专利名称：高效表达β-1,4-葡聚糖酶编码基因的木霉工程菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域。具体涉及一种高效表达巨大芽孢杆菌Αρ25的葡聚糖酶编码基因的木霉生防重组工程菌株及其应用。
背景技术：
木霉(Jrichoderma)属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、粘孢菌类,菌丝有隔，能产生分生孢子，细胞为单核结构，有性态为肉座菌(Jfyporcrea)。木霉是自然界广泛分布的生防真菌，至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用，目前国际上五大洲60多个国家使用100多种含有木霉菌成分的生物制剂产品。木霉能够产生多种细胞壁降解酶，其中的葡聚糖酶成为目前研究的热点，被公认为是影响生防真菌重寄生能力的重要因子之一。而植物病原真菌细胞壁的主要组成成分是葡聚糖和几丁质，葡聚糖酶能够水解植物病原真菌细胞壁最外层覆盖的葡聚糖层，导致细胞壁骨架受损，细胞因此而受到杀伤，体外抑菌实验表明，葡聚糖酶对许多真菌菌丝生长有抑制作用，葡聚糖酶广泛存在于动植物、藻类、细菌和真菌体内，在植物病害生物防治领域具有良好的应用前景，但自然来源的木霉菌株产生的葡聚糖酶活性偏低。对生防菌的遗传改良是获得优良菌株的有效途径，尤其可以有目的地对菌株进行改造，使生防菌获得兼治多种病害的功能。近年来，已成功将20余种来自木霉菌本身和外源生物活性分子的编码基因转入木霉菌中，明显提高了木霉菌的拮抗能力，但利用葡聚糖酶基因转化木霉获得高效工程菌株的报道较少。
发明内容
为了提高木霉的 生防效果，本发明人利用β-1，4_葡聚糖酶基因构建真菌表达载体，并利用限制性内切酶介导法(REMI)转化绿色木霉{Τ. w>iife)LTR-2，获得具有外源功能基因的木霉生防重组工程菌株。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，名称为绿色木霉(斤icAoiferffla-ririife) L-10，保藏号为CGMCCNO. 5938，保藏日期为2012年3月27日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号3号院，中国科学院微生物研究所。本发明利用葡聚糖酶编码基因转化绿色木霉LTR-2，得到具有外源功能基因的木霉工程菌株，其中工程菌株绿色木霉L-1O的生长速率比原始菌株LTR-2明显提高，产生分生孢子能力也明显增强，其高效、稳定的表达葡聚糖酶活性，对蔬菜灰霉病和小麦纹枯病等植物真菌病害的防治效果均较原始菌株LTR-2有显著提高，为更好地防治植物真菌病害奠定基础。本发明还提供了一种工程菌株的工业化生产方法，该流程通过液体发酵，诱导剂处理生产得到厚垣孢子。另外，还提供了工程菌株L-1O以厚垣孢子为有效活菌成分的可湿性粉剂的制备方法。
本发明用到的菌株与质粒主要有
巨大芽孢杆菌Ap25 :本申请人保存，于1999年分离自澳大利亚的小麦根际土中，对多种植物真菌病害具有防治效果，在羧甲基纤维素钠(CMC)平板上产生明显的水解圈。葡聚糖酶编码基因islul4):片段大小约1. 5kb，由PCR扩增自巨大芽孢杆菌Ap25的基因组DNA中，该基因已登录Genbank，序列号为HM130670。绿色木霉LTR-2 :本申请人保存，分离自山东省济南市的蔬菜田土壤中，对多种植物真菌病害具有防治效果，保藏号为CGMCC NO. 1498。本发明提供了用于转化的木霉菌是绿色木霉LTR-2。本发明提供了用于REMI转化的真菌表达载体pSilent/§7w7￥。本发明提供了可组成型、稳定表达葡聚糖酶编码基因工程菌株L-10，是由pSilent/^7w7^载体通过REMI转化法获得的对小麦纹枯病菌(Miizoctonia cereal is)的平板抑制率最高的菌株。本发明提供了一种工程菌株的工业化生产流程。本发明还提供了以厚垣孢子为有效活菌成分的可湿性粉剂的配制。本发明的工程菌株L- 1O主要用于蔬菜灰霉病、小麦纹枯病等植物真菌病害的防治。
图1表达载体pSilent/§7w7￥的《7"7￥/ 0 扩增结果 I阴性对照的邑1测徽扩增结果
2阳性对照的glul4丨徽扩增结果
3载体pSilent-Ι的貧7"7￥/ 0 扩增结果
4转化子1#的WWPCR扩增结果
5转化子2#的glul4/微扩增结果
6转化子3#的glul4/微扩增结果
7转化子4#的glul4/微扩增结果
8转化子5#的glul4/微扩增结果
9转化子6#的glul4/微扩增结果
M D2000 marker (2000，1000，750，500，200，100) bp
图2表达载体pSilent/§7w7￥的//ifld IIIII酶切检测结果
I质粒pSiIent-1的//ifld III/奴7 II酶切结果
2转化子1#提取质粒pSilent/§7w7￥的III /Bgl II酶切结果
3转化子3#提取质粒pSilent/§7 w7￥的Η η III /Bgl II酶切结果
4转化子4#提取质粒pSilent/§7w7￥的Η η III /Bgl II酶切结果
5转化子5#提取质粒pSilent/§7w7￥的Η η III /Bgl II酶切结果
M IkbDNA marker(10000, 8000，7000，6000，5000，4000，3000，2000，1000)bp
图3表达载体pSilent/§7w7￥的结构图谱
图4绿色木霉LTR-2产生的原生质体
图5木霉工程菌株的Southern bloting分析结果1-7分别是以^/ 24基因为探针对野生型菌株LTR-2基因组DNA、阳性对照质粒pSilent/WW^重组工程菌株L-l、L_4、L_8、L-10、L-20基因组DNA经历/ d III酶切的Southern bloting 结果
图6木霉工程菌株在PDA(Hyg200l·! g/mL)平板上的菌落形态
LTR-2 (PDA)为原始菌株LTR-2在PDA平板上的菌落形态
LTR-2为原始菌株LTR-2在Hyg200 μ g/mL平板上的菌落形态
L-l、L-4、L-8、L-10、L-20、L-56为工程菌株在Hyg200 μ g/mL平板上的菌落形态
图7木霉工程菌株的葡聚糖酶水解活性检测结果。
具体实施例方式下面用实施例对本发明进行详细说明，实施例不对本发明构成任何限制。实施例1 :木霉表达载体pSilent/§7w7￥的构建
本实施例中得到的表达载体pSilent/§7w7￥,不仅可用于木霉属真菌的转化，还可用于其它丝状真菌的转化。
β-1，4_葡聚糖酶基因大小约1. 5kb,已登录Genbank,序列号为ΗΜ130670。利用CTAB/NaCl法提取得到巨大芽孢杆菌Ap25的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，根据Genbank上公布的β -1, 4-葡聚糖酶基因设计引物并进行PCR扩增，经过反复实验，最后确定了适合 Αρ25 基因组 DNA 扩增的引物序列为 ^A/7￥/F 5，-GCGCAAGCTTATGAAACGGTCAATCTCTAT-3’ 和^/WR:5’ -GCGCAGATCTCTA
ATTTGGTTCTGTTCC-3’进行PCR扩增(下划线分别代表添加的HinA III和Bgl II酶切位点)，PCR产物经纯化后，用历^dIII/汝7 II双酶切，过胶纯化。载体pSilent-Ι同样用Hind III /Bgl II双酶切，过胶纯化。两种酶切产物用快速连接液Solution I于16°C连接2h，采用热激法转化ToplO感受态细胞，涂布Amp平板，37 °C过夜培养。 挑取部分转化子进行W WPCR检测，见图1，并使用"i/ d III /Bgl II酶切验证，见图2，转化子1#、3#、4#的PCR和酶切结果均正确，表明这3个转化子为阳性转化子。表达载体pSilent/V7W￥图谱见图3，基因表达框以PtrpC为启动子，TtrpC为终止子。实施例2 :原生质体制备与再生
本实施例利用木霉的幼嫩气生菌丝为接种物，可以排除接种分生孢子后，在培养过程中，将未萌发的孢子当作原生质体，而造成对后续实验的干扰。同时在再生培养基中添加促再生试剂JC (0.3 mol/L肌醇、5g/L几丁质粉)，有利于原生质体产生细胞壁，提高再生率。从平板上挑取绿色木霉LTR-2的幼嫩气生菌丝接种PDA液体培养基，28°C振荡培养13h，用3层无菌擦镜纸过滤，无菌水冲洗2次，渗透压稳定剂冲洗2次。取适量菌丝悬浮于裂解液(Lysing Enzymes/蜗牛酶/纤维素酶各5mg/mL,溶入渗透压稳定剂中，0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌)中，30°C，50r/min振荡，定期镜检，发现有大量原生质体形成后，用3层擦镜纸过滤菌丝，渗透压稳定剂冲洗2次，4°C，7000r/min,离心lOmin。沉淀用STC洗涤，4°C，7000r/min，离心lOmin。沉淀用少量STC悬浮，调整原生质体量IO7个/mL。分别用STC和无菌水稀释原生质体，不同梯度各取lmL，混入45°C的再生培养基或PDA中，28°C培养3d，计数菌落个数，计算再生率。再生率(%)=100X (高渗稀释液长出的菌落数-无菌水稀释长出的菌落数)/原生质体数
渗透压稳定剂0. 6mol/L NaCl,O. 2mol/L PBS, ρΗ5· 8。STC 0. 6mol/L 山梨醇，IOmmoI/L Tris, IOmmoI/L CaCl2, ρΗ7· 5。再生培养基PDA+0.3 mol/L KC1+0. 3 mol/L JC。绿色木霉LTR-2的幼嫩菌丝经裂解酶处理后，酶解初期，顶端细胞壁裂解释放出原生质体(图4左);酶解后期，菌丝裂解成菌丝段，在菌丝段的一端或两端释放出原生质体，最后释放出大量原生质体，产量大约为IO8个/mL (图4右)。原生质体大多为圆形，大小不一，这与菌丝体间隔大小不同有关。裂解时间以2h为佳。原生质体在再生培养基上培养3d，再生率为29%。实施例3 =REMI法转化绿色木霉LTR-2
利用REMI法进行丝状真菌的转化，相比于其它转化方法，具有转化效率高，单拷贝插入几率增加，能够通过质粒拯救与PCR等技术快速分离被标签的目的基因。根据重组表达载体pSilent/§7w7￥上的酶切位点，选用fee I进行酶切，酶切产物过胶纯化备用。取线性质粒30 μ g、限制性内切酶I 4 μ L、STC 150 μ L，混匀，冰浴；加原生质体(IO7个/mL) 150 μ L，混匀，冰浴20min ;缓慢滴加PTC (预冷)1. 5mL,混匀，冰浴5min,室温 20min ;加 STC (预冷)5mL,混勻,4°C, 7000r/min,离心 IOmin ;沉淀加入 2mL 液体再生培养基，28°C，50r/min，培养12h ;平板中预加入一薄层再生培养基，转化液适量与45°C左右的固体再生培养基混匀，倒平板，280C，培养24h ;覆盖PDA (潮霉素Hyg 200 μ g/mL), 28°C，培养3d。结果上层平板长出抗潮霉素的木霉小菌落，将这些木霉单菌落转接PDA(Hyg200 μ g/mL)继续培 养4飞山并进行单孢分离，获得纯化的木霉重组工程菌株，转化率为240 个 / μ g DNA。PTC 60% PEG4000,1OmmoI/L Tris,IOmmoI/L CaCl2, ρΗ7· 5。利用CTAB/NaCl法提取得到木霉工程菌株的基因组DNA，以该DNA为模板，用glul4引物进行PCR扩增，结果表明阳性质粒对照和木霉工程菌株中均得到大小1. 5kb的目的片段，而阴性ddH20和LTR-2中无扩增条带，与预期结果一致，表明glul4基因已转入木霉工程菌株基因组DNA上。利用限制性内切酶"i/ d III酶切木霉工程菌株的基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，以β-1,4-葡聚糖酶基因的RCR产物为探针进行Southern blotting，检测T-DNA的插入拷贝数，实验步骤按 Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit 及 Biotin ChromogenicDetection Kit (Fermentas公司)说明书进行。结果野生型LTR-2无杂交带,而阳性质粒pSilent/^7w7^出现一条杂交带，木霉工程菌株均出现一条杂交带，说明pSilent/§7w7￥已插入木霉工程菌株的基因组DNA中，且为单拷贝插入(图5)。实施例4 :木霉工程菌株的遗传稳定性及菌落形态的观察
单孢分离得到的木霉转化子在PDA平板上连续传代6次后,重新接种Hyg200 μ g/mL平板，28°C培养3 d，结果见图6。所有转化子仍可继续生长(L-l、L-4、L-8、L-10、L-20、L-56)，而原始菌株LTR-2在PDA平板上可以生长，但在Hyg200 μ g/mL平板上不生长。表明木霉转化子对Hyg具有遗传稳定性。相比于原始菌株LTR-2，大多数转化子的菌落形态发生了明显变化，这些变化包括菌丝生长速度大小、菌丝层疏密程度、菌落颜色、分生孢子数量等，其中以分生孢子产生数目和菌落颜色发生变异的较多。转化子L-l、L-10、L-20生长速度较原始菌株LTR-2明显提高，而转化子L-1O的产孢能力也明显增强(图6)。实施例5 :木霉工程菌株的葡聚糖酶活性测定
在羧甲基纤维素钠(CMC)平板上28°C培养4d，绿色木霉LTR-2可以生长，但没有明显的水解圈，各工程菌株具有明显的水解活性，经刚果红染色后产生黄色水解圈，不同工程菌株的水解圈大小不同(图7)。实施例6 :木霉工程菌株的抑菌活性检测
利用平板对峙培养实验检测木霉工程菌株对R· cereal is的抑制作用，用直径为5mm的打孔器打取木霉工程菌株与小R. cerealis菌落边缘的菌丝块，然后对接在PDA平板两端，两个菌块相距60mm，对照用无菌琼脂块代替。28°C培养，定期观察二者之间的拮抗情况，计算抑制率(％)。
权利要求
1.一种高效表达β-1，4-葡聚糖酶编码基因的木霉工程菌株绿色木霉(Trichodermaviride) L-10,其特征在于该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 5938，保藏时间2012年03月27日。
2. 如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉(K ririofe) L-10,其特征为利用β_1，4-葡聚糖酶编码基因通过REMI法转化绿色木霉LTR-2，获得了具有外源功能基因的工程菌株绿色木霉(Τ. viride ) L-10。
3. 如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉(K viride) L-10,其特征在于重组木霉工程菌株L-1O染色体中含有所述β_1，4-葡聚糖酶编码基因；该β_1，4-葡聚糖酶编码基因在Genbank登录序列号为ΗΜ130670。
4.如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉(T1.ririofe) L-10,其特征在于选用了含来自构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的PtrpC为启动子，TtrpC为终止子构成的真菌表达载体pSilent/^/WA通过REMI法转化实现β_1，4-葡聚糖酶在宿主菌的高效表达。
5.如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉(T1.viride、L-1O的厚垣孢子发酵液的工业生产方法，其特征在于具体步骤和工艺条件如下 (1)斜面菌种采用固体PDA培养基，将工程菌株L-1O接种在试管内，28°C培养3 4d ； (2)茄瓶菌种采用液体PDA培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28°C振荡培养I 2d ; (3)液体培养采用发酵培养基(羧甲基纤维素钠1%，玉米粉1%，葡萄糖O.5%，豆饼粉2%，磷酸氢二钾O. 2%，磷酸二氢钾O. 2%，碳酸钙O. 5%，pH6. O), 121°C灭菌20min，将三角瓶种接种发酵罐，接种量O. 2%，28°C培养，溶氧量40 50%，通气量1:0. 6 O. 8，搅拌速度为160r/min，培养30hr后，调整发酵参数25°C培养，溶氧量20 30%，通气量1:0. 4 O.6，搅拌速度为120r/min，添加O. 1%的诱导剂甲醛，避光培养6 8hr，至厚垣孢子量达到2X109个/mL以上时，结束发酵；即获得所述绿色木霉(7 viride) L-1O的厚垣孢子发酵液。
6.如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉(71.viride、L-1O的可湿性粉剂制备方法，其特征在于原料配方如下 L-1O发酵液IOmL 麦饭石(300目)89g 羧甲基纤维素钠0.5g 几丁质粉O. 2g 黄原胶0.3g 。
7.如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉(7ririofe)L-1O的应用，其特征在于用于制备防治蔬菜灰霉病、小麦纹枯病以及其他植物真菌病害的生防制剂。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达巨大芽孢杆菌Ap25来源的 -1,4-葡聚糖酶编码基因glu14的木霉工程菌株及其应用。本发明的工程菌株L-10是通过REMI转化方法将含 -1,4-葡聚糖酶编码基因glu14的真菌表达载体pSilent/glu14整合到具有植物病害生物防治功能的绿色木霉LTR-2染色体中获得的。工程菌株L-10可以组成型、高效表达 -1,4-葡聚糖酶编码基因glu14，其生长速率及产生分生孢子的能力较原始菌株LTR-2明显提高。工程菌株L-10的工业化生产采用液体发酵，诱导剂诱导产生厚垣孢子的新型工艺，并采用麦饭石等载体制备成可湿性粉剂，保存期达2年。温室试验表明工程菌株L-10对小麦纹枯病和黄瓜灰霉病的防治效果比原始菌株LTR-2有显著提高。
文档编号C12N15/80GK103060208SQ201210175568
公开日2013年4月24日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者李纪顺, 陈凯, 杨合同, 扈进冬, 李红梅, 魏艳丽, 张广志, 周红姿, 赵晓燕, 王贻莲, 郭凯 申请人:山东省科学院中日友好生物技术研究中心