专利名称：一种水葫芦生防真菌拟盘多毛孢的制作方法
技术领域：
本发明属于杂草生物防治技术 领域，特别是涉及一种水葫芦生防真菌拟盘多毛孢iPestalotiopsis crassipes)菌株。
背景技术：
水葫芦又称凤眼莲,是世界十大害草之一，也是我国重要的外来入侵植物之一。广泛分布于亚洲、北美、大洋州和非洲的很多国家和地区。水葫芦于20世纪30年代传入我国，目前广泛分布在华南、华中和华东等地区，尤其以云南、四川、湖南、湖北、江西、江苏、浙江、福建和台湾等省市。该草适应性极强、生长速度很快、蔓延速度惊人，过度繁殖后难以有效控制，带来严重的水环境生态破坏和生物污染。目前水葫芦主要通过人工机械打捞、化学除草和生物防除控制。但人工打捞只能在短时间、小范围内起作用，而且费时费力。机械搅灭，受地域限制，成本高，不适合推广，而且打捞的水葫芦若不及时处理，蚊虫滋生，也会严重影响环境和人畜健康。化学除草剂不仅费用高，而且可能直接造成环境污染。因此近年来“应用植物病菌控制水葫芦”的生物防治研究受到人们的高度关注，国外已经报道了 70多种水葫芦致病真菌，其中有7种强致病菌株具有开发成水葫芦真菌除草剂的生防应用潜力。罗得曼尼尾孢{Cercosporarodmanii)防除水葫芦在国外已获专利保护。在我国已报道十余种水葫芦致病真菌，其中水葫芦一种假链格孢{Nimbya alternantherae SF193菌株)已获我国专利保护(专利号200710019832)，迄今还没有关于其它几种病菌的进一步研究和应用的详细报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种对水葫芦有很强致病作用和控制效果的杀草真菌。根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为拟盘多毛孢菌{Pestalotiopsis photiniae)，'鱼过试验测定确定了它生长、产孢和侵染致病的最适条件，研究发现其通过产生毒素使杂草植株发病死亡的致病机理，分析了病菌及其毒素的寄主专化性。水葫芦强致病菌株分离纯化在重庆地区不同季节多次采集水葫芦自然发病植株，采用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，经室内组织培养和纯化得到多种真菌，用柯赫氏证病方法确定其中的致病菌，最后经过致病性试验比较筛选，获得了这种对水葫芦有很强致病作用的杀草病原真菌(WH010)。本发明的水葫芦拟盘多毛孢菌株(WH010)已于2010年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC NO. 4418。菌株的形态特征(图I)鉴定在PDA培养基上25 °C培养5 d菌落(图1A)直径可达64 mm以上，光照与黑暗对病菌生长产孢没有明显的影响。病菌菌落圆形，表面气生菌丝较发达，白色，短絮状，呈辐射状扩展；菌丝(图1C)无色，分隔，直径约I. 3-2. 7 μπι。14-15 d后菌落表面长出黑色油圆球状或不规则状、具光泽而湿润的分生孢子堆，呈放射状分布；随培养时间延长，分子孢子堆大量产生，有的在菌落表面联合成片。
分生孢子(图1D)纺锤形或倒棍棒状，大小为14. 2-28. 5X4. 1-7. 8 μ m,直或稍微弯曲，5个细胞，各细胞之间分隔均为真隔膜，两端细胞壁薄，无色，中间3个细胞呈橄榄褐色，色泽一致；顶部细胞无色，圆锥形，比次顶部细胞直径明显变小，顶端附属丝2-3条，基部细胞无色倒圆锥形，中生式尾毛I根，约为附属丝长度的1/4。分生孢子梗较短，着生于分生孢子盘基部，无色或浅褐色，分隔，不规则分枝。对病组织进行切片可见分生孢子盘杯状，散生或集生，初埋生后外露，黑色或暗褐色底层由厚壁、角状 、暗褐色细胞构成，盘表面产孢区细胞壁薄，色淡。根据病菌的这些形态学特征鉴定，其无性阶段属于拟盘多毛孢属真菌iPestalotiopsis sp.),实验中未发现其有性阶段。菌株分子技术鉴定提取菌株的基因组DNA，采用rDNA ITS通用引物和 β-tubulin 引物ITS5 (5 ' -GGAAGTAAA AGT CGTAACAAGG-3 ')、ITS4(5 ' -TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3 ' )、Bt2a(5 ' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ')、Bt2b(5/ -ACCCTCAGTGTAGTGACC CTTGGC -3/ )进行 rDNA ITS 和 β-tubulin 序列的 PCR扩增，获得长度为550bp( rDNA ITS)和453 bp ( β-tubulin)基因片段(详见序列表)，在Genbank的登录号分别为JF502635和JQ694097。将所得序列登陆到www. ncbi. nlm. nih.gov网站，进行BLAST比对，由比对结果可知，WH010的rDNA ITS、β -tubulin区段的序列与Pestalotiopsis photiniae的序列具有99%的相似性,从而确定WH010与石楠拟盘多毛抱{Pestalotiopsis photiniae)是同一个种。菌株的最佳培养和接种侵染条件该真菌菌落生长和产生分生孢子的最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，最适温度28 °C，最适酸碱度为pH6. 5，在这些条件下，菌落生长快，大量产生大分生孢子；光照对真菌生长产孢无明显影响。病菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在IO5个/mL数量级或更高，接种后保湿和暗光24小时，并在整个侵染期保持温度 25-28 0C0菌株的致病性和专化性水葫芦拟盘多毛孢对水葫芦良好的致病作用和生长抑制效果。主要侵染植株叶片。在室内用病菌的分生孢子悬浮液直接喷雾接种后，4 d即可发病，植株叶片出现典型发病病斑；12 d病植株率达100%,植株叶片开始失水黄化；18 d以后整个植株萎蔫死亡，其对水葫芦的控制效果与敌克踪、草甘膦相当。在田间接种后效果显现稍延迟，第8 d植株顶部全部黄化，18 d后萎蔫死亡。在适宜条件下用高浓度分生孢子悬浮液(IO5个/mL)接种试验结果表明，该真菌对水稻、小麦、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在内的7科21种水、旱作物都不致病，也不影响它们的种子萌发和植株生长，这说明水葫芦拟盘多毛孢是水葫芦的专性致病菌，若用于研制水葫芦除草剂，可以保证生境中其它植物的安全。菌株的粗毒素用马铃薯葡萄糖(以下简称PD)培养液培养7 d后，四层纱布过滤I次，所得滤液再用双层层析滤纸过滤，然后滤液离心20 min，转速为4000 r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素。用该毒素的水液分别浸溃水葫芦叶片后2 d内即表现毒性症状，5 d内叶片黄化。用此粗毒素溶液处理前述20种植物的种子和植株后未观察到毒性症状，说明这种毒素也是高度专化的。7. WH010菌株生防制剂的制备和应用将保藏菌种移殖于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的拟盘多毛孢WH010移入PDA平板培养基上培养5 d后，取菌饼接种到PD液体培养基中，振荡培养后过滤获得孢子和培养滤液的混合液体,可将所得滤液直接加工成悬浮剂，或将菌种接种在灭菌麦麸上，固体发酵后收取孢子加工成粉剂。将所得的生防制剂稀释后均匀地喷雾在水葫芦叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液50 mL。喷雾处理3 d后水葫芦开始发病，15 d后部分植株枯萎死亡(图5) ;1个月后测定，水葫芦的生长抑制率可达到76. 3%。其优点是拟盘多毛孢WH010菌株·制备的生防制剂对水葫芦均有良好的防除效果；对人、畜安全，对环境没有污染。本发明的优点是从自然环境中分离获得的水葫芦拟盘多毛孢WH010菌iPestalotiopsis crassipes)，其接种体对世界十大恶性杂草之一的水葫芦{Eichhorniacrassipes)具有很强的致病控制作用，它的代谢产物(毒素)对这种杂草也具有很强的毒性致死作用；通过菌株液体发酵和固体发酵制备的生防制剂对水葫芦有良好的防除效果；病菌的菌剂和毒素对重要作物及环境中其它植物都没有不良影响，表现出针对水葫芦的高度专化杀草活性，具有潜在的商业开发和应用价值，在水葫芦的生物防治实践中具有重要的应用前景。
图I为水葫芦拟盘多毛孢WH010的形态特征A. PDA上第5d菌落；B. PDA上第5d菌落背面；C.菌丝；D.分生孢子
图2为水葫芦拟盘多毛孢WH010粗毒素室内生物测定结果(5 d) A.拟盘多毛孢WH010毒素处理；B.清水对照
图3为水葫芦拟盘多毛孢WH010菌块接种后5 d的症状(病斑)特征图4为WH010孢子悬浮液活体室内接种后12 d植株发病情况A.清水对照B.拟盘多毛孢WH010处理
图5为WH010制剂对水葫芦的田间发病和控制作用。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述 实施例I:杀草真菌的分离纯化与筛选
I.水葫芦病原菌分离、纯化
1.1.菌株的分离分别选取带有典型病斑的叶片或茎杆，用清水冲洗干净，在病健交界处剪取2 mmX2 mm大小的组织块，在超净工作台依次在70%的酒精，O. 1%的升汞中消毒，然后在灭菌水中连续漂洗3次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分之后放在PDA平板中，于25 V恒温培养箱中培养。待PDA平板培养基上的菌落长到一定大小时，进行分离纯化并经致病性测定后移入PDA试管斜面后于冰箱4 °C下保存备用。I. 2.寄主植物来源及培植采集不明显病害症状的相对健康植株，去除衰老叶片后移栽到温室内的水槽内备用。在接种试验前2天选取长势良好且大小适中的健康水葫芦植株，分别植入塑料钵中，塑料钵底部加施少量营养土并灌满自来水。将盆钵植株放在温室自然温度下生长。1.3.水葫芦病害诊断和回接将分离纯化所得的病原菌菌种取约1X1 cm菌丝块，接种于马铃薯蔗糖(PS)液体培养基中，在25 °C恒温培养箱中培养7 d。抽滤后称量菌丝湿重。用研钵将菌丝研成菌丝片断，按菌丝湿重与无菌水1:100的比例配制成菌丝悬浮液。采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于水葫芦叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止，用无菌水涂抹的水葫芦作对照。每个叶片一个处理，共处理5株水葫芦，每株5-6个叶片。接种后用塑料袋套在水葫芦上以保持高湿度。48 h后揭去塑料袋，接种期间温度为25-28 °C，接种后适时观察发病情况并记录病害症状。待接种植株的叶片出现症状后，用组织分离法对病原菌进行再分离，对前后分离病原菌的培养性状、分生孢子以及分生孢子梗等形态特征等进行比较。
水葫芦生防菌的筛选
在25 °C条件下，将分离所得的各个菌株分别按菌丝湿重与无菌水1:100的比例配制成菌丝悬浮液。接种前，用无菌水将水葫芦叶片冲洗干净。采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于水葫芦叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止。以无菌水涂抹的水葫芦作对照。每个叶片一个处理，共处理5株水葫芦，每株5-6个叶片。接种后，用塑料袋套在水葫芦上，保持高湿度。48 h后，除去塑料袋。14 d后，观察记录植株的感病率和病害严重度(Charudattan的分级标准)。水葫芦病原菌分类地位鉴定
3.1.病原菌的形态学鉴定马铃薯蔗糖平板培养基上培养病原菌，适时观察记录病原菌的各种形态特征菌落直接用数码相机拍摄，真菌的菌丝、分生孢子和分生孢子梗制片后在光学显微镜下观察，并用显微成像系统拍摄。病原菌的鉴定主要依据分生孢子的形状、颜色、大小、脐点和隔膜数以及分生孢子梗的颜色和形状等特征作出。3.2.病原菌的分子鉴定总DNA的提取采用氯仿/异戊醇提取法。采用rDNA ITS 通用引物和 β-tubulin 引物ITS5 (5' -GGAAGTAAA AGT CGTAACAAGG-3;)，ITS4(5/ -TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3' )，Bt2a(5/ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3;)，Bt2b(5/ -ACCCTCAGT GTAGTGACCCTTGGC -3/ )进行 rDNA ITS 和 β-tubulin 序列的 PCR扩增，再将得到的PCR产物进行测序,获得的菌株rDNA ITS序列和β -tubulin序列在www.ncbi. nlm. nlh. gov数据库中进行BLAST比对,进而确定病原菌的分类地位。
实施例2 :水葫芦拟盘多毛孢生物学特性
I.培养基对菌株菌落生长及产孢量的影响
25 1恒温培养5 d的菌落上，用打孔器沿菌落边缘打取直径为5.0 mm的菌饼接于PDA、PSA、CAA, WA、WLA、OSA, WS和WD培养基平板(9 cm)中央。25°C恒温培养，连续观察。第5 d后用垂直十字法逐日测量记载菌落直径；第18 d后测量产孢量，加入灭菌蒸馏水，用灭菌玻片轻轻刮菌落表面，然后洗脱、过滤，加入一定体积的O. 1%吐温-80配成悬浮液，用移液枪吸取孢子悬浮液滴于纽鲍尔(Neubauer)血球计数板上，10x20倍显微镜下计数，计算孢子浓度。比较不同培养基对菌落生长和产孢量的影响，每个处理重复3次。
温度对菌株菌落生长及产孢量的影响
25 1恒温培养5 d的菌落上，用打孔器沿菌落边缘打取直径为5.0 mm的菌饼，置于PDA 培养基平板(9 cm)中央，分别于 10 °C>19 °C>16 °C>22 °C>25 °C>28 °C>31 °〇和34±0.5 V 8个光照培养箱中，按上述方法测量菌落直径及产孢量，每个温度处理重复3次。酸碱度对菌株菌落生长及产孢量的影响
PDA培养基灭菌后，在无菌操作台里用1.0 mol/L的NaOH和HCl溶液将培养基的pH值分别调节到4. 0,5. 0,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,9. 0,10. 0、11· O 和 12. O (用电子 pH 计测定)，
倒入9 cm培养皿(约5 mL/皿)制成平板培养基。按上述方法接种病原菌，测量菌落直径及产孢量，25°C恒温培养，每处理重复3次。光照对菌株菌落生长及产孢量的影响
采用PDA培养基，设置每天光照0h、6h、12h、18h、24h 5种处理，按上述方法接种病原菌后25°C恒温培养，测量菌落生长量及产孢量，每处理重复3次。 碳源对菌株菌落生长及产孢量的影响
以查彼(Czapek)培养基为基础培养基。取等摩尔碳原子的葡萄糖、蔗糖、D-果糖、乳糖、麦芽糖、木糖、D-甘露醇、可溶性淀粉置换基础培养基中的蔗糖作为碳源，并设不加糖基础培养基作为对照(CK)。按上述方法接菌后置于25 1恒温培养、测量菌落生长量及产孢量,每处理重复3次。氮源对菌株菌落生长及产孢量的影响
以查彼(Czapek)培养基为基础培养基。取等摩尔氮原子的硝酸钠、牛肉膏、蛋白陈、硝酸钾、硝酸铵、蛋白胨、尿素、酵母浸膏为氮源，置换基础培养基中的硝酸钠作为氮源，并设不加氮源基础培养基作为对照(CK)。按上述方法接菌后置于25 1恒温培养、测量菌落生长量及产孢量，每处理重复3次。实施例3 :病原菌粗毒素提取 水葫芦拟盘多毛孢产毒培养
在超净工作台上，取出培养好的水葫芦拟盘多毛孢菌株平板，用直径为5 _的打孔器，打取菌饼，分别接入马铃薯蔗糖(PS)培养液中，每瓶4块菌饼。放入摇床振荡培养，设置温度为25 °C、转速110 r/min, 12 h黑暗交替，连续培养7 d。粗毒素的提取
将所得的发酵液，用四层纱布过滤I次，所得滤液用双层层析滤纸过滤，然后滤液离心20 min,转速为10000 r/min,所得上清液即为毒素的粗提液。萃取试验
选取三种萃取剂石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯分别对粗毒素进行萃取实验。在分液漏斗中先装入100 mL粗毒素，再装入等体积的萃取剂，充分震荡使得两种液体混匀，静置至分层后，从下缓慢移出有机相。再向水相中加入等体积的萃取剂，如此连续萃取三次，合并有机相，得到萃取有机相和萃取水相。对有机相进行旋转蒸发(压强为O. I MPa，温度30 °C),蒸发掉有机溶剂，萃取产物密封4 °C冰箱保存备用。毒素生物活性测定
离体叶片针刺法把灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入I mL灭菌蒸馏水。剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用70%酒精擦洗一遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放I片，保湿培养备用。在叶片近边缘约I cm处针刺造成微伤口，分别吸待测液40yL，滴于伤口处，再用保鲜膜密封保湿，重复3次，用H)培养液和灭菌水做对照，温箱25 °C保存5天。观察记录产生斑直径。浸溃法把灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入I mL灭菌蒸馏水。剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用70%酒精擦洗一遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，将叶片浸入到培养滤液中，2 min后取出，保湿培养。并用灭菌水、PD培养液作对照，5 d后观察记录发病情况及程度。实施例4 :病原菌及其毒素的安全(专化)性测定 WH010对作物茎叶的致病性测定
在培养皿内放入滤纸,加适量的灭菌水,将用温水浸泡12 h或24 h (依种子类型而定)的21种作物的健康种子放置在湿滤纸上，盖上皿盖，在25 °C恒温箱中催芽，待露出胚芽后播种到塑料盆(直径12 cm)中。盆内加入经过高温烘干的沙土，然后加入一定量的灭菌水和复合肥。播种后在室外自然条件下生长，待植株长到第5片叶子时进行接种处理。每种作物种3盆。 I).菌丝对作物的侵染测定用手动喷雾器将菌丝悬浮液喷洒在供试作物植株上(按菌丝湿重与无菌蒸馏水1:100的比例配制成菌丝悬浮液，喷雾量约为100 mL/m2)，再用透明塑料袋保湿24 h。用灭菌水喷雾作对照，接菌后在室外自然条件下继续生长，18 d后观察记录结果。2).孢子对作物的侵染测定用手持喷雾器将孢子悬浮液喷洒在供试作物植株上(喷雾量约为100 mL/m2)，再用透明塑料袋保湿24 h。用灭菌水喷雾作对照，接菌后在室外自然条件下继续生长，18 d后观察记录结果。3).粗毒素对作物茎叶生长的测定用手动喷雾器将孢子悬浮液喷洒在供试作物植株上(喷雾量约为100 mL/m2)，并用灭菌水和未接种的H)培养液作对照，在室内自然条件下生长，18 d后观察并记录结果。对作物种子萌发率的影响
1).菌丝悬浮液对作物种子的萌发测定将菌丝悬浮液加入铺有滤纸的培养皿中使滤纸饱和，选取已浸泡2 h的供试作物种子放在滤纸上，每个培养皿放50粒种子，每种作物放置3皿，并用灭菌蒸馏水做对照，在25 1条件下黑暗培养，观察并计算种子发芽率。发芽率(%)=正常发芽种子数/供试种子总数X 100
2).粗毒素对作物种子的萌发测定将粗毒素加入铺有滤纸的培养皿中使滤纸饱和，选取已浸泡2 h的供试作物种子放在滤纸上，每个培养皿放50粒种子，每种作物放置3皿，并用灭菌水和没接菌H)培养液做对照，在25 °C条件下黑暗培养，观察并计算种子发芽率。实施实例5 :拟盘多毛孢WH010菌株生防制剂的制备方法
I).水剂将保藏菌种移殖于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的拟盘多毛孢WH010移入PDA平板培养基上培养5 d，然后用直径为5 mm的打孔器打取菌饼，接入H)培养液中(2块/100 mL)。放入摇床振荡培养，设置温度25 °C、转速110 r/min, 12 h黑暗交替，连续培养14 d后无菌纱布过滤，获得孢子和培养滤液的混合滤液(孢子浓度>106个/mL，以上操作均在无菌环境下)。采用旋转蒸发仪将获得混合液进行蒸发，得到浓缩液(孢子浓度MOki个/mL)，即WH010的悬浮制剂。2).粉剂取麦麸加适量的水，120 1湿热灭菌，自然冷却。将保藏菌种移殖于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的拟盘多毛孢WHOlO移入PDA平板培养基上培养5d，然后用直径为5 mm的打孔器打取菌饼，菌丝面向下接种于灭菌麦麸中(2块/100 g)，塑料膜密封，置于25 °C恒温箱黑暗条件静止培养(以上操作均在无菌环境下)15 d，培养物在40 1下风干后用粉碎机打碎，最后过筛(200目)得到孢子粉，即为菌体的可湿性粉剂，其孢子含量约为I. 0262 X IO10个/g。实施实例6 =WHOlO生防制剂的应用及其优点
取WH010水剂或粉剂，用水稀释成浓度为IO5个/mL的药液，于晴天或阴天傍晚均匀地喷雾在水葫芦叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液100 mL。喷雾处理3d后水葫芦开始发病，15 d后部分植株枯萎死亡(图5) ;1个月后测定，水葫芦的生长抑制率可达到76.3%。 用WH010菌剂属于生物制剂，具有许多明显的优点。其可以通过发酵大量扩繁，菌剂生产工艺较简单，研制成的制剂对水葫芦均有良好的生防效果，但对人畜和水生动物安全，不会造成环境中的农药残留。序列表
水葫芦拟盘多毛孢WH010的rDNA ITS序列
I agaaggcttg ggtatctacc tgatcgaggt caccacaaaa aattgggggt ttagcggctg61 ggagttatag cacctaacaa aagcgagaaa aaaaattact acgctcagag gatactacaa121 atccgccgtt gtatttcagg aactacaact aataaaagaa gtagattccc aacactaagc181 taggcttaag ggttgaaatg acgctcgaac aggcatgccc actagaatac taatgggcgc241 aatgtgcgtt caaagattcg atgattcact gaattctgca attcacatta cttatcgcat301 ttcgctgcgt tcttcatcga tgccagaacc aagagatccg ttgttgaaag ttttgactta361 ttaaaataag acgctcagat tacataaaat aacaagagtt taatggtcca ccggcagcag421 ctataagaag acctataact tctgccgagg caacaaaagg taagttcaca tgggttggga481 gtttagaaaa ctctataatg atccctccgc tggttcacca acggagacct tgttacgatt541 tttacttcca
水葫芦拟盘多毛孢WH010的β-tubulin区段序列
I gtgataactg tctgctcgac acggccttaa tacgacgttt ttcgtgcctg cacgacggcc61 ccgaacagtg atataggtca agatagaggg aacatgatgc taataggtca ttgataggca121 aaccatctct ggcgagcacg gtctcgacag caatggagtg tatgtactat ttttaattcc181 tcctgcttcc tgttaagctt gtaggctgac tcgatggcca tttagctaca acggtacctc241 cgagctccag ctcgagcgta tgagcgtcta cttcaacgag gcttccggca acaagtacgt301 tcctcgtgcc gtcctcgtcg atctcgagcc cggtaccatg gatgccgtcc gcgccggtcc361 cttcggccag ctcttccgcc ctgacaactt cgtcttcggt cagtccggtg ctggcaacaa421 ctgggccaag ggtcactcac ctggagggta aaa
权利要求
1.一种水葫芦生防真菌拟盘多毛孢{Pestalotiopsis crass ipes),从水葫芦{Eichhornia crassipes)自然发病植株叶片上分离纯化而获得,其菌体、孢子和提取的毒素对水葫芦都有很强的致病或致毒作用和控制效果，其特征在干，菌株为WH010，该菌株的保藏号为 CGMCC NO. 4418。
全文摘要
一种水葫芦生防真菌拟盘多毛孢(Pestalotiopsiscrassipes)WH010菌株(菌株的保藏号为CGMCCNO.4418)，从水葫芦自然发病植株叶片中分离获得，该菌在常规培养条件很容易产孢，最适培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PDA)，最适温度28℃，最适pH6.5；病菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在>105个/mL，接种后保湿24h并保持温度25-28℃。其菌体制剂和毒素液对恶性杂草水葫芦具有很强致病杀草作用，经发酵菌体或毒素仿生合成技术可生产环保型真菌除草剂，具有潜在的商业开发应用价值。用真菌培养液经乙酸乙酯萃取和旋转蒸发器真空蒸发可得到致病粗毒素。该菌株的水剂和粉剂在田间自然条件对水葫芦的控制作用可达到76%以上。该菌菌体悬浮液及其毒素液对水稻等21种重要作物安全，无不良影响。
文档编号C12R1/645GK102660468SQ20121017572
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者胡丽, 谭万忠 申请人:西南大学