角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物的制作方法

专利名称：角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和 所用引物。
背景技术：
角毛壳菌几丁质酶基因(命名为c/z/5S)的基因序列如SEQ ID NO: l所 示，其编码的氨基酸序列(角毛壳菌几丁质酶)如SEQ ID NO: 3所示。
巴斯德毕赤酵母(/^/2^/7^to;^)表达系统是20世纪90年代发展起来的 优秀的真核表达系统，但是在巴斯德毕赤酵母中获得高效表达的外源基因往往 都是酵母偏爱密码子所编码的基因；所以角毛壳菌几丁质酶基因(c/z"S)在 巴斯德毕赤酵母中不能高效表达。

发明内容
本发明的目的是为了解决角毛壳菌几丁质酶基因。W5S)在巴斯德毕赤 酵母中不能高效表达的问题，而提供的一种c/z/5S密码子偏爱性突变体基因及 其编码的氨基酸和基因的制备方法及所用引物。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因序列如SEQ ID NO: 2所示。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因按以下步骤 制备
一、 提取角毛壳菌总RNA:
二、 分离角毛壳菌几丁质酶基因采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶 基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、 克隆步骤二 PCR扩增产物回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T 克隆载体连接，再转化ECo/z'JM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、 挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR， PCR反 应条件为95'C预变性10min， 9fC变性30s、 5(TC退火30s、 72""C延伸90s、共
35个循环，72。C延伸10min;
五、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-A/5S为模板突变扩增待融合片段 A: PCR反应体系为50jiL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4jiL dNTP、 lpL浓度 为20pmol/L引物Pnl、 lpL浓度为20^imol/L引物Pn2、 0.25pL高信度扩增酶 Pj;ra6e^DNApolymerase、 l(iL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94。C变性30s、 56.8。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pnl 的 基 因 序 歹U 为 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物Pn2的基因 序歹U为5,-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG画3，；
六、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-c^'5S为模板突变扩增待融合片段 B: PCR反应体系为50jaL，由5fiL 10xpyrobest buffer、 4(iL dNTP、 lpL浓度 为20pmol/L引物Pn3、 lpL浓度为20fimol/L引物Pn4、 0.25pL高信度扩增酶 尸,o6ewDNApolymerase、 l)iL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94。C变性30s、 57.2。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pn3 的 基 因 序 列 为 5，-GCTCAAGJ04CTA^04GCGv404CTCAACAGCATC-3，； 下游引物Pn4的 基因序列为5，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3，；
七、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-c/z/5S为模板突变扩增待融合片段 C: PCR反应体系为50jiL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL浓度 为20pmol/L引物Pn5、 lpL浓度为20(imol/L引物Pn6、 0.25|iL高信度扩增酶 /^ra^^DNApolymerase、 lpL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94"C变性30s、 58.5匸退火30s、 72。C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pn5 的 基 因 序 列 为 5,-GGJ04AACAACATCAACCCCGAGJ04GTCAACC画3，； 下游引物Pn6的 基因序列为5'-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，；
八、 用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A、 B和C，然后进 行融合PCR:由5pL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 0.25pL高信度扩增酶 iVo&wDNApolymerase、 lpL浓度为10ng/pL的突变扩增待融合片段A、 lpL 浓度为10ng/nL的突变扩增待融合片段B、 l)iL浓度为10ng/pL的突变扩增待
融合片段C和余量的ddH20组成的体积为50|iL的融合PCR反应体系先进行 94。C变性30s、 60。C退火2min、 72。C延伸3min， 8个循环；然后加入l^iL浓 度为20|imol/L引物Pnl和lpL浓度为20(miol/L引物Pn6，再进行94。C变性 30s、 60。C退火30s、 72。C延伸5min， 20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳 菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
本发明用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物 Pnl的基因序列如SEQIDNO: 5所示，引物Pn2的基因序列如SEQ ID NO: 6所示，引物Pn3的基因序列如SEQIDNO: 7所示，引物Pn4的基因序列如 SEQIDNO: 8所示，引物Pn5的基因序列如SEQIDNO: 9所示，引物Pn6 的基因序列如SEQ ID NO: 10所示。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因与真核表达载体 pPIC9K连接构建重组表达载体，再经甲醇诱导后表达的蛋白质分子量为58 kD，等电点pl为4.47，经测序检测氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，证实 为角毛壳菌几丁质酶，说明本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体 基因是一个具有表达功能的基因。
其它条件均相同的情况下，与原角毛壳菌几丁质酶基因转化巴斯德毕赤酵 母相比本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因转化巴斯德毕 赤酵母获得的几丁质酶的酶活性提高了约3倍；说明本发明角毛壳菌几丁质酶 基因密码子偏爱性突变体基因可以在巴斯德毕赤酵母中高效表达。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法采用 具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在不需要内切酶消化和连接 酶处理的条件下实现DNA片段的拼接，能够高效、快速地实现基因的定点突 变，且不引入其它突变，保障了非突变区序列的正确性，所获得的角毛壳菌几 丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因片段可用于后续的分子克隆。
角毛壳菌几丁质酶完整的开放读码框基因序列如SEQIDNO: 4所示。本 发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法对角毛壳菌 几丁质酶基因5个位点进行突变，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第 868bp 870bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读 码框第874bp 876bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因
开放读码框第880bp 882bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质 酶基因开放读码框第1108bp 1110bp处序列CGC换成序列AGA，将原角毛壳 菌几丁质酶基因开放读码框第1168bp 1170bp处序列CGC换成序列AGA;角 毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体氨基酸序列与角毛壳菌几丁质酶氨 基酸序列相同、没有改变。
本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的制备方法步骤 八中引物之间都通过重叠搭桥进行扩增反应，因此在最初的8个循环反应中不 加引物，模板间自动退火搭桥形成长链，同时适当的延长了退火时间，提高了 反应的成功率。
本发明中突变引物的重叠区长，重叠区碱基均在27bp左右，提高了引物 与模板结合的特异性。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体 基因序列如SEQIDNO: 2所示。
具体实施方式
二本实施方式角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体
基因按以下步骤制备-
一、 提取角毛壳菌总RNA:
二、 分离角毛壳菌几丁质酶基因采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶 基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；
三、 克隆步骤二 PCR扩增产物回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T 克隆载体连接，再转化ECW/JM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；
四、 挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR， PCR反 应条件为95X:预变性10min， 94""C变性30s、 5(TC退火30s、 72'C延伸90s、共 35个循环，72。C延伸10min;
五、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-W/5S为模板突变扩增待融合片段 A: PCR反应体系为50pL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL浓度 为20(imol/L引物Pnl、 1^L浓度为20|amol/L引物Pn2、 0.25pL高信度扩增酶尸少ra&WDNA polymerase、 lpL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94。C变性30s、 56.8。C退火30s、 72"C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pnl 的 基 因 序 列 为
5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物Pn2的基因 序歹U为5 ，-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3 ，；
六、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-c/n'5S为模板突变扩增待融合片段 B: PCR反应体系为50pL，由5|iL 10xpyrobest buffer、 4jiL dNTP、 ljiL浓度 为20pmol/L引物Pn3、 1^iL浓度为20(xmol/L引物Pn4、 0.25pL高信度扩增酶 /Vo6eWDNApolymerase、 l(iL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94。C变性30s、 57.2X:退火30s、 72"延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pn3 的 基 因 序 列 为 5，-GCTCAAG」04CTA^a4GCG^04CTCAACAGCATC-3，； 下游引物Pn4的 基因序列为5，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC國3，；
七、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-A说为模板突变扩增待融合片段 C: PCR反应体系为50pL，由5jiL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL浓度 为20|imol/L引物Pn5、 l(iL浓度为20pmol/L引物Pn6、 0.25pL高信度扩增酶 /Vr Z^wDNA polymerase、 lfxL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94。C变性30s、 58.5。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pn5 的 基 因 序 歹U 为 5，-GG^04AACAACATCAACCCCGAG^04GTCAACC-3，； 下游引物Pn6的 基因序列为5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，；
八、 用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A、 B和C，然后进 行融合PCR:由5pL 10xpyrobest buffer、 4|iL dNTP、 0.25nL高信度扩增酶 iVo&WDNApolymemse、 l(iL浓度为10ng/pL的突变扩增待融合片段A、 lpL 浓度为10ngVL的突变扩增待融合片段B、 lpL浓度为10ng/VL的突变扩增待 融合片段C和余量的ddH20组成的体积为50pL的融合PCR反应体系先进行 9fC变性30s、 6(TC退火2min、 72。C延伸3min， 8个循环；然后加入lpL浓 度为20pmol/L引物Pnl和lpL浓度为20jxmol/L引物Pn6，再进行94。C变性 30s、 6(TC退火30s、 72X:延伸5min， 20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳
菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
本实施方式得到的角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因序列
如SEQIDNO: 2所示，本实施方式角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变 体基因的制备方法对角毛壳菌几丁质酶基因5个位点进行突变，将原角毛壳菌 几丁质酶基因开放读码框第868bp 870bp处序列CGC换成序列AGA，将原角 毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第874bp 876bp处序列CGC换成序列AGA， 将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第880bp 882bp处序列CGC换成序列 AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第1108bp 1110bp处序列CGC 换成序列AGA，将原角毛壳菌几丁质酶基因开放读码框第1168bp 1170bp处 序列CGC换成序列AGA;角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体氨基酸 序列与角毛壳菌几丁质酶氨基酸序列相同、没有改变。
将本实施方式得到的角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因与 真核表达载体pPIC9K重组构建重组表达质粒pPIC9K-c/n'5&4，然后采用电转 化方法转化到真核表达宿主菌巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于 MD平板培养基在3(TC条件下培养2~3天，之后将MD平板培养基上生长的 转化菌落分别点种到MM和MD平板培养基的相应位置上在3(TC条件下培养 2~3天，并根据菌落在MM平板上的生长情况鉴定转化子的表型(在MM平 板培养基上生长正常的转化子是Mut+型转化子；而在MM平板培养基上生长 迟缓的转化子是Muf型转化子)；再选择Mut+型转化子进行诱导表达挑选 Mut+型转化子单菌落置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中在 28 30°C、 250~300 r/min的条件下培养至OD, = 2 6 (培养时间为16~18h)， 然后在室温、1500~3000g的条件下离心5min，收集菌体用BMMY重悬菌体 使OD6Q()=1.0;将BMMY重悬菌液用双层纱布或粗棉布封口放置于28~30°C、 250-300 r/min的环境中继续生长，每隔24h向培养基中添加浓度为100%的甲 醇至菌液中甲醇的终浓度为0.5 1.0%;连续诱导培养120h (几丁质酶活性最 高)、并在4"C、 8000 r/min条件下离心10min，得到的上清液为含有角毛壳菌 几丁质酶的粗酶液。
采用改良的Schales法测定角毛壳菌几丁质酶粗酶液的酶活性(将OD值 换算成氨基葡萄糖产量，以每小时分解胶体几丁质产生lpg氨基葡萄糖为一个 酶活力单位，标准曲线方程为Y=158.21X+1.5629，其中X为OD值，Y为 氨基葡萄糖量pg，直线相关系数112=0.9943),本实施方式角毛壳菌几丁质酶 粗酶液的酶活为118U/mL。经测定本实施方式得到的角毛壳菌几丁质酶分子量 为58kD，等电点pl为4.47;证明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体 基因片段可用于后续的分子克隆，并在巴斯德毕赤酵母中高效表达。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得， 若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使 用操作手册。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤二按以 下步骤实施
a、 将5pL角毛壳菌总RNA、 8pL RNase-free H20和2pL引物01igod18 T 混匀后置于70。C的环境中5min，然后放于冰上；
b、 将5pL 5xMLVBuffer、 L25(iL dNTPmix、 0.6pL铁调节蛋白(IRP)、 1jiL M-MLV反转录酶和2.5pL ddH20混合；
c、 将a步骤和b步骤得到反应体系混合，再置于42。C环境中反转录lh;
d、 反转录产物cDNA PCR扩增PCR反应体系为25pL，由2pL 10mM dNTP、 2pL 25mM MgCl2、 5U五x Taq DNA聚合酶、10pM上游引物Pnl、 10pM 下游引物Pn6、 2|iL步骤c反转录产物和余量的ddH20组成，PCR反应条件为 94°C预变性5min， 94。C变性20s、 57。C退火30s、 72'C延伸30s、 35个循环， 72。C延伸10min;
其中步骤 d 中上游引物 Pnl 的基因序列为 5，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3,: 下游引物Pn6的基因 序列为5,-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT國3，。 其它步骤 及参数与实施方式二相同。
本实施方式引物Pnl和Pn6中分别引入Ecoi I和A^oH酶切位点(加下划 线处为酶切位点)，两引物之间相距1506bp，扩增产物去除了几丁质酶信号肽 序列。
具体实施方式
四本实施方式用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱 性突变体基因的引物基因序列为 Pnl: 5，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT國3，， Pn2: 5 ，-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3 ，， Pn3: 5，-GCTCAAGJ04CTA^04GCG/4G4CTCAACAGCATC國3，， Pn4: 5 ，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3 ，， Pn5: 5 ， -GGJ 04 A AC AAC ATC AACCCCGAG^ 04GTC AACC-3 ，， Pn6: 5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3 ，。 本实施方式引物Pnl和Pn6中分别加入了I和I酶切位点(加 下划线部分)，引物Pn3和Pn5中斜体加粗部分为突变位点。
序列表
〈110〉哈尔滨工业大学
<120〉角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物
<160〉 10
〈210〉 1 <211> 2065 〈212〉 DNA
<213〉毛壳菌属(Chaetomium)
〈400> 1
ctgttUgtgtgccaccgttctgctctctgtgccagtctccaaccggcctgtccatcaag60
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cgataattaggttgtccgtggccag 2065
〈210> 2 〈211〉 1602 〈212〉 ■ 〈213>人工序列
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (l)... (1602)
〈220〉
<223〉角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
<400> 2
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gcg gcg Ala Ala_
sac gac Asn Asp
gat aga Asp Arg
aag ags Lys Arg 290 tct ate Ser Ile 305
gtc aac Val Asn
att cac Ile His
CAC GCC his ala
tgg卿 Trp Arg 370 tac ggt Tyr Gly 385
tgt gag Cys Glu
cag gac Gin Asp
tac Tyr
ggt Gly 275 eta Leu
gac Asp 260 ggc Gly
卿 Arg
acg ctg Thr Leu
etc gag Leu Glu
ggt Gly
CAC his 355
Asn
cgt Arg
ttc Phe
gtc Val 340 ACC thr
肪c Asn
age Ser
age Ser
gag Glu 245 ggt Gly
Arg Pro Thr Phe Ser 230
ttc ttc gag gcc Phe Phe Glu Ala
gtc Val
3gc gtc Ser Val
gcg aga Ala Arg
ccc Pro
CC3
Pro 325 tgg Trp
ttc Phe
tct Ser 405
3CC
Thr 390 ggc Gly
gat ate Asp Ile
gcg Ala 310
tat Tyr
gat Asp
AAC CTC asn leu
ate aac Ile Asn
gag Glu
etc Leu 295 teg Ser
gtg Val
teg Ser
ACC thr
ccc Pro 375 atg Met
gac Asp 280
Asn
tac Tyr
gac Asp
ElCg
Thr
GAG glu 360 gag Glu
aaa Lys
g3C
Asp 265 Ut Phe
ctg Leu 250 tgg Trp
gat Asp
age ate Ser Ile
tgg tat Trp Tyr
ggt aac Gly Asn
ttt Phe
gtc Val 345 ATC ile
卿 Arg
gac Asp
ggt Gly
ttc Phe 330 caa Gin
GAG glu
gtc Val
ccc Pro
ggc Gly 410
Asn 235 gtc Val
gsa_ Glu
aac Asn
ggc Gly
ctg Leu 315
Asn
sgc Ser
GAG glu
sac Asn
tct Ser 395 age Ser
Leu Ala Lys Asp Glu 240
act ttc atg atg gcc 768 Thr Phe Met Met Ala 255
tat Tyr
tac Tyr
gtg Val 300 aaa Lys
gtc Val
ctg Leu
GCA
al3
ctg Leu 380 tgc Cys
tgc Cys
ccc Pro
gtc Val 285 ccg Pro
ggg Gly
atg Met
ggg Gly
CTG leu 365 ggc Gly
artg Met
acg Thr
gtc Val 270
Asn
卿 Lys
ttt Phe
acg Thr
ccc Pro 350 AAG lys
ctg Leu
gcc Ala
ggt Gly
gcc Ala
ctg Leu
ggc Gly
gac Asp
tat Tyr 335 tat Tyr
gac 816 Asp
etc 864 Leu
ctg 912 Leu
att 960
Ile
320
gat 1008 Asp
gcc 1056 Ala
CTG CTT 1104
leu leu
ggt ttc 1152 Gly Phe
gcc Ala
Thr 415
ggc 1200
Gly
400
ccg 1248 Pro
gga gtc etc Gly Val Leu
acg gtg Thr Val
acc aac Thr Asn 450 gtc aac Val Asn 465
ate gac lie Asp
3CC
Thr 435 cag Gin
tac Tyr
etc Leu
egg ccc acc Arg Pro Thr
Uc gga Phe Gly
gat tea Asp Ser 530
tec Ser 515 ggs Gly
tea Ser 420 acg Thr
gcc Ala
gac Asp
tgg gtc Trp Vsl
gcc aac Ala Asn
gac Asp
tac Tyr 500 gcg Ala
gac Asp 485 aat Asn
ttt Phe
age agt Ser Ser
cac gag ate His Glu lie
gas Glu
tea Ser
gag Glu 470 ggc Gly
gtg Val
tgg Trp 455 cgc Arg
acc Thr
gcc Ala 440 gac Asp
tgc Cys
eta Leu
tac ttg acg Tyr Leu Thr
gac Asp
gac Asp
tgg Trp 520
taa 1602
gtc Val 425 gcc Ala
Gin
gtg Val
ate lie
gac Asp 505 teg Ser
Lys 490 etc Leu
卿 Arg
￡ltC 3tC 33t
lie lie Asn
age acc Ser Thr
ctg ggc Leu Gly
gag Glu
朋g Lys
ggt Gly 475 tea Ser
att lie
scg Thr 460 gtc Val
ctt Leu
gtc Val 445 ctg Leu
atg Met
gcc Ala
ccc tgg atg Pro Trp Met
ctg Leu
aat Asn
gac Asp 525
Asn 430
3CC
Thr
ggc Gly
tgg Trp
gcg Ala
gac Asp
1296
1344
gcc atg aag Ala Met Lys
1392
gtc Val
gac Asp
acg Thr 510
tec Ser
tgg Trp
acg Thr 495 ggt Gly
gac Asp
gcc Ala 480 gga Gly
tgt Cys
ate lie
1440
1488
1536
1584
〈210〉 3 〈211〉 533 〈212〉 PRT
<213〉毛壳菌属(Chaetomium) 〈400〉 3
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val 15 10 15
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gin Ala Arg Gin Ser 20 25 30
Thr Arg Gin Lys Leu 35
lie Pro Cys
Lys Asp
50 Thr Gly 65
Cys Thr
Val
Ser
Gly Ser
Met Gin Trp Ser 100 Phe
lie
Cys
85
Asn
Cys
Asp Phe Gly 115
Val Ser Val Pro Gin 130
Thr Val Gly Tyr Tyr 145
Met Lys Pro Ser
Trp
Lys
Cys
70
Asp
Ala
Gly
Cys
Glu 150 lie
Thr
lie
55
Gly
Tyr
Ser
Thr
Arg
40
Gly
Leu
Asp Cys Gly
Asp Cys Pro
Ser Asp Pro 45 Leu
Gly
Thr 75 Cys
Lys Asp Gly
Asp Pro Gly
Pro 60 Phe
Cys
Lys Ser Glu 90
Pro Leu Asn Val
Thr
Cys 105
Asp Glu Phe Cys
Thr 120
Pro Ala Ala Asn
Asp 135
Gly Trp Asn Trp
Lys 125 Ser
Cys 110 Gly
His
Ser 140
Arg Pro Cys
Gin 165
Leu Asp Pro Thr
Gin 155
Tyr Ser His lie
Ala Phe Ser Leu 180
Gly Thr Leu Tyr
Pro Leu Gly Tyr 170
Phe Arg Leu Ser
Thr Glu Thr 195
Gly Val Gin Val
Thr 185
Asp Val Ser Ala
Cys Thr
Lys Asp
Asp Gly
80 Trp Gly 95
Cys Ser
Lys Glu
Ala Arg
Gly Thr 160 Phe Phe 175
Met Asp
Gin Pro 210 Asp Pro 225
Ala Als Asn Asp Asp Arg
Gly 200
lie Ala lie Gly
Pro 190
Lys Asn Arg
Gly Pro Thr Gin Tyr
Trp 215
Pro Thr Phe Ser
lie 205
Trp Ala Met Asn
Asp
Arg 230
Phe Phe Glu Ala
Gly 220
Leu Ala Lys
Glu 245
Gly Val Asp lie
Asp 260
Gly Ser Val Glu
Leu 250 Trp
Asn 235
Val Thr Phe Met
Glu
Gly 275
Lys Arg Leu Arg Ala Arg Leu 290 295 Ser lie Thr Leu Pro Ala Ser
Asp 265
Phe Asp Asn
Asp 280 : Asn Ser lie Gly
Tyr Tyr
Pro
Val 285 Pro
Asp Glu 240 Met Ala 255
Ala Asp
Val 270
Asn Leu Leu
Lys
Val 300
Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe
Gly Leu Asp lie
305
Val Asn Leu Glu
310
Tyr Val Asp Phe
Pro 325
Trp Asp Ser Thr
315
Asn Val Met Thr
lie His Gly Val 340
Thr Asn Leu Thr
Phe 330
Gin Ser Leu Gly
His Ala His 355
Asn Asn lie Asn
Trp
Arg 370
Gly Arg Ser Phe
Tyr 385
Cys Glu Phe Ser
Gly Val Leu Ser 420 Thr
Thr 390 Gly
Pro 375 Met
Glu 360 Glu
Val 345
lie Glu Glu Ala
Pro 350 Lys
Tyr 335 Tyr
320 Asp
Ala
Leu Leu
Ser 405
Ala His Glu lie
Arg Val Asn Lys Asp Pro Gly Asn Gly
Thr Val
Thr 435 Gin
Trp
Asp Val
Val 425 Ala
Gly 410 Gin
Thr Asn 450
Asn Tyr Ala Asn
Val 465
lie Asp Leu Asp
Arg Pro Thr Tyr 500
Ser
Glu 470 Gly
Trp 455 Arg
Thr
Asp 485
Asn Tyr Leu Thr
Cys Leu Gly Leu
lie
Asp 505
Leu 365
Gly Leu Gly Phe
Ser 395 Ser
Leu 380
Cys Met Ala Ala
Glu Val Ala 440
Asp Ser Thr Lys
Cys Thr Gly lie lie Asn Val Glu lie
Val 445 Leu
Asn 430 Thr
Thr 415 Gly
Trp
Gly 400 Pro
Ala
Asp
Ala Met Lys
Thr 460
Val Met Val Trp
Gly 475
Ser Leu Ala Asp
Lys 490
Leu Pro Trp
Met Thr 510
Thr 495 Gly
Ala 480 Gly
Cys
he Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp lie
515 520 525
Asp Ser Gly Ser Ser 530
〈210〉 4 〈211〉 1602 <212> DNA
〈213〉毛壳菌属(Chaetomium)<220〉 〈221〉 CDS <222> (1).
(1602)
〈400〉 4 atg aag Met Lys 1
gcc gcg Ala Ala
3Cg agg Thr Arg
aag gat Lys Asp
50 act ggt Thr Gly 65
tgc acc Cys Thr
atg cag Met Gin
gac ttt Asp Phe
gtg tcg Val Ser 130 acc gtc Thr Val 145
acg tct Thr Ser
tec Ser
caB
Gin
35
att
lie
gtc Val
tcg Ser
tgg Trp
ggt Gly 115 gtc Val
3gC
Ser 20
卿 Lys
ccg Pro
ggc Gly
tcg Ser
tec Ser 訓 ttc Phe
ccg Pro
ctg Leu 5
tat Tyr
age Ser
gag Glu
etc tgg Leu Trp
tgc犯g Cys Lys'
ate lie
tgc
Cys
85
aac
Asn
tgc
Cys
70
gac
Asp
gca Ala
tgc ggc Cys Gly
ggc tac Gly Tyr
cag Gin
tat Tyr
tgc Cys
gag Glu 150
tgc Cys
tct Ser
acg Thr
ate
lie
55
ggc
Gly
tac Tyr
tcg Ser
acg Thr
gac Asp 135 ggc Gly
gtc Val
agt Ser
Arg 40
ggg Gly
ttg Leu
卿 Lys
acg Thr
Thr 120 ccg Pro
tgg Trp
ttg Leu
ttc
Phe
25
gac
Asp
etc
Leu
10
etc
Leu
gac Asp
tgc tgt Cys Cys
gga cca Gly Pro
3gC g￡lg
Ser Glu 90
tgc Cys 105
gat gag Asp Glu
ccc Pro
gcc Ala
a8c Asn
tgg Trp
gtc Val
get Ala
Gin
tea gac Ser Asp
ggg Gly
3CC
Thr 75 tgc Cys
cca
Pro
60
Uc
Phe
gac Asp
gcc Ala
tgg Trp
Asn
cag Gin 155
age Ser 140 cgc Arg
ggg Gly
gcc Ala
ccg
Pro
45
tta
Leu
ctg Leu
cgc
Arg
30
卿
Lys
gac Asp
tgc ggc Cys Gly
ccg ggc Pro Gly
etc aac Leu Asn
ttc tgc Phe Cys
gtg Val
犯g Lys 125 tcg Ser
ccc Pro
tgc Cys 110 ggc Gly
cac His
tgc Cys
gcc
Ala
15
cag
Gin
tgc Cys
aaa Lys
gac Asp
tgg
Trp
95
tgc
Cys
gtg 48 Val
age 96 Ser
acc 144 Thr
gac 192 Asp
ggg 240
Gly
80
ggc 288 Gly
agt 336 Ser
aag gag 384 Lys Glu
gcg cgc 432 Ala Arg
ggc Gly
acc 480
Thr
160atg aag ccg tcg Met Lys Pro Ser
gcc ttc Ala Phe
acc gag Thr Glu
cag ccg Gin Pro 210 g3C ccc Asp Pro 225
gcg gcg Ala Ala
朋c gac Asn Asp
gat 3g3 Asp Arg
aag cgc Lys Arg 290 tct ate Ser lie 305
gtc aac Val Asn
tcg Ser
Thr 195 ggc Gly
ttg Leu 180 ggt Gly
gtg Val
tac Tyr.
ggt Gly 275 eta Leu
C3g
Gin 165 etc Leu
ate lie
Asp
ccg etc ggt Pro Leu Gly
acc ctg Thr Leu
caa gtc Gin Val
ggt ccg Gly Pro
cag gac Gin Asp
gac Asp 260 ggc Gly
cgc Arg
act Thr
gag Glu 245 ggt Gly
egg Arg 230 ttc Phe
gtc Val
age gtc Ser Val
gcg cgc Als Arg
acg ctg Thr Leu
etc gag Leu Glu
att cac ggt gtc lie His Gly Val
ccc Pro
Pro 325 tgg Trp
ccc Pro
tac Tyr
tgg Trp 215 ccg Pro
3CC
Thr
ggt Gly 200 ate lie
acg Thr
3CC
Thr 185 gac Asp
gcc Ala
ttt Phe
gcg Ala 310 tat Tyr
gat Asp
gat Asp
gsg Glu
etc Leu 295 tcg Ser
ate lie
gac Asp 280
Asn
tac Tyr
tat Tyr 170 ttc Phe
tac Tyr
egg Arg
gtc tcg Val Ser
ate ggc lie Gly
ttc gag gcc Phe Glu Ala
gate Asp 265 ttt Phe
age Ser
tgg Trp
tea Ser
ctg Leu 250 tgg Trp
朋c Asn 235 gtc Val
g朋 Glu
gtg gac Ut Val Asp Phe
tcg acg gtc Ser Thr Val
tat Tyr
ttc Phe 330 caa Gin
ctg Leu 315 aat Asn
age Ser
agt Ser
ctg Leu
get Ala
ggc Gly 220 ctg Leu
cac His
tcg Ser
ate lie 205 tgg Trp
gcc Ala
gat aac Asp Asn
ate ggc lie Gly
tac Tyr
gtg Val 300 aaa Lys
gtc Val 285 ccg Pro
ggg Gly
att lie
ccc Pro 190
Lys
Uc Phe 175 stg Met
aac Asn
ttc 528 Phe
gat 576 Asp
cgc 624 Arg
gcg atg aat 672 Ala Met Asn
act ttc Thr Phe
tat ccc Tyr Pro
aag Lys
atg Met
gtc Val 270
Asn
gac Asp
stg Met 255 gcc Ala
ctg Leu
gag 720
Glu
240
gcc 768 Ala
gac 816 Asp
etc 864 Leu
aag ggc ctg 912 Lys Gly Leu
gtc atg Val Met
ctg ggg Leu Gly
ttt Phe
acg Thr
ccc Pro
gac Asp
tat Tyr 335 tat Tyr
att 960
lie
320
gat 1008 Asp
gcc 1056 Ala C3C gcc His Als
tgg cgc Trp Arg 370 tac ggt Tyr Gly 385
tgt gag Cys Glu
gga gtc Gly Val
acg gtg Thr Val
acc aac Thr Asn 450 gtc aac Val Asn 465
ate gac lie Asp
egg ccc Arg Pro
cac His 355 aac Asn
340 acc Thr
Asn
aac Asn
ate lie
etc acc Leu Thr
cgt age ttc Arg Ser Phe
ttc Phe
etc Leu
3CC
Thr 435 cag Gin
age Ser
tea Ser 420 acg Thr
tgg Trp
tct Ser 405 gcc Ala
gac Asp
gtc Val
etc Leu
6LCC
Thr
ttc gga Phe Gly
gac Asp
tac Tyr 500 gcg Ala
Asn
3CC
Thr 390 ggc Gly
ccc Pro 375
atg Met
ggt Gly
cac gag His Glu
g肪gtg Glu Val
tac gcc aac Tyr Ala Asn
gac Asp 485
Asn
tea Ser
gag Glu 470 ggc Gly
tac Tyr
tgg Trp 455 cgc Arg
8CC
Thr
ttg Leu
g邓 Glu 360
gag Glu
aaa lys
aac Asn
ate lie
gcc Ala 440 gac Asp
tgc Cys
eta Leu
Thr
tec gcg ttt gac gac tgg
Ser Ala Phe Asp Asp Trp 515 520
gat tea gga age agt taa 1602
345 ate lie
cgc Arg
gac Asp
ggt Gly
gtc Val 425 gcc Ala
age Ser
ctg Leu
ate lie
g￡tc Asp 505 teg Ser
gag gag Glu Glu
gtc aac Val Asn
ccc Pro
ggc Gly 410
Gin
tct Ser 395 age Ser
atc' lie
gtg g3g Val Glu
axx aag Thr Lys
ggc Gly
肪g Lys 490 etc Leu
ggt Gly 475 tea Ser
ccc Pro
gca Ala
ctg Leu 380
tgc Cys
tgc Cys
a_tc lie
att lie
acg Thr 460 gtc Val
ctg Leu 365 ggc Gly
atg Met
acg Thr
犯t Asn
gtc Val 445 ctg Leu
Eltg
Met
350 犯g Lys
卿ctg Arg Leu
tgg Trp
Asn
ctg Leu
cU Leu
1104
ctg ggt ttc Leu Gly Phe
1152
gcc Ala
ggt Gly
犯c Asn 430 acc Thr
gcc Ala
EICC
Thr 415 ggc Gly
tgg Trp
ggc Gly 400 ccg Pro
gcg Ala
gac Asp
1200
1248
1296
1344
gcc atg aag Ala Met Lys
1392
ctt gcc Leu Ala
atg Met
gac Asp 525
gtc Val
gac Asp
acg Thr 510 tec Ser
tgg Trp
acg Thr 495 ggt Gly
gac Asp
gcc Ala 480 gga Gly
tgt Cys
■ate lie
1440
1488
1536
1584
Asp Ser Gly Ser Ser 530
〈210> 5 〈211〉 30 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220>
<223〉用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pnl。 <400〉 5
gaccggaatt cagcacgagg caaaagctct 30
<210〉 6 〈211> 36 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈220〉
<223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn2。 〈400> 6
ttgagtctcg ctcttagtct cttgagcagg ttgacg 36
〈210〉 7
〈211〉 34
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
<220>
〈223>用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn3。 <400> 7
gctcaagaga ctaagagcga gactcaacag catc 34
〈210> 8 <211> 36 〈212〉 ■ <213>人工序列
〈220〉
〈223〉用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn4。 〈400〉 8
actctctcgg ggttgatgtt gtttctccaa agcagc 36
<210> 9 〈211〉 33 <212>纖 〈213>人工序列
〈220〉
<223〉用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn5。 〈400〉 9
ggagaaac犯catcaacccc gagagagtca acc 33
<210〉 10 <211> 34 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物Pn6。 〈400〉 10
ccagcggccg cttaactgct tcctgaatcg atgt 3权利要求
1、角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因，其特征在于角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因序列如下所示ATGAAGACGTCTCTGAGCTGCGTCTTGCTCTGGGCTGGGCTGGCCGTGGCCGCGTCCAGCTATGAGTCTAGTTTCCTCGTCCAAGCCCGCCAGAGCACGAGGCAAAAGCTCTGGACGCGAGACGACTCAGACCCGAAGTGCACCAAGGATATTCCGTGCAAGATCGGGTGCTGTGGGCCATTAGACAAAGACACTGGTGTCGGCATCTGCGGCTTGGGACCAACCTTCTGCGGCGACGGGTGCACCTCGTCGTGCGACTACAAGAGCGAGTGCGACCCGGGCTGGGGCATGCAGTGGTCCAACGCATCGACGTGCCCCCTCAACGTGTGCTGCAGTGACTTTGGTTTCTGCGGCACGACCGATGAGTTCTGCAAGGGCAAGGAGGTGTCGGTCCCGCAGTGCGACCCGGCCGCCAACAGCTCGCACGCGCGCACCGTCGGCTACTATGAGGGCTGGAACTGGCAGCGCCCCTGCGGCACCATGAAGCCGTCGCAGATCCCGCTCGGTTATTACAGTCACATTTTCTTCGCCTTCTCGTTGCTCGACCCCACCACCTTCCGGCTGTCGCCCATGGATACCGAGACAGGTACCCTGTACGGTGACGTCTCGGCTATCAAGAACCGCCAGCCGGGCGTGCAAGTCTGGATCGCCATCGGCGGCTGGGCGATGAATGACCCCGGTCCGACTCGGCCGACGTTTTCAAACCTGGCCAAGGACGAGGCGGCGCAGGACGAGTTCTTCGAGGCCCTGGTCACTTTCATGATGGCCAACGACTACGACGGTGTCGATATCGACTGGGAATATCCCGTCGCCGACGATAGAGGTGGCAGCGTCGAGGACTTTGATAACTACGTCAACCTGCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATCGGCGTGCCGAAGGGCCTGTCTATCACGCTGCCCGCGTCGTACTGGTATCTGAAAGGGTTTGACATTGTCAACCTCGAGCCATATGTGGACTTTTTCAATGTCATGACGTATGATATTCACGGTGTCTGGGATTCGACGGTCCAAAGCCTGGGGCCCTATGCCCACGCCCACACCAACCTCACCGAGATCGAGGAGGCACTGAAGCTGCTTTGGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACCTGGGCCTGGGTTTCTACGGTCGTAGCTTCACCATGAAAGACCCCTCTTGCATGGCCGCCGGCTGTGAGTTCAGCTCTGGCGGTAACGGTGGCAGCTGCACGGGTACCCCGGGAGTCCTCTCAGCCCACGAGATCGTCCAAATCATCAATAACGGCGCGACGGTGACCACGGACGAAGTGGCCGCCGTGGAGATTGTCACCTGGGACACCAACCAGTGGGTCTCATGGGACAGCACCAAGACGCTGGCCATGAAGGTCAACTACGCCAACGAGCGCTGCCTGGGCGGTGTCATGGTCTGGGCCATCGACCTCGACGACGGCACCCTAATCAAGTCACTTGCCGACACGGGACGGCCCACCTACAATTACTTGACGGACCTCCCCTGGATGACGGGTTGTTTCGGATCCGCGTTTGACGACTGGTCGAGACTGAATGACTCCGACATCGATTCAGGAAGCAGTTAA。
2、角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因的制备方法，其 特征在于角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因按以下步骤制 备一、 提取角毛壳菌总RNA:二、 分离角毛壳菌几丁质酶基因采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶 基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；三、 克隆步骤二 PCR扩增产物回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T 克隆载体连接，再转化五.Cb/z'JM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；四、 挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR, PCR反 应条件为95"C预变性10min， 94"变性30s、 5(TC退火30s、 72。C延伸90s、共 35个循环，72。C延伸10min;五、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-c/z/5S为模板突变扩增待融合片段 A: PCR反应体系为50nL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4jxL dNTP、 lpL浓度 为20pmol/L引物Pnl、 lpL浓度为20p"nol/L引物Pn2、 0.25卩iL高信度扩增酶 /Vo6e"DNApolymerase、 lpL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94。C变性30s、 56.8。C退火30s、 72'C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pnl 的 基 因 序 列 为 5，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT國3，； 下游弓l物Pn2的基因 序歹lj为5,誦TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3，；六、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-c/n'5S为模板突变扩增待融合片段 B: PCR反应体系为50pL，由5jxL lOxpyrobest buffer、 4fiL dNTP、 lpL浓度 为20pmol/L引物Pn3、 l|iL浓度为20^mol/L引物Pn4、 0.25高信度扩增酶尸少ra&WDNA polymerase、 lpL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94。C变性30s、 57.2。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pn3 的 基 因 序 列 为5，-GCTCAAG^04CTA^a4GCGJ04CTCAACAGCATC-3，； 下游引物Pn4的 基因序歹ij为5 ，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3 ，；七、 以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-c/z/5S为模板突变扩增待融合片段 C: PCR反应体系为50jiL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL浓度 为20pmol/L引物Pn5、 1jiL浓度为20pmol/L引物Pn6、 0.25pL高信度扩增酶 尸,o&WDNApolymerase、 l)iL突变扩增模板和余量的ddH20组成；PCR反应 条件为94i:变性30s、 58.5。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25个循环；其中上 游 引 物 Pn5 的 基 因 序 列 为 5，-GG^04AACAACATCAACCCCGAGJ04GTCAACC画3，； 下游引物Pn6的 基因序歹U为5'-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，；八、 用琼脂糖凝胶电泳纯化回收突变扩增待融合片段A、 B和C，然后进 行融合PCR:由5|止10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 (X25(iL高信度扩增酶 尸,o6e^DNApolymerase、 lpL浓度为10ng/pL的突变扩增待融合片段A、 lpL 浓度为10ng/|iL的突变扩增待融合片段B、 lpL浓度为10ng/^iL的突变扩增待 融合片段C和余量的ddH20组成的体积为50pL的融合PCR反应体系先进行 94'C变性30s、 6(TC退火2min、 72"C延伸3min， 8个循环；然后加入l^L浓 度为20(imol/L引物Pnl和l(iL浓度为20nmol/L引物Pn6，再进行94。C变性 30s、 6(TC退火30s、 72。C延伸5min， 20个循环；纯化、回收，即得到角毛壳 菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因。
3、根据权利要求2所述的角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基 因的制备方法，其特征在于步骤二按以下步骤实施a、 将5pL角毛壳菌总RNA、 8|iL RNase-free H20和2|iL引物01igod18T 混匀后置于7(TC的环境中5min，然后放于冰上；b、 将5|jL 5xMLV Buffer、 1.25&L dNTPmix、 0.6fxL铁调节蛋白、lpL M-MLV反转录酶和2.5pL ddH20混合；c、 将a步骤和b步骤得到反应体系混合，再置于42'C环境中反转录lh;d、反转录产物cDNA PCR扩增PCR反应体系为25pL，由2|iiL 10mM dNTP、 2jiL 25mM MgCl2、 5U ￡x Taq DNA聚合酶、10pM上游引物Pnl 、 10pM 下游引物Pn6、 2pL步骤c反转录产物和余量的ddH20组成，PCR反应条件为 94°C预变性5min， 94。C变性20s、 57。C退火30s、 72。C延伸30s、 35个循环， 72。C延伸10min;其中步骤 d 中上游引物 Pnl 的基因序列为 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物Pn6的基因 序歹U为5,-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3,。
4、用于制备角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因的引物，其 特征在于引物的基因序列为Pn 1: 5 ，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3'， Pn2: 5 ，-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG画3'， Pn3: 5，國GCTCAAGJG^CTA^04GCGJ04CTCAACAGCATC-3，， Pn4: 5 ，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3 ，， Pn5: 5，-GGJ04AACAACATCAACCCCGAG^04GTCAACC-3 ，， Pn6: 5 ,-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3'。
全文摘要
角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物，它涉及一种几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物。本发明解决了chi58在巴斯德毕赤酵母中不能高效表达的问题。本发明密码子偏爱性突变体基因序列如SEQ ID NO2所示。本发明引物Pn1～Pn6的基因序列分别如SEQ ID NO5、6、7、8、9和10所示。本发明通过融合PCR法获得密码子偏爱性突变体基因。本发明基因与真核表达载体pPIC9K连接构建重组表达载体，再经甲醇诱导后表达的蛋白质分子量为58kD，等电点pI为4.47，经测序检测氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，证实为角毛壳菌几丁质酶，且几丁质酶的酶活性提高了约3倍。
文档编号C12N15/11GK101348796SQ20081013711
公开日2009年1月21日 申请日期2008年9月12日 优先权日2008年9月12日
发明者谦 杨, 王艳君 申请人:哈尔滨工业大学