专利名称：人白细胞介素29成熟肽第35位精氨酸定点突变为赖氨酸的变异体及其制备方法
技术领域：
本发明提供了一种人白细胞介素29成熟肽第35位精氨酸定点突变为赖氨酸的变异体(hIL-29G)及其制备方法，属于生物工程领域。
背景技术：
人白细胞介素29(interleukin29，IL-29)是近年发现的一种细胞因子，又称为干扰素入 I (interferon A I，IFN-入 I)，其与 IL-28A 和 IL-28B 同属 IFN- A 家族(IFN A s)。人IL-29通过与细胞膜上的受体复合物结合，起始信号的转导和发挥生物学作用。IL-29的受体是一种异二聚体型II类细胞因子受体，由IL-10受体P亚基(IL-1ORe也称IL-1OR2)和一种II类孤儿受体链(即IL-28Ra)组成，其中IL-1ORe也是IL-10和IL-22受体组成部分，IL-28Ra或IFN- A Rl则决定与IL-29结合的特异性，并且可能介导细胞内的信号传递。人IL-29与I型干扰素共享相同的Jak-STAT信号传导途径，激活相同的Jak-STAT (janus kinase-signal transducer of transcript ion)信号转导途径，促进一组共同的基因表达。IL-29首先与其受体结合，启动信号级联反应，经过多步磷酸化反应，激活STAT2,导致干扰素-激活基因因子3复合物(IFN-stimulated gene factor3complex,ISGF3)与干扰素激活反应元件(IFN-stimulated response element, ISRE)相互作用，从而调节基因的转录。因此，IL-29表现出一些与I型干扰素相同的性质，如抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤以及免疫调节等生物学活性。人IL-29主要在上皮细胞中进行表达，在人血液、大脑、肺、胰脏及睾丸中也有低水平的表达。不同起源的造 血和非造血细胞被各种病毒感染后，可诱导表达IL-29，目前已发现有麻疹病毒、腮腺炎病毒、心肌炎病毒、甲型流感病毒、仙台病毒、新城鸡瘟病毒、单链(+) RNA病毒、双链DNA病毒等可诱导感染细胞表达IL-29。IFN是发现最早、研究最多、第一个克隆化和用于临床治疗疾病的细胞因子。目前，IFN主要用于某些肿瘤和病毒性疾病的治疗，但对不同的肿瘤和病毒性疾病的疗效差异很大，且常出现一些不良反应。IL-29的功能与I型IFN有一定相似，而且能选择性地作用于不同类型的靶细胞，它们可作为I型(IFN-a、IFN-P)或II型(IFN-Y) IFN的替代品或辅助品用于某些疾病的治疗，在肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及变态反应性疾病等防治方面具有潜在的应用价值。分子识别是分子间专一性的结合过程，人们所熟悉的分子识别的三个模型包括抗体与抗原、配体与受体、酶与底物的结合。本发明中，以理论设计的IL-29变异体及野生型IL-29作为配体，采用计算机模拟与靶细胞表面的相应受体结合，预测变异体与受体间的非共价相互作用的结合自由能，根据结合自由能的正负来选择和确定定点突变位点。通过计算机模拟分析，发现IL-29成熟肽的35位精氨酸突变为赖氨酸时，该变异体与受体相结合的结合自由能低于野生型IL-29与受体相结合的结合自由能，由此选择对IL-29成熟肽的第35位氨基酸进行定点突变。
发明内容
本发明提供了一种人白细胞介素29成熟肽第35位精氨酸定点突变为赖氨酸的变异体(hIL-29G)及其制备方法。(I)本发明的第一方面，提供一种插入了 hIL-29成熟肽第35位精氨酸定点突变为赖氨酸的变异体编码基因的重组真核表达载体，将本发明所述的hIL-29变异体编码基因(SEQ ID No:1)与pPIC9KM(源于Invitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为:201110410391.0)重组获得所需载体，该重组真核表达载体为pPIC9KM-hIL-29G，如图1所示；该重组载体表达的产物是肽链中第35位精氨酸定点突变为赖氨酸的hIL-29变异体(SEQ IDNo:2);而且，本发明将pPIC9KM的a因子中的限制性内切酶Xho I识别位点CTCGAG与蛋白酶Kex2的识别位点GAGAAAAGA (编码产物为Glu-Lys-Arg)，通过PCR方法引入hIL-29变异体编码基因(SEQ ID No:1)的氨基端，使该重组真核表达载体表达的hIL_29变异体(SEQID No:2)的肽链不会因引入限制性内切酶位点而增加额外的氨基酸残基。(2)本发明的第二方面，提供一种表达人IL-29变异体的重组酵母工程菌GS115/hIL-29G。将本发明所述的重组真核表达载体pPIC9KM-hIL-29G转化到毕赤酵母GS115 (Invitrogen公 司)中可即可获得该工程菌，而且pPIC9KM中的信号肽基因序列与hIL-29变异体的编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可将hIL-29变异体分泌型表达至培养液中。(3)本发明的第三方面，提供一种制备hIL-29变异体肽的方法，该方法包括以下步骤:a)培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加1.5% (v/v)的甲醇作为诱导剂，诱导重组酵母工程菌分泌表达hIL-29变异体；b)离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处理；c)除盐后的培养上清用强阳离子交换层析柱分离纯化培养液中的hIL-29变异体，收集含有hIL-29变异体的洗脱液；d)用SDS-PAGE和Western blotting方法分析鉴定纯化的hIL-29变异体。
图1为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL_29G的构建图谱图2为hIL-29变异体编码基因的PCR扩增结果图3为克隆质粒pUCm-hIL_29G的双酶切鉴定结果图4为hIL-29变异体的SDS-PAGE检测结果
具体实施例方式以下结合具体实例，进一步阐述本发明所涉及到的操作方法，这些实例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下述实施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的测定均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；所用的培养基如无特别说明均按毕赤酵母表达手册(Invitrogen公司)的配方进行配制。实例一、人IL-29变异体编码基因的克隆1.设计和合成PCR引物根据GenBank中的人IL-29基因序列和pPIC9KM载体的因子信号肽序列以及本发明中发生突变的位点，用01igo7软件设计一对特异性引物及突变引物如下:上游引物:5’ -CTCGAGAAAAGAGGCCCTGTCCCCACTTCC-3 ’下游引物:5’-GCGGCCGCTCAGGTGGACTCAGGGTGG-3，；突变引物:5’-TCTTCCAATGCGTCCITGGCCTTCTTGA-3’在上游引物中加入了限制性内切酶Xho I识别位点(CTCGAG)和蛋白酶Kex2的识别位点(GAGAAAAGA，编码产物为Glu-Lys-Arg)，下游引物中加入了 Not I位点(GCGGCCGC)，为了获得突变产物，突变引物中第16位碱基设计为T，使该碱基组成的三联体密码由AGG突变为AAG，该三联体密码编码的第35位氨基酸由精氨酸(Arg)突变为赖氨酸(Lys)，扩增产物的大小约560bp。2.人IL-29变异体编码基因的克隆用RNA提取试剂Trizol(BBI公司)按说明书操作，从健康中国人外周血单个核细胞(PBMC)提取细胞总RNA ;取提取的总RNAl u L作为模板，用反转录试剂盒(TaKaRa公司)按说明书操作，经反转录扩增得到IL-29前体的cDNA ;反转录结束后，取反应液5 y L作为模板，先用上游引物与突变引物进行PCR扩增IL-29变异体的部分编码基因，反应条件如下:94°C 2min， 94°C 30s — 57°C 30s — 72°C 15s，30 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。扩增产物经I %琼脂糖凝胶电泳分析；用EZ-1O柱式DNA回收试剂(BBI公司)回收纯化约129bp的部分基因片段hIL-29FA;再将纯化的部分基因片段作为上游引物与上述下游引物进行PCR扩增，反应条件如下:94V 2min，94°C 30s — 45°C 30s — 72°C lmin，2个循环，94°C 30s — 55°C 30s — 72°C lmin，28个循环，最后72°C延伸lOmin。最后将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示；将纯化的目的基因片段与克隆载体pUCm-T (BBI公司)相连，构建为重组质粒并命名为pUCm-29G ;制备大肠杆菌JM109感受态，将重组质粒pUCm-29G转化感受态大肠杆菌JM109，然后接种于含IPTG和X_gaL的氨苄青霉素LB培养板，37°C培养16h，挑取阳性菌落接种至液体LB培养基进行扩增，提取重组质粒进行测序，测序结果如SEQ ID No:1所示。测序结果经DNAMAN软件分析并与GenBank中的人IL-29的cDNA序列进行比对，结果显示重组质粒pUCm-29G中目的基因的第104位碱基经人工定点突变后，由G突变为A，该碱基组成的三联体密码由AGG突变为AAG，该三联体密码编码的第35位氨基酸由精氨酸(Arg)突变为赖氨酸(Lys)，结果与定点突变设计相符，如SEQ IDNo:2所示。实例二、构建含hIL-29变异体编码基因的重组真核表达载体提取pUCm_29G和载体pPIC9KM(源于Invitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为:201110410391.0)的质粒，各取20 ii L质粒分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，回收约560bp的目的基因片段和载体pPIC9KM的大片段，用T4DNA连接酶(BBI公司)于16°C水浴连接20h，将连接产物转化至感受态大肠杆菌JM109中，然后接种于含卡那霉素的LB培养板，37°C过夜培养，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组真核表达质粒并命名为pPIC9KM-hIL-29G;用Xho I和Not I双酶切鉴定重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL-29G，同时进行测序鉴定，测序结果证实pPIC9KM-hIL-29G中的hIL_29变异体的编码基因序列与pUCm-29G中的完全一致。实例三、重组真核表达质粒转化酵母GS115及其高拷贝重组工程菌的筛选提取经测序鉴定的pPIC9KM-hIL_29G质粒，取20ii L用限制性内切酶Sal I酶切使之线性化，经0.7%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化，回收线性化的pPIC9KM-hIL-29G ;混合线性化的pPIC9KM-hIL-29G与酵母GSl 15感受态细胞，按照毕赤酵母表达手册(Invitrogen公司)的方法进行电转化。将转化产物涂布于不含His的MD培养板，30°C培养2 3天，挑选MD平板上生长旺盛的优势菌落接种于含0.5mg/mL G418的YPD平板，30°C培养2 3天，挑选生长旺盛的优势菌落接种于含lmg/mL G418的YPD平板，30°C培养2 3天，如此重复培养并依次增加G418浓度至4mg/mL，从含4mg/mL G418的YPD平板筛选得到高拷贝整合的毕赤酵母重组工程菌 GS115/hIL-29G。实例四、人IL-29变异体的诱导表达、纯化及分析将从含4mg/mL G418的YPD平板筛选得到的高拷贝整合的毕赤酵母重组工程菌GS115/hIL-29G接种至事先配好的BMGY培养基中，于30°C、220rpm/min条件下振荡培养24h ;将培养液室温3000g离心5min收集细胞，用25mL BMMY重悬细胞，于30°C、220rpm/min继续培养；在转换培养基后，每隔24h向培养液中添加1.5 %的甲醇进行诱导表达，连续培养96h。离心收集培养上清，取20 ii L上清进行SDS-PAGE，检测培养上清中hIL_29变异体的表达情况。接着用羊抗人IL-29多克隆抗体(R&D公司)进行Western blotting,鉴定表达的hIL-29变异体。然后将培养上清先用超滤膜浓缩(截流分子量为IOkDa)，再用SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化，纯化产物再经SDS-PAGE检测和Westernblotting鉴定。SDS- PAGE结果显示重组hIL_29变异体的分子量为23kDa左右，如图4所
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权利要求
1.一种人白细胞介素29(hIL-29)成熟肽变异体的重组真核表达载体，其特征在于，所述的重组真核表达载体中插入了人工定点突变的人白细胞介素29变异体的编码基因。
2.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的hIL-29变异体的编码基因，其DNA的核苷酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO:1，该序列第104位碱基G (鸟嘌呤)经人工定点突变为A (腺嘌呤)，由该碱基组成的三联体密码AGG突变为AAG。
3.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的hIL-29突变体编码基因的编码产物，其氨基酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO:2，该序列中第35位氨基酸残基由精氨酸(Arg)突变为赖氨酸(Lys)。
4.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的重组毕赤酵母的染色体中整合有权利要求I所述的人工定点突变的hIL-29突变体的编码基因，并且分泌表达hIL-29突变体至培养液中。
5.一种制备人白细胞介素29突变体的方法，其特征在于，包括步骤: (1)用适当的培养液，培养权利要求4所述的重组毕赤酵母工程菌； (2)在培养液中添加适当的 诱导剂，诱导重组毕赤酵母工程菌分泌表达重组白细胞介素29突变体； (3)从培养液中分离纯化出重组毕赤酵母分泌表达的hIL-29突变体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(I)所用的培养液为BMGY培养液和BMMY培养液；步骤(2)所用的诱导剂为甲醇，添加甲醇的终浓度为培养液体积的1.5% ;步骤(3)所用的分离纯化hIL-29突变体的方法为用强阳离子型SP离子交换层析分离培养液中的hIL-29突变体。
全文摘要
本发明提供了一种人白细胞介素29成熟肽第35位精氨酸定点突变为赖氨酸的变异体(hIL-29G)及其制备方法，属于生物工程领域。本发明的具体制备方法包括以下步骤1)人工设计合成hIL-29成熟肽的上下游引物和定点突变引物；2)用上下游引物从hIL-29的cDNA扩增hIL-29成熟肽编码基因，再用突变引物对第104位碱基进行定点突变；3)构建含hIL-29变异体编码基因的重组真核表达载体，转化毕赤酵母，获得重组酵母工程菌；4)培养重组酵母工程菌，于培养液添加1.5％(v/v)甲醇诱导其表达hIL-29变异体；5)采用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析从培养液上清纯化hIL-29变异体。本发明构建的酵母工程菌可进行高密度培养并分泌表达第35位精氨酸突变为赖氨酸的hIL-29突变体，适用于工业化制备人白细胞介素29成熟肽突变体。
文档编号C12N1/19GK103224951SQ20131002821
公开日2013年7月31日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者陈伟, 葛春蕾, 郑海军, 陆源, 朱荣, 邬敏辰, 吴静 申请人:江南大学