专利名称：链格孢菌的粗代谢物用于生物除草的方法
技术领域：
本发明为链格孢菌的粗代谢物用于生物除草的方法，属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域，专用于农田杂草的防除。
微生物代谢物治草是以微生物的代谢产物或从微生物中分离得到的植物毒素作为除草剂治理杂草的一种方法。现已成为研究和开发的重点或热点。这类除草剂在贮存、应用、制剂的相容性和半衰期方面都比活体微生物更优越，且不会使非靶标植物染病，其药效通常也不依赖于环境因素，便于预测。茴香毒素(Anisomycin)是链霉菌代谢的产物，能强烈抑制稗草和马唐等杂草。“无公害”除草剂甲氧苯酮就是根据茴香霉素仿制而成的一种水田除草剂，对水稻和稗草有高度的选择性，抑制稗草叶绿素形成，产生白化而致死。青霉菌属(Penicillium frequentans)中的11个种，经发酵后能产生N-甲酰基羟氨基乙酸，可杀死马唐及一些双子叶杂草。金色假单胞杆菌(Psendomonasaurecafaciens)的发酵产物吩嗪-1-羧酸与2羟基吩嗪-1-羧酸，每英亩10磅的剂量可防除狗尾草、水田芥和水生植物蓝绿藻和浮萍(Lemna sp．)等。
这其中最著名的要数双丙氨膦，它是由吸水链霉菌(Streptomyces hygruscopicus)发酵的产物，在日本广泛地的应用。根据双丙氨膦的化学结构研制开发出的灭生性除草剂草胺膦(草丁膦)，在欧美国家广泛应用。并且，利用转基因技术研制开发出抗草胺膦作物，被广泛栽培，进一步，扩大了该除草剂的使用范围。
利用链格孢菌的活孢子作生物除草剂，防除杂草已有很多报道。但是，利用代谢产物进行除草，仅有以AAL-toxin毒素和交链孢酸为主要的有效成分进行除草的报道。AAL-toxin毒素的杀草作用申请了专利。在该专利中，曾提及含有该毒素的粗提物的除草活性，其主要有这些特征是主要针对某些阔叶杂草如龙葵、曼佗罗、弗吉尼亚合萌、大果田菁等，对禾本科杂草几乎无效；粗提物是以固体培养基如玉米粉或大米进行固体培养后，经水洗过滤而获得的过滤液，具活性的浓度在1000ppm以上等。交链孢酸也有类似的仅对阔叶草有效的特点。但是，这两种毒素除草的种类较少，不能防除禾草与莎草，对阔叶草的防除种类亦少；固体培养生产能力相对较低，不适于大规模工业化生产。
我国目前尚未有一种生物除草剂产业化，客观上推进生物除草剂的产业化，将改变我国目前除草剂的产品结构，农药化工的产业结构，以及满足绿色和有机食品生产对无公害除草剂的需求。
本发明的目的是针对现有链格孢菌毒素不能防除禾草与莎草，对阔叶草的防除种类亦少；固体培养生产能力相对较低，不适于大规模工业化生产的缺陷，提供一种链格孢菌的粗代谢物用于生物除草的方法，直接利用含有植物毒素活性成分的链格孢菌粗代谢产物作为生物源化学除草剂，用于生物除草，作为广谱性除草剂，茎叶喷雾处理，安全有效地控制禾本科杂草、阔叶草和莎草。适于大规模工业化生产的培养技术。对环境污染小，杀草谱广、杀草迅速。
本发明链格孢菌的粗代谢物用于生物除草的方法，其内容和实施方案如下链格孢菌的粗代谢产物用于控制杂草的方法为直接利用链格孢菌(Alternariaalternata(Fr．)Keissler)经PDA培养的菌种培养物小块，采用液体培养或小麦固体培养基培养，过滤掉活菌丝及其它活性细胞后，其粗代谢产物的混合物原液，经水稀释15倍以内至浓缩10倍间，其中粗代谢物的作用浓度在1000μg／ml以下。喷施于杂草茎叶上，在48小时内致杂草迅速死亡，这些杂草包括了主要的阔叶杂草、禾草和莎草。
液体培养方法为玉米和黄豆粉液体培养基(SCSC)、马铃薯蔗糖液体培养基(PSK)、紫茎泽兰叶汁培养基等液体培养基之一种PSK培养基200g土豆水煮过滤液(四层纱布过滤)，30g蔗糖，1gK2HPO4，加水至1L。
SCSC培养基15g玉米粉+15g黄豆粉，30g蔗糖，3gCaCO3，加水至1L。
紫茎泽兰叶汁培养基200g紫茎泽兰叶水煮过滤液，30g蔗糖，1gK2HPO4，加水至1L。
每1升培养液置于3升左右容积的培养瓶中，在23-26℃温度下，黑暗或12小时光照／12小时黑暗交替，静置或震荡(110转／分钟)培养5-8天。将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0．45μm微孔薄膜过滤，得无菌滤液。
小麦粒固体培养基称取100g，装入500ml的三角瓶中，用清水淘净后，再浸泡10h，除去多余水分，置于灭菌锅中灭菌30分钟(121℃)，冷却后接种链格孢菌株，于25℃、12hL(光)／12hD(暗)的条件下培养，每天摇动1-2次三角瓶，避免结块，3周后取出培养物，80℃下烘干，粉碎，然后用乙酸乙酯抽提3次，常压蒸馏回收乙酸乙酯，得粗毒素。
无菌滤液经稀释15以内至浓缩10倍间，可以加入1-5％的助剂，助剂为非离子型表面活性剂、植物源助剂以及渗透剂。主要种类有增效剂SD(SD)、十二烷基苯磺酸钠(12WB)、农乳100号(NR100)以及0．01-0．5％渗透剂等。喷雾于2-5叶期的杂草幼苗上，经5小时以上，杂草幼苗出现萎焉症状，再经2天左右时间并可以完全杀死杂草。可以杀死马唐、牛筋草、光头稗、稗草、野燕麦、看麦娘、日本看麦娘、菵草、硬草、牛毛毡、鳢肠、铁苋菜、猪殃殃、大巢菜、稻槎菜、藜、牛繁缕、雀舌草、节节菜、鸭舌草、播娘蒿、鸭趾草、水花生、反枝苋、野苋、荠菜等农田主要的阔叶杂草、禾草和莎草。
发明人在对紫茎泽兰的生物防治研究过程中发现了野外紫茎泽兰的自然发病现象，故对其寄生真菌进行筛选研究。分离获得了链格孢菌(Alternaria alternata(Fr．)Keissler)菌株，对其生物学特性、致病性及致病机理进行了深入的研究，发现其致病的主要作用机理是致病植物毒素的产生。通过对链格孢菌经液体培养后滤除活菌后的培养残液，测试培养残液、提取的粗毒素、以及分离提纯的毒素的除草生物活性，发现在1-1000μg／ml以内就能使杂草产生明显的毒害症状，引起毒害症状的最快时间在5小时，2天内可以完全杀死杂草。研究发现对供试的94种植物中，仅有3种不敏感。
粗毒素的制备是将菌株按上述的条件培养后，将培养液用4层纱布过滤，再用普通滤纸抽滤，取滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，将乙酸乙酯蒸馏回收，得粗毒素。粗毒素经少量无水酒精溶解，再用水稀释至特定浓度，处理杂草。
链格孢菌毒素溶液处理的部位，明显受害，症状的出现最快时间在5小时，致48小时，受处理的杂草部位完全坏死。毒素的毒害作用，仅限于受药剂处理的部位，几乎没有传导。
链格孢菌毒素影响杂草离体叶片细胞膜的透性，随着毒素浓度的增加，浸出液的相对电导率上升。当毒素浓度从1增加到2．5μg／g时，浸出液的相对电导率变化很小，而当毒素浓度从2．5增加到5μg／g时，浸出液的相对电导率变化很大，增加2倍多，当毒素浓度再增加时，浸出液的相对电导率上升很小，这个结果表明，毒素的吸收可能与膜上受体有关，当受体被饱和后，相对透性不再受毒素浓度的影响。链格孢菌毒素能引起紫茎泽兰叶组织K+和Na+的渗漏，随着毒素浓度的增加，浸出液中K+和Na+的含量上升。
引起细胞膜透性改变是致病毒素作用于寄主后发生的普遍性的反应。菌株产生的致病毒素能引起杂草离体叶片细胞膜的透性上升，K+、Na+的渗漏，叶组织的膜脂过氧化加剧，说明致病毒素引起细胞膜的伤害，造成膜功能的紊乱。致病毒素处理后，杂草离体叶片的过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)的活性下降，使活性氧清除系统中酶系统遭到破坏，活性氧过量积累，细胞因此受到伤害，最终使杂草叶片表现出受害症状。
本发明与现有技术相比，其主要优点和积极效果如下1)现有技术中链格孢菌采用玉米或大米固体培养基培养，主要针对某些阔叶杂草如龙葵、曼佗罗、弗吉尼亚合萌、大果田菁等，对禾本科杂草几乎无效；本发明链格孢菌经用液体培养的粗代谢产物，利用液体发酵培养的方法，便于大批量工业化生产。亦可采用小麦固体培养基固体培养，生产粗毒素，均能用于控制农田主要的阔叶杂草、禾草和莎草。粗毒素的直接利用，省却有效成分的提取和分离，简化工艺流程，减少设备的投资，降低生产成本。
2)现有技术中链格孢菌产物除草，要在2天以上。本发明中，链格孢菌经用液体培养的粗提液或其有效成分控制杂草，杀草速度快，能在5小时内使杂草受害，2天左右将杂草完全杀死。这对农田换茬时或播种前处理杂草具有很大的优越性。其以触杀型杀草为主，也便于在使用中利用位差选择性。其作用方式类似于目前普遍使用的化学除草剂百草枯。但是，链格孢菌液体培养的粗提液毒性显著低于百草枯，且活性亦更高。
3)链格孢菌液体培养的粗提液或其有效成分的活性较高，前者的有效浓度在1000ppm以下，而后者的有效浓度更低至1-25ppm。由于活性高，用量降低，对农田环境的污染性相对降低。
4)链格孢菌液体培养的粗提液或其有效成分，直接喷施于杂草的茎上，用于茎叶处理，可以控制绝大多数主要农田杂草，马唐、牛筋草、光头稗、稗草、野燕麦、看麦娘、日本看麦娘、菵草、硬草、牛毛毡、鳢肠、铁苋菜、猪殃殃、大巢菜、稻槎菜、藜、牛繁缕、雀舌草、节节菜、鸭舌草、播娘蒿、鸭趾草、水花生、小蓟、反枝苋、野苋、荠菜等阔叶杂草、禾草和莎草。因而，杀草谱特别宽，应用范围将更加广泛。另见表1。
表1 不同植物种类对活性成分的敏感性 (植物对粗毒素的敏感性分级标准0级，不敏感1级，稍敏感；2级，较敏感；3级，敏感；4级，很敏感；5级，极敏感)
实施例实施例1分别在澳大利亚的悉尼、Wollongong和中国的云南省等野外自然生长的紫茎泽兰发病植株上采集分离到6个菌株，经对501、402、503、LS、YN、AW等6个菌株菌种于PDA培养基上培养7天(25℃、L∶D=12∶12)，然后取直径为6．5mm大小的菌丝块，接种到300mlPSK液体培养基中(500ml三角瓶)，培养5-7天(25℃、L(光)∶D(暗)=12∶12、110转／分)，至菌丝开始变黑，将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0．45μm微孔薄膜过滤，得无菌滤液。以滤液制备无菌滤液，用针刺法接种到紫茎泽兰离体叶片上，在培养皿中培养(25℃、12hL(光)／12hD(暗)、滤纸保湿)间隔一定时间后，置于解剖镜下观察和记录病斑的直径大小，最后统计分析确定菌株产毒能力的差异。对照分别采用无菌水(CK1)和无菌处理的PSK(CK2)。
试验结果表明菌株501培养物无菌滤液对紫茎泽兰的致病力最强，因而其中的致病毒素含量应是最高的，故此，该菌株的产毒能力明显高于其它各菌株。从而，也说明链格孢菌的不同菌株间的产毒能力是有差异的。实施例2将501菌株接种在SCSC液体培养基中，于温度为25±1℃、光照为12h／d、摇速为110rpm／min的条件下培养5-7天。将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0．45μm微孔薄膜过滤，得无菌滤液。
用将过滤液经加热浓缩20倍、10倍、5倍、2．5倍、1倍、原液、或经稀释1倍、2．5倍、5倍、10倍、20倍的紫茎泽兰链格孢毒素浓缩液分别喷雾至三叶期的马唐幼苗。分别在处理1天、2天、3天、7天后观察杂草受害情况。表2 链格孢菌毒素不同浓度浓缩液对马唐三叶期幼苗的防除效果 N过滤原液浓缩X过滤原液稀释表中数据为防除百分率。
表3 不同植物种类对501菌株粗毒素的敏感性 (植物对粗毒素的敏感性分级标准病情指数(％)0-0级，不敏感；1-20-1级，稍敏感；21-40-2级，较敏感；41-60-3级，敏感；61-80-4级，很敏感；81-100-5级，极敏感)实施例3如实例2所述生产链格孢菌粗提液加入，加入助剂和0．1％渗透剂，能明显提高链格孢菌粗提液除草效果。表4 不同助剂对链格孢菌粗提液杀草作用的影响(供试杂草为马唐) X过滤原液稀释表中数据为防除百分率。
权利要求
1．格孢菌的粗代谢物用于生物除草的方法，其特征在于直接利用链格孢菌(Alternaria alternata(Fr．)Keissler)经PDA培养的菌种培养物小块，采用液体培养或小麦固体培养基培养，过滤掉活菌丝及其它活性细胞后，其粗代谢产物的混合物原液，经水稀释15倍以内至浓缩10倍间，喷施于杂草茎叶上。
2．根据权利要求1所述的链格孢菌粗代谢物用于生物除草的方法，其中液体培养基为玉米和黄豆粉液体培养基(SCSC)、马铃薯蔗糖液体培养基(PSK)、小麦粒固体培养基等。
3．根据权利要求1或2所述的链格孢菌粗代谢物用于生物除草的方法，其特征在于无菌滤液经稀释15倍以内至浓缩10倍间，可以加入1-5％的助剂，助剂为非离子型表面活性剂、植物源助剂及渗透剂。
4．根据权利要求1或2所述的链格孢菌粗代谢物用于生物除草的方法，其特征在于助剂为增效剂SD、十二烷基苯磺酸钠、农乳100号以及0．01-0．5％渗透剂等。
5．根据权利要求3所述的链格孢菌粗代谢物用于生物除草的方法，其特征在于助剂为增效剂SD、十二烷基苯磺酸钠、农乳100号以及0．01-0．5％渗透剂等。
全文摘要
本发明为链格孢菌液体培养的粗代谢产物用于控制杂草的方法,属于微生物应用于农业植物保护领域。直接利用其粗代谢产物的混合物原液,经水稀释15倍以内至浓缩10倍间,喷施于杂草茎叶上,在48小时内致杂草迅速死亡,这些杂草包括了主要的阔叶杂草、禾草和莎草,具广谱性。所用的液体培养基为玉米和黄豆粉液体培养基、马铃薯蔗糖液体培养基。亦可以小麦粒固体培养基进行培养。施药5小时即可引起杂草明显的受害症状,症状表现是使杂草萎焉,接触药液处形成伤害,具有显触杀型的特点。
文档编号C12N1/14GK1293241SQ00112560
公开日2001年5月2日 申请日期2000年9月20日 优先权日2000年9月20日
发明者强胜, 万佐玺, 董云发, 李扬汉, 朱春林, 戴宝江 申请人:南京农业大学, 南通江山农药化工股份有限公司