加一个甘氨酸(G)或增加一个亮氨酸(L)，不影响其生物活性。因此，本发明的大豆光受体蛋白GmZTL2还包括SEQ ID No. I所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氣基酸，具有与大ii光受:体蛋白GmZTL2同等活性的由GmZTL2衍生得到的蛋白质。本发明还提供编码上述的大豆光受体GmZTL2蛋白的基因。编码大豆GmZTL2蛋白的基因具有DSEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；或2) SEQ ID No. 2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的GmZTL2(全称为 Glycine max ZEITLUPE 2)是从大豆垦农 18 (Glycine max L. Kennong 18)中克隆到的一个基因，它与拟南芥ZTL蛋白的氨基酸序列之间的同源性为86. 8%,在保守功能域(LOV、F-box及Kelch repeats domain)更是高度同源。因此与拟南芥ZTL基因的功能类似，GmZTL2具有抑制开花的功能。本发明发现大豆GmZTL2基因在开花期的叶柄及荚中表达水平相对较高。本发明的一个实施例中，将GmZTL2基因构建到表达载体p35S_GW上，并在大肠杆菌DH5a中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将P35S-GW携带的GmZTL2基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。结果表明，GmZTL2具有降低植物对光周期的敏感性并抑制拟南芥开花的作用。在本发明的另一个实施例中，将GmZTL2基因构建到表达载体pYES_DEST52上，并在酵母菌株INVScl中诱导表达出C端融合His标签的重组蛋白，经镍柱纯化后测得该蛋白具有蓝光吸收活性。本发明还包括含有GmZTL2核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞，可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明大豆光受体GmZTL2蛋白的基因工程菌。本发明提供了含有上述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞或转基因植物。本发明提供了大豆光受体蛋白GmZTL2或其编码基因制备转基因植物中的应用。本发明提供了大豆光受体蛋白GmZTL2或其编码基因在大豆育种中的应用。本发明提供了大豆光受体蛋白GmZTL2或其编码基因在调节植物光周期和开花时间中的应用。本发明的优点在于(I)提供了大豆GmZTL2蛋白及其编码的基因；(2)通过在植物中过表达GmZTL2基因延长植物生育期，抑制植物开花。因此，本发明提供的GmZTL2蛋白及其编码基因可以调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的问题以及光周期敏感性问题和引种问题。
图I为本发明大豆光受体基因GmZTL2编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥、牵牛及小麦基因编码蛋白的氨基酸序列的比较；图2为本发明实施例3的植物表达载体p35S-GW的结构示意图3为本发明实施例4的克隆中间载体pGWCm的结构示意图；图4显示大豆光受体基因GmZTL2转化拟南芥，导致拟南芥晚开花；图5A为本发明实施例6的大豆光受体基因GmZTL2在大豆中不同组织器官的表达水平；图5B为本发明实施例6的大豆光受体基因GmZTL2在大豆中不同发育时期的表达水平；图6为本发明实施例I的大豆光受体基因GmZTL2在转基因植物细胞质及细胞核中的定位；图7为本发明实施例8的大豆光受体GmZTL2蛋白的光吸收活性测定结果，其中图7A为酵母中表达出并经镍柱纯化后的GmZTL2-His重组蛋白的Western检测结果；图7B显示大豆光受体基因GmZTL2编码的蛋白具有蓝光吸收活性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I大豆光受体基因GmZTL2的克隆分别利用正向引物5 ' -ATGGAGTGGGACAGCAATTCCGATC-3 '和反向引物5' -GCAATGCTTAGCATCCATTCCCG-3'从大豆垦农18 (购自黑龙江八一农垦大学)(Glycinemax L Kennong 18)的cDNA中克隆并测序获得GmZTL2基因，其基因序列如SEQ ID NO. 2所示；由其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。用于扩增目的基因GmZTL2的PCR反应程序为95 V 5min预变性；95 V 30s，50°C 35s，72。。2min，25 个循环，72°C IOmin 延伸。实施例2大豆光受体基因GmZTL2编码蛋白的氨基酸序列分析大豆光受体基因的GmZTL2蛋白序列与拟南芥ZTL蛋白的氨基酸序列之间的同源性为86. 8%,在保守功能域(LOV、F-box及Kelch repeats domain)更是高度同源。因此推测与拟南芥ZTL基因的功能类似，GmZTL2也具有抑制开花的功能。实施例3大豆光受体基因GmZTL2的克隆载体从实施例I中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图3所示的pGWCm载体上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16°C进行连接12小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。实施例4大豆光受体基因GmZTL2的植物表达载体将从实施例3中得到的大豆光受体基因GmZTL2的克隆载体与如图2所示的植物表达载体P35S-GW (购自Invitrogen)等比例混合后通过LR反应(两种质粒各50ng, LR酶I Ul，补H2O至终体积5 u 1，混匀后25°C反应6小时以上)，将GmZTL2构建在p35S_GW上，用于在植物中过表达大豆光受体基因GmZTL2，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行(拟南芥实验手册，2004)。植物中的筛选标记为Bar。实施例5大豆光受体基因GmZTL2抑制拟南芥开花从实施例4获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C24对照)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期,光强80 ii mol m 2 s 0下同时培育。对12株GmZTL2的Tl代过表达转基因植株进行花期观测。大豆生物钟基因GmZTL2转化拟南芥的转化株系从播种到开花为95 107天，平均为101天，而其对照的开花时间为40 46天左右，平均为43天。图4显示大豆光受体基因GmZTL2转化拟南芥，抑制拟南芥开花，对光周期不敏感。如图4所示，其中左侧代表对照野生型C24，右侧代表转基因植株。说明大豆GmZTL2基因具有抑制植物开花的活性。实施例6大豆光受体基因GmZTL2在大豆中不同组织器官及不同发育时期的表达水平利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆光受体基因GmZTL2在大豆中的表达。实时荧光定量PCR采用ABISt印One进行，用SYBR Green I检测荧光信号。上游引物5’ -ACACGGCTCTGCTTGATG-3，，下游引物5’ -CAACTTGATATACACATTCTGACC-3’。反应体系为SYBR Primix Ex Taq ( 2x ) ( TaKaRa ) 7.5 pi
上游引物(IOpM)0.3 nl下游引物(10_00.3 |il
ROX Reference Dye ( 5Ox )0.3
cDNA1.0 Ltl
AdR2O (灭菌双蒸水)5.6 ill反应参数为两步法95°C 10s，热启动；95°C 5s，60°C lmin，40个循环。用基因芯片数据分析软件Genesis对基因的表达进行标准化并作图。大豆光受体基因GmZTL2主要在大豆子叶、茎、叶、花、荚中均有表达，其中在开花期的叶柄中表达量最高，如图5所示。实施例7大豆光受体基因GmZTL2编码蛋白在转基因植物中的定位将大豆光受体基因GmZTL2与YFP的融合基因，转化至拟南芥原生质体中。具体方法如下I)取4周左右的拟南芥叶片切成细条，放入IOml新鲜的酶解液中，避光，23°C酶解4h0以下步骤冰上操作2)将酶解好的细胞液经金属筛(200目)平均过滤至两个IOml离心管中，4°C，IOOg 离心 2min。3)弃上清，沿管壁缓慢加入2ml预冷的W5溶液，轻柔混匀，4°C，IOOg离心2min。
重复一次。4)弃上清，加入2ml预冷的W5溶液，轻微震荡重悬，冰上放置30min。5) 4°C, IOOg离心2min,弃上清,加入2ml预冷的溶液,轻柔重悬。6) 40C, IOOg离心2min,弃上清,每管加入约Iml预冷的MMg溶液，充分悬浮原生质
体。 原生质体转化以下步骤在23°C常温操作
I)取10 ill融合表达的重组质粒加入2ml离心管中，用剪掉头的枪头取100 ill原生质体，轻柔混匀，再加入110 ill PEG/Ca2+溶液，混匀后23°C避光放置lh。2)向离心管中加入500 ill W5溶液，23°C,100g离心2min。3)弃上清，加500iil W5溶液，轻柔混匀，23°C，100g离心2min。重复一次。4)弃上清，加Iml W5溶液重悬沉淀，将悬浮液倒入六孔板，23°C避光培养12_16h。5)将原生质体转入2ml离心管，静置沉淀20_30min，小心吸弃上清，取适量原生质体于载玻片上，置于Confocal显微镜下观察。转化细胞中的YFP荧光信号表示大豆开花基因GmZTL2编码蛋白的定位，如图6所不。图6显不大光受:体基因GmZTL2编码的蛋白在拟南芥原生质体中定位于细胞质和细 胞核。实施例8大豆光受体基因GmZTL2编码蛋白光吸收活性的测定参照实施例4中的方法将GmZTL2构建在表达载体pYES_DEST52上，并转化至酵母菌株INVScl中，诱导表达出C端融合His标签的重组蛋白(Invitrogene instructionmanual, 2002),镇柱纯化后(Qiagen Ni-NTA Spin Kit Handbook, 2008)用 His 抗体经Western杂交检测确定纯化蛋白的特异性后，测定其光吸收活性，如图7所示。图7A为酵母中表达出并经镍柱纯化后的GmZTL2-His重组蛋白的Western检测结果；图7B显示大豆光受体基因GmZTL2编码的蛋白具有蓝光吸收活性。该结果表明GmZTL2作为蓝光受体有可能参与调控大豆中与光相关的生理过程，如光合作用、光形态建成等。光受体蛋白广泛参与植物生长发育过程，通过对其功能进行深入研究，极有可能使其成为育种改良的有力工具。纯化蛋白吸收光谱测定I)取约100 U g纯化蛋白用于吸收光谱的测量。2) BeckMan 分光光度计设置，分析选项Absorption Spectrum Analysis,扫描速度设1200nm/min,扫描间隔设lnm。3)用Elution buffer (不含咪唑)作为空白对照,测量纯化蛋白的吸收光谱,测量之前注意保持纯化蛋白的避光状态。4)将测量的数据结果输出后，通过origin 7.0软件作图。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.大豆光受体蛋白GmZTL2，其特征在于，其具有 1)如SEQID No. I所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID No. I所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有 1)SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；或 2)SEQ ID No. 2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或 3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3任一项所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3任一项所述基因或其特异片段的转化植物细胞。
7.大豆光受体蛋白GmZTL2或其编码基因制备转基因植物中的应用。
8.大豆光受体蛋白GmZTL2或其编码基因在大豆育种中的应用。
9.大豆光受体蛋白GmZTL2或其编码基因在调节植物光周期和开花时间中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，提供了一种大豆光受体蛋白GmZTL2及其应用，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，本发明还提供了编码该蛋白的基因，其具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明通过过表达大豆光受体基因GmZTL2可明显抑制植物(拟南芥)开花，使开花时间延迟，生育期延长，本发明的大豆光受体蛋白GmZTL2可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性和引种问题。
文档编号C12N1/21GK102718852SQ20121017537
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者傅永福, 张晓玫 申请人:中国农业科学院作物科学研究所