专利名称：作物脂肪氧化酶同功酶lox－1.lox－2.lox－3的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生化检测方法，更具体地说是一种水稻、大豆等作物中酶的检测方法。
脂肪氧化酶(Lipoxygenase，LOX)广泛存在于植物特别是高等植物体内，脂肪氧化酶具有三种同功酶即LOX-1，LOX-2和LOX-3，目前还不完全清楚LOX酶的生理功能，但其活力直接影响食品原料如大豆、小麦、水稻等种子的贮藏和加工品质。许多研究表明水稻稻谷贮藏过程中的陈化作用以及大豆加工中的豆腥味均与脂肪氧化酶有直接的关系，所以通过植物遗传改良的方法选育LOX酶缺失的农作物新品种。是解决稻米陈化、大豆腥味等问题的最有效途径。然而发展简便、快速的LOX酶活力检测技术，特别是开发方便实用的检测试剂盒是作物脂肪氧化酶缺失品种选育及产品收购、贮藏实用化的关键所在。
LOX酶的活性可用多元不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等作为反应基质，利用氧电极和分光光度法来测定1．1氧电极法根据基质浓度一定，反应体系中的溶解氧浓度的变化与酶活力大小呈线性相关的原理进行测定，即由于LOX催化耗氧，溶液中氧浓度的减小速率与酸活力大小成正比。氧电极法测定的LOX活力常因低物种类酶浓度、低物浓度、温度等条件所左右，较适于柱层析过程中的酶的监测。
1．2分光光度法在反应体系中LOX使多元不饱和脂肪酶氧化形成具有共轭双产生的过氧化氢物，此化合物在234nm波长处有吸收峰、峰高度与酶活力有显著的正相关。分光光度法的结果受温度、时间、酶浓度等影响较大。
1．3薄层等电聚焦电泳技术利用在一定试验条件下LOX酶电泳然后通过考马斯亮蓝蛋白质染色使LOX同功酶带显色出来，该方法也会因一种LOX的缺失而发生其它LOX等电点正极漂移现象。
1．4单克隆抗体检测法利用纯化的LOX酶作为抗原诱发哺乳动物如小白鼠免等产生专一性的抗体，形成杂交瘤，利用杂交瘤产生对LOX酶专一性的单克隆抗体，检测时通过抗原抗体结合的反应，显示酶的活性大小，该法结果可靠准确，但需要较高的技术条件和昂贵的仪器设备。
目前使用的方法均需要一定较高的试验条件特定的专业技术人员才能完成，不宜广泛推广应用。
本发明的目的是提供一种新的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，快速、直观便捷地测定大豆、水稻中LOX-1、LOX-2、LOX-3酶的有无或多少。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于将作物果实研成粉末加入检测液，振荡3～10分钟，并放置10～15分钟后，再加入指示液，指示液的颜色变浅或消褪，则表示该作物中存在脂肪氧化酶同功酶LOX-1或LOX-2或LOX-3，如指示液颜色不变，则表示LOX-1或LOX-2或LOX-3酶缺失。
所述作物为水稻或大豆。
检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液的组成为PH4.0～5.0，150mM～250mM的醋酸缓冲液，0～2.0％(W/V)吐温20，.0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH4.0～5.0，150～250mM硼醋酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml。
检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液的组成为PH5.0～6.0，150mM～250mM的醋酸缓冲液，含0～2.0％(W/V)吐温20，.0～15％(V/V)的甘油；
b、指示液的组成为二硫苏糖醇120～180mg，PH5～6，150～250mM醋酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml。
检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液的组成为PH6.0～7.0，150～250mM磷酸缓冲液，含0～2.0％(W/V)吐温20，0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH6～7，150～250mM磷酸缓冲液20～30ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml，β-葫萝卜素+丙酮1/2～1/10饱和度3～7ml。
检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液的组成为PH4.6，200mM的醋酸缓冲液，含1.5％(W/V)吐温20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH4.6，200mM醋酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml。
检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液的组成为PH5.6，200mM醋酸缓冲液，含1.5％(W/V)吐温20，10％(V/V)甘油；b、指示液的组成为二硫苏糖醇154mg，PH5.6，200mM醋酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，丙酮5ml，10mM亚油酸钠5ml。
检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液的组成为PH6.6，200mM磷酸缓冲液，含1.5％(W/V)吐温20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH6.6，200mM磷酸缓冲液25ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml，1/2～1/10饱和度β-葫萝卜素+丙酮5ml。
检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液为蒸馏水或PH8.5～9.5，150～250mM硼酸缓冲液，含0～30mMCaCL2b、指示液的组成为PH8.5～9.5，150～250mM硼酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml。
检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液为蒸馏水或PH5.8～6.4，150～250mM磷酸缓冲液，含0～30mMCaCL2；b、指示液的组成为二硫苏糖醇120～180mg，PH5.8～6.4，150～250mM磷酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml。
检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液为PH6.5～7.0，150～250mM磷酸缓冲液或蒸馏水，0～30mMCaCL2；b、指示液组成为PH6.5～7.0，150～250mM磷酸缓冲液20～30ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml，1/2～1/10饱和度β-葫萝卜素+丙酮3～7ml。
检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液PH9.0 200mM硼酸缓冲液，含20mM CaCL2；b、指示液组成为PH9.0，200mM硼酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml。
检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液PH6.0 200mM磷酸缓冲液，20mM CaCL2b、指示液为二硫苏糖醇154mg，PH6.0，200mM磷酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，丙酮5ml，10mM亚油酸钠5ml。
检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液为PH6.6，200mM磷酸缓冲液，20mM CaCL2；b、指示液的组成为PH6.6，200mM磷酸缓冲液25ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml，1/2～1/10饱和度β-葫萝卜素+丙酮5ml。
该发明利用LOX酶能偶联氧化类胡萝卜素甲基蓝等氧化还原指示剂产生漂白反应的显色过程。利用β-胡萝卜素作为LOX-3的指示剂，用次甲基蓝作为LOX-1和LOX-2的指示剂，通过目测LOX酶和指示剂反应的结果，判断作物品种LOX同功酶的缺失，缺失同功酶的种类以及LOX酶的活性大小。
上述测试方法加以完善简化制成专用的试剂盒，根据试验目的、检测对象、试剂特点进行组合，以确保试剂的稳定性，便于较长时间保存，其中指示液宜用深棕色容器并充氮气包装。
本方法的优点及用途优点①用该方法具有简便、快速，结果准确等特点，因为提供LOX存在和缺失的阴、阳对照，对结果判别一目了然。
②不需复杂的实验条件和高精密的试验仪器。
③易于制成试剂盒，便于携带和推广。
④对使用者来说，不要求较高的文化，步骤简单，并可根据对照进行结果判断，易于操作。
用途①可供农作物育种者在选择LOX缺失的材料、品系、品种中，根据LOX酶活性有无判断LOX酶基因是否缺失，决定该材料的利用价值。
②粮食部门(特别是国家、地方、部队专用粮贮备库、大豆贮备库)中长期种子库、农民贮粮大户；豆制品、豆浆加工企业收购原料时作为检测其耐贮藏性，加工品质的依据。
③方便购买大豆原料自制豆浆的消费者能保证购买到无豆腥味的大豆。
以下通过实施例，对本发明作进一步的描述。实施例一、配制检测液和指示液水稻
大豆
二、检测过程1、水稻品种LOX的检测取20粒稻谷，去壳机去壳后，用取胚器将胚取出，再将其放入研钵中，加液N2充分研磨后将其移入比色管中加1mlLOXA液充分振荡3～10min再放置15min，加入4ml B液振荡均匀，同时作一对照观察观察，30～60min后颜色即变浅即证明该品种稻谷含LOX量较高。
2、大豆梦丰品种检测称取大豆梦丰品种粉末2.5mg加0.5ml LOX-3 A液充分振荡3-10分钟放置，再加入2ml B液振荡均匀同时作一对照观察可见颜色不变化，证明该品种LOX-3含量较低。
权利要求
1.一种作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于将作物果实研成粉末加入检测液，振荡3～10分钟，并放置10～15分钟后，再加入指示液，指示液的颜色变浅或消褪，则表示该作物中存在脂肪氧化酶同功酶LOX-1或LOX-2或LOX-3，如指示液颜色不变，则表示LOX-1或LOX-2或LOX-3酶缺失。
2.根据权利要求1所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于所述作物为水稻或大豆。
3.根据权利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液的组成为PH4.0～5.0，150mM～250mM的醋酸缓冲液，0～2.0％(W/V)吐温20，.0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH4.0～5.0，150～250mM硼醋酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml。
4.根据权利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液的组成为PH5.0～6.0，150mM～250mM的醋酸缓冲液，含0～2.0％(W/V)吐温20，.0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为二硫苏糖醇120～180mg，PH5～6，150～250mM醋酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml。
5.根据权利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液的组成为PH6.0～7.0，150～250mM磷酸缓冲液，含0～2.0％(W/V)吐温20，0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH6～7，150～250mM磷酸缓冲液20～30ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml，β-葫萝卜素+丙酮1/2～1/10饱和度3～7ml。
6.根据权利要求3所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液的组成为PH4.6，200mM的醋酸缓冲液，含1.5％(W/V)吐温20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH4.6，200mM醋酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml。
7.根据权利要求4所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液的组成为PH5.6，200mM醋酸缓冲液，含1.5％(W/V)吐温20，10％(V/V)甘油；b、指示液的组成为二硫苏糖醇154mg，PH5.6，200mM醋酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，丙酮5ml，10mM亚油酸钠5ml。
8.根据权利要求5所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液的组成为PH6.6，200mM磷酸缓冲液，含1.5％(W/V)吐温20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的组成为PH6.6，200mM磷酸缓冲液25ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml，1/2～1/10饱和度β-葫萝卜素+丙酮5ml。
9.根据权利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液为蒸馏水或PH8.5～9.5，150～250mM硼酸缓冲液，含0～30mMCaCL2；b、指示液的组成为PH8.5～9.5，150～250mM硼酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml。
10.根据权利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液为蒸馏水或PH5.8～6.4，150～250mM磷酸缓冲液，含0～30mMCaCL2；b、指示液的组成为二硫苏糖醇120～180mg，PH5.8～6.4，150～250mM磷酸缓冲液20～30ml，50～150μM次甲基蓝3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml。
11.根据权利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液为PH6.5～7.0，150～250mM磷酸缓冲液或蒸馏水，0～30mMCaCL2；b、指示液组成为PH6.5～7.0，150～250mM磷酸缓冲液20～30ml，5～15mM亚油酸钠3～7ml，蒸馏水3～7ml，1/2～1/10饱和度β-葫萝卜素+丙酮3～7ml。
12.根据权利要求9所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1时，a、检测液PH9.0 200mM硼酸缓冲液，含20mM CaCL2；b、指示液组成为PH9.0，200mM硼酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml。
13.根据权利要求10所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2时，a、检测液PH6.0 200mM磷酸缓冲液，20mM CaCL2b、指示液为二硫苏糖醇154mg，PH6.0，200mM磷酸缓冲液25ml，100μM次甲基蓝5ml，丙酮5ml，10mM亚油酸钠5ml。
14.根据权利要求11所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的检测方法，其特征在于检测大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3时，a、检测液为PH6.6，200mM磷酸缓冲液，20mM CaCL2；b、指示液的组成为PH6.6，200mM磷酸缓冲液25ml，10mM亚油酸钠5ml，蒸馏水5ml，1/2～1/10饱和度β-葫萝卜素+丙酮5ml。
全文摘要
本发明公开了一种作物脂肪氧化酶同功酶LOX—1、LOX—2、LOX—3的检测方法,是将被检测作物的器官研磨粉碎加入检测液,振荡后放置,再加入指示液,通过观察指示液的颜色变浅或消褪,则表示该作物种子和果实中存在脂肪氧化酶同功酶LOX—1或LOX—2或LOX—3,该方法检测LOX酶快捷,可作为选育耐贮藏水稻,无豆腥味大豆作物新品种的依据,也可作为粮食收贮企业收购大豆、水稻时判断其耐贮藏性,加工品质的依据。
文档编号C12Q1/26GK1296080SQ00112539
公开日2001年5月23日 申请日期2000年9月13日 优先权日2000年9月13日
发明者吴跃进, 吴敬德, 张瑛, 童继平, 郑乐娅 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所