链格孢属Alternaria sp.真菌及其次生代谢物的制备和作为微生物源杀螨剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株从苜蓿种子中分离得到的链格孢属 Alternariasp. 内生真菌，其菌种保藏编号为CGMCCNo.9277。该真菌的次生代谢物在较低的浓度下，对农业害螨具有明显的触杀活性，而对农作物却没有任何影响，因此，作为安全无毒，绿色环保的微生物源杀螨剂，在制备杀螨农药中具有重要的意义和良好的应用前景。CGMCC NO.92772014.06.06
【专利说明】链格孢属Alternaria sp.真菌及其次生代谢物的制备和 作为微生物源杀螨剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物农药【技术领域】，涉及一株链格孢属Jheraaria 5/7.真菌；本发 明同时涉及该链格孢属真菌的分离方法；本发明还涉及该链格孢属真菌的次生代谢物作为 微生物源杀螨剂在制备农药中的应用。
【背景技术】
[0002] 螨类（mites)隶属于蛛形纲（Arachnida),蝶螨亚纲（Acari),种类繁多，全球约有 30?50万种，是动物界中仅次于昆虫纲的第二大生物类群。以植食性为主的农业螨类在 世界各地的农作物上都有发现，危害日益严重。农业害螨是不断侵占暂时性生境的种类，对 短暂的生活环境具有高度的适应性；个体小、繁殖能力强，寿命及每个世代的周期短，是典 型的R类害虫。它们破坏植物的正常生理机能，引起落叶、落蕾、落果，轻则造成减产，削弱 树势，重则整株死亡，不少螨类还能传播植物病害，是公认的最难防治的农业害虫之一。
[0003] 在控制害螨方面，自20世纪50年代以来，化学农药就起到不可替代的重要作用。 目前农业上防治害螨的，化学杀螨剂仍占现行杀螨剂品种的绝大部分；仅有的植物源、矿 物油杀螨剂均还属于第一代杀螨剂，杀螨效果低，且易产生药害。然而，正因为现行使用的 杀螨剂均为化学品，害螨虽得到了不同程度的遏制，但同时也带来了诸多的负面影响，尤其 是其对非靶标生物的杀伤以及导致的环境问题引起了全世界的广泛关注，"3R"问题(残留 (residue)、抗性（resistance)和害虫的再娼獗（resurgence))也日益严重。面对这种情 况，使用高效、低毒、低残留、对环境安全的生物农药，已成为农药开发研究的新方向。
[0004] 微生物农药是生物农药中很重要的部分，占全世界生物农药产品的近90%，包括农 用抗生素和活体微生物农药，是生物防治的物质基础和重要手段(袁兵兵，张海青，陈静. 微生物农药研究进展，山东轻工业学院学报，2010,24 (1)，45?49.)。微生物农药作为生 物农药产业的主体，有着诸多方面的优点：研发的选择余地大，开发利用途径多；防治病虫 效果好，使用时对人畜安全；特异性强、选择性高，对天敌和有益生物安全；多种因素和成 分发挥作用，使病虫难以产生抗药性；易于进行大规模工业化生产；生产原料和有效成分 属天然产物，在环境中容易降解，不会污染生态环境(张化霜，微生物农药研究进展，农药科 学与管理，2011，32( 11)，22-25.)。而目前市面上所售的杀螨微生物农药却非常少(倪珏萍， 2000年后杀虫杀螨剂研发进展，2009,13 (3)，1-7.)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株链格孢属Wieraaria 5/7.真菌； 本发明的另一目的是提供上述链格孢属ieraaria 5/7.真菌的分离方法； 本发明还有一个目的，就是提供上述链格孢属真菌的次生代谢物作为杀螨剂微生物源 在制备农药中的应用。
[0006] 一、链格孢属真菌(菌株） 本发明的链格孢属真菌，菌株为链格孢属Xheraaria 5/7.真菌；该菌株(记为Fl)已于 2014年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心地址 是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号 为CGMCC No. 9277 ;菌株Fl属链格孢属，具辐射状皱纹，边缘菌丝体灰色，质地绒状，分生 孢子结构大量，灰黑色，菌落反面呈黑色。
[0007] 二、链格孢属真菌及次生代谢物的分离鉴定 1、链格孢属真菌的分离 链格孢属5/7.真菌的分离方法，是将苜猜种子依次用酒精、质量浓度5? 10%的次氯酸钠溶液、无菌水冲洗后，在无菌条件下研磨，加入无菌水获得组织悬浮液；然 后对组织悬浮液进行系列梯度稀释，得到体积浓度为IXKT 4?1〇_8的组织悬浮稀释液；将 不同浓度的组织悬浮稀释液均匀涂抹在不同的马丁氏培养基平板上，于28 ± 2°C下避光 培养；待长出肉眼可见的真菌菌落后，挑出真菌菌落移至新鲜的马丁氏培养基上纯化，得到 纯的真菌菌株；在低温冰箱作短期保存或长期保存。短期保存是采用马丁氏斜面培养基划 线在0?5°C下保存；保存时间为0. 5?1年；长期保存在马丁氏液体培养基和甘油的混合 液中（马丁氏液体培养基与甘油的体积比为1:1?1:3)，在-60?-80°C下保存；保存时间 为1?3年。
[0008] 所述组织悬浮液的梯度稀释方法，是以10倍体积为单位，用无菌水进行系列稀 释，得到浓度梯度为IX 10' IX 10' IX 10' IX 10' IX KT8的系列稀释液。
[0009] 所述马丁氏培养基的组成成分=K2HPO4 · 3H20 lg，MgS04--7H20 0· 5g，蛋白胨5g，葡 萄糖l〇g，琼脂15?20g，水1000mL。
[0010] 2、链格孢属真菌的鉴定 提取上述分离所得的真菌Fl的18S rRNA序列，约1700 bp，扩增，测序，与GenBank中 的已知序列进行比对后，确定该菌为链格孢属真菌。
[0011] 基因序列如下： AACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGCAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGG GTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGG ACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTT GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT TTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT GGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAG CGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATC AGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAGAGCAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAG TAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTTAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGC GCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTACGTGGTCGCTGG CTATTGCCGTGTAAAGCCCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGAGGTACATTTCTTCTA AAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTC AAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAGCCAGACTTGCTTACAGTTGCTCATCCGGGTTTCTACCC GGTGCACTCTTCTGTAGGCAGGCCAGCATCAGTTTGGGCGGTAGGATAAAGGTCTCTGTCACGTACCTCCTTTCGGG GAGGCCTTATAGGGGAGACGACATACTACCAGCCTGGACTGAGGTCCGCGCATCTGCTAGGATGCTGGCGTAATGGC TGTAAGCGGCCCGTC 在菌种保藏的过程中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心也对菌种进行 了进一步的确证，确认为链格孢属Wieraaria 5/7.。
[0012] 3、链格孢属真菌的次生代谢物的制备 (1)菌种培养：将链格孢属J/ieraaria 5/7.真菌接种到马丁氏培养液中，放置在温度 为28 ± 2°C的摇床中，在100?140转/min的转速下避光培养，待菌落长大且无污染后， 得到真菌发酵液；马丁氏培养液的组成成分=K 2HPO4 · 3H20 lg，MgS04--7H20 0. 5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，水 1000mL。
[0013] (2)次生代谢物的制备：将真菌发酵液灭菌，过滤，然后用乙酸乙酯进行萃取，浓缩 萃取液至固体，得到该真菌的次生代谢物。
[0014] 三、链格孢属真菌次生代谢物的杀螨活性 1、链格孢属真菌Fl次生代谢物对朱砂叶螨的杀螨活性 1. 1供试叶螨 朱砂叶螨ci/zaaAari/ws (Boiduval)],选用雌成螨，采自田间未施药的 黄豆苗上。该螨为世界植食性害螨，因其个体小、繁殖快、种群密度大、发育历期短、行动范 围小、适应性强、突变率高且易发生抗药性等特点，是公认的最难防治的有害生物类群之一 (何林等，植物保护学报，2004，31 (4 )，395-400 )。
[0015] 1.2不同浓度代谢物的配制 次生代谢物先用含10%蒸馏水的丙酮液配制成2 mg/mL浓度的母液，在预试的基础上 用蒸馏水将母液稀释成不同梯度浓度的溶液待测。生物测定前加入1%的表面活性剂JFC (C7?C9烷醇聚氧乙烯醚)。
[0016] 1.3生物活性测定方法 参照FAO (联合国粮农组织）推荐的测定螨类的标准方法--玻片浸渍法，并加以改进 (Wang Y. J.，ei Agrochemical Research Application. 2006，10，20 - 23.)。将 双面胶带剪成2?3 cm长，贴在显微镜载玻片的一端，用镊子揭去胶带上的纸片，用零号毛 笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上(注意：不要粘住 螨足、螨须和口器)，每片粘3行，每行粘10头。在温度（25±1)°C、相对湿度85%左右的生 化培养箱中放置4 h后，用双目镜观察，剔除死亡或不活泼个体。药液配好后将带螨玻片的 一端浸入药液中，轻轻摇动5 s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。置于 上述生化培养箱中，24 h后用双目镜检查死亡数，计算死亡率。用毛笔轻触螨体，以螨足不 动者为死亡。以含10%蒸馏水的丙酮液稀释同样的倍数+JFC浸渍处理作为溶剂对照。对 照组死亡率在10%以下为有效测定，用Abbott公式对处理组死亡率进行校正。5个浓度测 定平行进行3次，取其平均值。试验结果分析采用SPSS统计软件(版本13. 0)进行，计算致 死中浓度LC5tl值。
[0017] 1.4 结果 测定结果见表1。经过计算，该真菌代谢物对朱砂叶螨的为毒力回归方程y = 143. 27x + 36. 453,致死中浓度 LC5。为 0· 095 mg/mL。
【权利要求】
1. 链格孢属Wieraaria 5/7.真菌，保藏编号为CGMCC No. 9277。
2. 如权利要求1所述链格孢属Wieraaria 577.真菌的分离方法，是将苜猜种子依次用 酒精、质量浓度5?10%的次氯酸钠溶液、无菌水冲洗后，在无菌条件下研磨，加入无菌水获 得组织悬浮液；然后对组织悬浮液进行系列梯度稀释，得到体积浓度为1X 1〇_4?1〇_8的组 织悬浮稀释液；将不同浓度的稀释液均匀涂抹在不同的马丁氏培养基平板上，于28 ± 2°C 下避光培养；待长出肉眼可见的真菌菌落后，将真菌菌落移至新鲜的马丁氏培养基上纯化， 得到纯的真菌菌株；在低温冰箱作短期保存或长期保存。
3. 如权利要求2所述链格孢属5/7.真菌的分离方法，其特征在于：所述组 织悬浮液的梯度稀释方法，是以10倍体积为单位，用无菌水进行系列稀释，得到浓度梯度 为 1 X 10_4、1 X 10_5、1 X 10_6、1 X 10_7、1 X 10_8 的系列稀释液。
4. 如权利要求2所述链格孢属J/ieraaria 5/7.真菌的分离方法，其特征在于：马丁氏 真菌分离培养基的具体组成成分：Κ2ΗΡ04 · 3H20 lg，MgS04--7H20 0. 5g，蛋白胨5g，葡萄糖 l〇g，琼脂 15 ?20g，水 1000mL。
5. 如权利要求2所述链格孢属577.真菌的分离方法，其特征在于：所述短 期保存是采用马丁氏斜面培养基在〇?5°C下保存；保存时间为0. 5?1年。
6. 如权利要求2所述链格孢属5/7.真菌的分离方法，其特征在于：所述长 期保存在马丁氏液体培养基和甘油的混合液中，在-60?_80°C下保存；保存时间为1?3 年。
7. 如权利要求6所述链格孢属5/7.真菌的分离方法，其特征在于：马丁氏 液体培养基与甘油的体积比为1:1?1:3。
8. 如权利要求1所述所述链格孢属J/ieraaria 5/7.真菌的次生代谢物的制备方法，包 括以下步骤： (1)菌种培养：将链格孢属J/ieraaria 5/7.真菌接种到马丁氏培养液中，放置在温度 为28 ± 2°C的摇床中，在100?140转/min的转速下避光培养，待菌落长大且无污染后， 得到真菌发酵液； (2)次生代谢物的制备：将真菌发酵液灭菌，过滤，然后用乙酸乙酯进行萃取，浓缩萃取 液至固体，得到该真菌的次生代谢物。
9. 如权利要求8所述所述链格孢属J/ieraaria 5/7.真菌的次生代谢物的制备方法，其 特征在于：马丁氏培养液的组成成分：K2HP04 · 3H20 lg，MgS04--7H20 0. 5g，蛋白胨5g，葡萄 糖 10g，水 1000mL。
10. 如权利要求8所述方法制备的链格孢属577.真菌的次生代谢物作为微 生物源杀螨剂的应用。
【文档编号】C12N1/14GK104277981SQ201410338141
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】刘权, 傅华, 南志标 申请人:兰州大学