专利名称：小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测引物及分子检测方法
技术领域：
本发明属于农作物病害检测技术领域，具体涉及一种小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测弓I物及分子检测方法。
背景技术：
小麦黑胚病是一类小麦的颖果表面有不同形状和程度的黑色、褐色、粉红色、红色、灰白色等病变的病害，病因复杂。研究表明弓I起小麦黑胚病的主要病原菌有链格孢菌、麦类根腐离蠕孢菌、禾谷镰刀霉等，其中链格孢菌是河南省小麦黑胚病的优势病原菌。链格孢菌不仅感染小麦籽粒，在根部、茎部、叶片都能引起不同病症，对小麦危害严重。带菌量大的小麦种子会导致幼苗弱、根腐、茎腐，影响小麦的生长和产量，严重者甚至会导致麦苗的枯萎死亡。链格孢菌侵染叶片会引起小麦叶枯病，初期在叶片上形成较小的黄色褪绿斑，后扩展至中央成灰褐色，边缘黄褐色长圆形病斑，潮湿时病斑表面可形成灰黑色霉层。由链格孢菌引起的小麦黑胚病影响小麦产量和品质，更严重的是链格孢菌产生链格孢毒素，如链格孢酚、链格孢酚甲基乙醚、细交链孢菌酮酸、链格孢霉素、细格菌毒素1、
I1、ΠΙ和AAL毒素。长期食用含这些毒素的食品会引起慢性中毒、诱发癌变。建立快速、准确的病原检测技术是小麦抗病遗传研究、抗病育种、病害防治的需要。目前对小麦黑胚病优势病原菌的检测方法主要是平板培养菌落分离、显微镜观察鉴定法，依据的是菌落形态、以及菌丝和孢子结构， 鉴定操作复杂，步骤多，周期长，难以定量，无分子检测技术报道。对链格孢属真菌的分子检测在十字花科蔬菜、石榴、胡萝卜中已有一些报道。然而，上述物种病原链格孢菌与小麦病原链格孢菌虽同归一属，但为不同小种，由于链格孢菌侵染寄主的专化性，其他物种上的病原均不侵染小麦，其基因序列也具有明显差另Ij，所以，这些方法不能用于小麦病原链格孢菌的分子检测。
发明内容
针对常规小麦黑胚病病原菌鉴定技术操作复杂、步骤多、周期长、效率低等问题，本发明提供了一种小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测引物，该检测引物对小麦病原链格孢菌有很强的特异性，本发明还提供了一种小麦病原链格孢菌的快速巢式PCR检测技术，该分子检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点。本发明包括以下技术方案:
本发明提供了一种小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测引物，所述引物的核苷酸序列为:上游引物AalF:5 ' -TATGAAGGCGGGCTGGAA-3 '，下游引物AalR:5' -TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3'。本发明提供了上述引物在对小麦病原链格孢菌的鉴别或检测中的应用。本发明还提供了一种利用上述引物检测小麦病原链格孢菌的方法，包括以下步骤:(1)提取小麦种子或植株上待检测组织的基因组DNA；
(2)以所述DNA为模板用病原真菌通用引物ITSl5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行第一轮 PCR 扩增:PCR 扩增采用 25 μ L 反应体系，其中包括:0.25 μ L 的 5 U/μ L Taq DNA 聚合酶，2.5 yL 含 15mmol/L MgClJAlOXPCRBuffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue,各 I μ L 的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ；PCR 扩增程序:95°C预变性 5 min, 30 个循环的95°C变性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S，最后在72°C延伸10 min ；
(3)用小麦病原链格孢菌特异引物进行第二轮特异性扩增:将第一轮PCR产物稀释200倍，取I μ L进行第二轮PCR扩增，PCR扩增采用25 μ L反应体系；其中包括:0.25 μ L的 5 U/μ L Taq DNA 聚合酶，2.5 μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF 和 AalR 引物，I yL 的第一轮 PCR 扩增产物稀释模板，17.25 μ L的ddH20 ；PCR扩增程序:94°C预变性5 min, 20个循环的94°C变性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 S，最后在72°C延伸10 min ；
(4)取10μ L上述PCR产物，用质量浓度为1.5% 2.0%的琼脂糖胶电泳分离，电泳缓冲液为1ΧΤΑΕ，电压为Γ5 V/cm,电泳结束后用溴化乙锭染色，凝胶成像系统分析；在443bp处出现特异条带，说明小麦籽粒带有病原链格孢菌，反之则不携带链格孢菌。根据上述的检测小麦病原链格孢菌的方法，所述步骤(4)中琼脂糖胶的质量浓度为2%，电泳电压为5 V/cm。本发明积极有益的效果: 我们在河南省小麦黑胚病籽粒上分离了 7个链格孢小种，对这些小种和I个标准链格抱菌小种进行了测序分析，另外参考的序列还有tenuissima strain EGS34-015 (GenBank 查询号:AF347032.1UJtemaria a I terna ta strain EGS 34-016(GenBank 查询号:AF347031 UJtemaria tenuis EU732734.1 (GenBank 查询号:FJ040178.1)，设计了能特异性鉴定小麦链格孢菌的引物，建立了本发明的巢式PCR分子检测技术。1.本发明特异性引物对小麦病原链格孢菌有很强的特异性，能够区别小麦病原链格孢菌与小麦其他主要病原菌麦类根腐离蠕孢菌、小麦白粉菌、禾谷丝核菌、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌。2.本发明分子检测方法操作简便、快速、特异性强、灵敏度达0.05 ng/yL、可进行相对定量分析，且检测成本较低，可用于检测小麦籽粒、根、茎、叶、穗各组织所携带的链格孢菌，用于小麦链格孢菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供科学依据。3.链格孢菌和麦类根腐离蠕孢菌是小麦黑胚病的2大主要病原菌，广泛存在于小麦生产区，在没有快速、特异性鉴定和相对定量分析病原菌技术的情况下，无法就小麦对这2种病原的专化抗病性进行研究。本发明的建立使小麦抗链格孢黑胚病的遗传和基因定位研究成为可能，有利于推进小麦抗链格孢黑胚病遗传研究和抗病育种工作。本发明正是为了解决我们进行小麦抗链格孢黑胚病的遗传和基因定位研究中遇到的这些问题而攻克的技术难题。
:图1本发明对不同样品进行的检测试验电泳图。图中M为分子量标准DL2000，第广8泳道分别为链格孢菌标准菌株EGS34-016、河南省分离菌株Ta-Aa-1 Ta_Aa_7，第9泳道为麦类根腐离蠕孢菌，第10泳道为小麦白粉菌，第11泳道为禾谷丝核菌，第12泳道为禾谷镰刀菌，第13泳道为串珠镰刀菌，第14泳道为弯孢霉，第15泳道为小麦叶片DNA，第16泳道为空白对照水；
图2本发明对病原链格孢菌检测灵敏度试验电泳图。图中Γ8泳道分别对应的病原链格孢菌DNA浓度为 I pg/ μ L、10 pg/ μ L、50 pg/ μ L、100 pg/ μ L、500 pg/ μ L、1 ng/ μ L、10ng/ μ L 和 50 ng/ μ L ；
图3本发明实施例2对链格孢菌叶枯病叶片样品检测的电泳图。图中f 5泳道分别对应接囷后发病O 4级的叶片样品，弟6泳道为未接囷的对照叶片样品；
图4本发明实施例1对接种链格孢菌和自然发病的小麦黑胚病籽粒进行的检测电泳图。图中I 5泳道分别对应接菌收获的黑胚病级O 4级种子样品，第6、7泳道为自然发病O级、I级黑胚病籽粒样品，第8泳道为链格孢菌，第9泳道为麦类根腐离蠕孢菌，第10泳道为小麦健康叶片样品，第11泳道为空白对照水。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。本发明小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测引物核苷酸序列为:上游引物AalF:5' -TATGAAGGCGGGCTGGAA-3'和下游引物 AalR:5' -TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3'。利用该引物可以从小麦病原链格孢菌上特异性扩增出443 bp的产物。实施例1
上述引物用于小麦籽粒携带链格孢菌情况分子检测方法，包括以下步骤:
(I)样品米集
选取收获的田间接种链格孢菌的小麦籽粒和自然发黑胚病的小麦籽粒，-20°C保存备用。(2)样品研磨
分别将上述小麦籽粒在灭菌的研钵中研磨，研磨过程中应注意避免样品的交叉污染；也可采用组织研磨机研磨:取一粒小麦种子，先粗略捏碎，放入2 mL灭菌离心管中，每管放入一粒直径5 mm的钢珠，将离心管放于液氮中预冷，预冷后用组织研磨机30 Hz研磨I min。(3) DNA 提取
①向研磨粉碎好的样品中加入800μ L的SLS细胞裂解液(陈广进，李红叶，张志芳.一种快速提取真菌DNA的SLS裂解液及其应用[P].CN: 200810059177，2008-07-30)，由于种子中含多糖较多，在SLS裂解液中加入占其体积2%-6%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再放入65°C水浴锅中水浴加热10-15 min，期间轻微摇晃离心管，使样品裂解液不沉降于管底，以便充分裂解；
②向离心管中加入800μ L的体积比为25:24:1的苯酚、氯仿、异戊醇混合溶剂，轻微摇动I min左右，使之成乳浊状，即混合均匀；
③在12000r/min下离心10 min,用剪过的枪头轻轻地吸取上清液600 μι,转入含有360 μ L异丙醇的1.5 mL离心管中，将离心管慢慢上下摇动30 S，使异丙醇与上清液充分混合；
④室温下静置30min或-20°C下10 min沉淀DNA ；
⑤在12000r/min下离心10 min,倒掉液体,注意勿将DNA沉淀倒出；
⑥向离心管中加入ImL的体积浓度为75%的乙醇，上下晃动，用手指轻弹管尖，使DNA沉淀悬浮于乙醇中；
⑦在12000r/min下离心5 min,倒掉液体,重复上一步的操作；
⑧在12000r/min下离心3 min，将管内的液体彻底倒干净后，于室温下自然干燥
DNA ；
⑨在DNA干燥后加入40μ L的TE缓冲液，_20°C保存备用。(4) PCR扩增检测
①第一轮通用引物PCR扩增:
PCR扩增采用25 μ L反应体系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ;PCR 扩增程序:95°C预变性5 min ；30个循环的95°C变性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S ;最后在 72 延伸 10 min ;ITS1 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' , ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTG-ATATGC-3'(刘春来，文 景芝，杨明秀，李永刚.rDNA-1TS在植物病原真菌分子检测中的应用.东北农业大学学报，2007，38(1): 101-106)；
②第二轮特异引物PCR扩增:
将第一轮PCR产物稀释200倍，取I UL进行第二轮PCR扩增；PCR扩增采用25 μ L反应体系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5 “1^含15臟01/1 MgCl 2的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue,各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF和AalR引物，I μ L的第一轮PCR扩增产物稀释模板，17.25 μ L的ddH20 ;PCR扩增程序:94°C预变性5 min;20个循环的94°C变性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 s ;最后在72°C延伸 10 min ；
③电泳检测
取10 μ L PCR产物，用质量浓度为2%的琼脂糖胶电泳分离，电泳缓冲液用I X TAE缓冲液，电压为5 V/cm,电泳结束后用溴化乙锭染色，用凝胶成像系统分析。(5)检测结果
电泳结果见图4，田间接菌的小麦籽粒和自然发病的小麦籽粒均带有链格孢菌，O级小麦籽粒虽然表面还未出现黑胚症状，但经检测亦存在链格孢菌。实施例2
上述引物用于小麦叶片携带链格孢菌情况分子检测方法，包括以下步骤:
(I)样品采集
取加入其体积比0.02%吐温的链格孢菌孢子悬浮液喷洒到一叶一心期的小麦叶片上，对照喷洒无菌水，待叶面晾干后，加上透明塑料板制成的罩子；每12 h向罩子内侧喷洒无菌水以保湿；接菌后第10天取不同发病级别的小麦叶片和正常叶片进行检测。(2)提取样品DNA①0.05g发病小麦叶片置于灭过菌的2 mL离心管中，每管放入一粒直径5 mm的钢珠，将离心管放于液氮中预冷，预冷后用组织研磨机30 Hz研磨I min;也可在灭过菌的研钵中直接研磨；
②向粉碎好的样品中加入800UL的SLS细胞裂解液，放入65°C水浴锅中水浴加热10-15 min，期间轻微摇晃离心管，使样品裂解液不沉降于管底，以便充分裂解；
③向离心管加入800μ L的体积比为25:24:1的苯酹、氯仿、异戍醇混合溶剂,轻微摇动I min左右，使之成乳浊状，即混合均匀；
④在12000r/min下离心10 min ;用剪过的枪头轻轻地吸取上清液600 μ L,转入含有360 μ L异丙醇的1.5 mL离心管中，将离心管慢慢上下摇动30 S，使异丙醇与上清液充分混合；
⑤室温下静置30min或-20°C下10 min沉淀DNA ；
⑥在12000r/min下离心10 min,倒掉液体,注意勿将DNA沉淀倒出；
⑦向离心管中加入ImL的体积浓度为75%的乙醇，上下晃动，用手指轻弹管尖，使DNA沉淀悬浮于乙醇中；
⑧在12000r/min下离心5 min,倒掉液体,重复上一步的操作；
⑨在12000r/min下离心3 min，将管内的液体彻底倒干净后，于室温下自然干燥
DNA ； ⑩在DNA干燥后加入40μ L的TE缓冲液，_20°C保存备用。(3) PCR扩增检测
①第一轮通用引物PCR扩增:
PCR扩增采用25 μ L反应体系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue,各 I μ L的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ；PCR 扩增程序:95°C预变性5 min ；30个循环的95°C变性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S ;最后在72°C延伸10 min ；
②第二轮特异引物PCR扩增:
将第一轮PCR产物稀释200倍，取I μ L进行第二轮PCR扩增；PCR扩增采用25 μ L反应体系，其中包括:0.25 μ L的5 U/μ L Taq DNA聚合酶，2.5 “1^含15臟01/1 MgCl2的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF 和AalR引物，I μ L的第一轮PCR扩增产物稀释模板，17.25 μ L的ddH20 ;PCR扩增程序:94°C预变性5 min ;20个循环的94°C变性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 s ;最后在72°C延伸10 min ；
③电泳检测
取10 μ L PCR产物，用质量浓度为2%的琼脂糖胶电泳分离，电泳缓冲液用I X TAE缓冲液，电压为5 V/cm,电泳结束后用溴化乙锭染色，用凝胶成像系统分析。(4)检测结果
电泳结果见图3，接菌的小麦叶片均带有链格孢，O级发病的小麦叶片虽然表面未出现发病症状，但经检测亦存在链格孢菌，而未接菌叶片表面未发病，且PCR检测亦未检测到链格孢菌的存在。
权利要求
1.一种小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测引物，其特征在于:所述引物的核苷酸序列为:上游引物AalF:5 ' -TATGAAGGCGGGCTGGAA-3 '，下游引物AalR:5' -TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3'。
2.权利要求1所述引物在对小麦病原链格孢菌的鉴别或检测中的应用。
3.一种利用权利要求1所述引物检测小麦病原链格孢菌的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)提取小麦种子或植株上待检测组织的基因组DNA； (2)以所述DNA为模板用病原真菌通用引物ITSl5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行第一轮 PCR 扩增:PCR 扩增采用 25 μ L 反应体系，其中包括:0.25 yL的5 U/yL Taq DNA聚合酶，2.5MgCl2的IOXPCRBuffer, 2 μ L 的 2.5 mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L ITSl 和 ITS4 引物，I μ L 的 50 ng/ μ L DNA, 17.25 μ L 的 ddH20 ；PCR 扩增程序:95°C预变性 5 min, 30 个循环的95°C变性30 s、58°C退火30 s和72°C延伸50 S，最后在72°C延伸10 min ； (3)用小麦病原链格孢菌特异引物进行第二轮特异性扩增:将第一轮PCR产物稀释200倍，取I μ L进行第二轮PCR扩增，PCR扩增采用25 μ L反应体系；其中包括:0.25 μ L的 5 U/μ L Taq DNA 聚合酶，2.5 μ L 含 15mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer, 2 μ L 的 2.5mmol/L dNTP Mixtrue，各 I μ L 的 10 μ mol/L AalF 和 AalR 引物，I yL 的第一轮 PCR 扩增产物稀释模板，17.25 μ L的ddH20 ;PCR扩增程序:94°C预变性5 min, 20个循环的94°C变性30 s、56°C退火30 s和72°C延伸40 S，最后在72°C延伸10 min ； (4)取10 μ L上述PCR产物，用质量浓度为1.5% 2.0%的琼脂糖胶电泳分离，电泳缓冲液为1ΧΤΑΕ，电压为Γ5 V/cm,电泳结束后用溴化乙锭染色，凝胶成像系统分析；在443bp处出现特异条带，说明小麦籽粒带有病原链格孢菌，反之则不携带链格孢菌。
4.根据权利要求3所述的检测小麦病原链格孢菌的方法，其特征在于:所述步骤(4)中琼脂糖胶的质量浓度为2%，电泳电压为5 V/cm。
全文摘要
本发明属于农作物病害检测技术领域，具体公开了一种小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测引物及分子检测方法。本发明设计了一对小麦黑胚病优势病原链格孢菌的检测引物，其核苷酸序列为上游引物Aa1F5′-TATGAAGGCGGGCTGGAA-3′，下游引物Aa1R5′-TTTGCTGATAGAGAGTGCGAC-3′，该特异性引物对小麦病原链格孢菌有很强的特异性，能够区别小麦病原链格孢菌与小麦其他主要病原菌；本发明还提供了利用所述特异性引物对小麦不同组织所携带链格孢菌的分子检测方法，本分子检测方法操作简单方便，快速，灵敏度可达0.05ng/μL，检测成本较低，可用于检测小麦籽粒、根、茎、叶、穗各组织所携带的链格孢菌，具有显著的现实意义和经济价值。
文档编号C12Q1/68GK103088138SQ201310028328
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者牛吉山, 李巧云, 秦召 申请人:河南农业大学