专利名称：一组环状糊精葡糖基转移酶及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组环状糊精葡糖基转移酶及其编码基因和应用。
背景技术：
环状糊精的英文为cyclodextrin，简称⑶。环糊精是环糊精转葡萄糖基酶(CGTase)作用于淀粉的产物，是六个以上葡萄糖以α — 1，4一糖苷键连结的环状寡聚糖，其中最常见、研究最多的是<1-环糊精((1-^)、0-环糊精(0_00)、Y _环糊精(Y -⑶)，分别由六个、七个和八个葡萄糖分子构成，是相对大和相对柔性的分·子。α -环状糊精为淀粉深加工的一类高值化产品，由六个葡萄糖基通过α _1，4葡萄糖苷键连接而成的环状低聚糖。在结构上，α-⑶的立体结构呈圆筒形(一端大，一端小)，具有“外亲水，内疏水”的特殊性及无毒的优良性能，可与多种客体化合物采用适当方法进行包结，从而改变被包结物质的溶解度、挥发性及化学反应性能等理化性质，提供一些非常有用的功能。α -⑶是一种有潜力的食品添加剂，特别是可以作为目前已经生产的β -环状糊精(β_⑶)的替代产品。β_⑶已有大规模生产，但在使用过程中发现它有脏器沉积的风险，以及包接效率低下的问题。概括起来，α -CD在食品工业有如下应用前景(I)将水不溶性或溶解度低的化合物制成水溶解度高的包封化合物；(2)使包封的化合物具有良好的稳定性(如保色、保香，耐热、耐酸、耐水解、抗氧化、防挥发等)；(3)屏蔽作用(掩盖食品中不愉快气味和苦味)；(4)除去食品中不需要的成分(如咖啡因、胆固醇等)；(5)具有乳化、发泡作用，可作乳化剂和发泡剂；(6)使液体状、油状、挥发性物料固化。目前，α-⑶开发和应用的最大障碍是缺乏具有高α _环糊精转化活力的酶制剂，使得该产品的成本和价格高出β -CD的三倍，限制了其大规模应用。α -⑶的生成,主要是以淀粉为原料,经过环状糊精葡糖基转移酶(cyclodextringlucano-transferase简称CGTases)的糖基转化作用而来。CGTases的专一性较低，在大多数情况下同时产生Y-⑶三种产物。采用不同的CGTases产生的三种产物比例不同，现有的CGTases的主要转化产物是β _⑶，同时也产生一定量的α-和Υ-⑶。现有的研究方向主要是两个方面其一是从自然资源中寻求催化效果更好或专一性更高的酶；其二是对现有的酶蛋白进行定向改造从而获得催化效果更好或专一性更高的酶。
发明内容
本发明的目的是提供一组环状糊精葡糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明提供的环状糊精葡糖基转移酶，来自软腐芽孢杆菌(Bacillus macerans),是将序列表的序列I所示蛋白质进行如下(a)和(b)两个突变得到的蛋白质(a)将序列表的序列I自N末端第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸；(b)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基进行突变。
所述(b)中所述突变为如下(I)至(17)中的任意一种(I)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为三个连续的组氨酸；(2)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为两个连续的组氨酸；(3)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为组氨酸；(4)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基(酪氨酸)缺失；(5)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为脯氨酸；(6)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为甘氨酸； (7)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为苏氨酸；(8)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为谷氨酸；(9)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为天冬酰胺；(10)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为丝氨酸；(11)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸；(12)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为缬氨酸；(13)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为半胱氨酸；(14)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为精氨酸；(15)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为亮氨酸；(16)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为赖氨酸；(17)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为色氨酸。上述突变如无特殊说明，均为单个氨基酸残基。编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为将序列表的序列2所示蛋白质进行如下(C)和(d)两个突变得到的DNA分子(c)将序列表的序列2自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ；(d)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸进行突变。所述(d)中的所述突变为如下如下(I)至(17)中的任意一种(I)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CACCACCAC ；(2)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CACCAC ；(3)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CAC ；(4)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸(TAC)缺失；(5)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CCA ；(6)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为GGT ；(7)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为ACA ；(8)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为GAG ；(9)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为AAT ；(10)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TCA ；(11)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TTT ；(12)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为GTA ；
(13)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TGC ；(14)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CGA ；(15)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CTA ；(16)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为AAG ；(17)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TGG。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pET_22b (+)的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pET-22b (+)的BamHI和XhoI酶切位点之间得到的重组质粒。 所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明还保护一种制备所述蛋白质的方法，是培养所述重组菌，得到所述蛋白质。所述培养的过程具体如下将所述重组菌接种至TB培养基，37°C、220rpm振荡培养至( 600Μ=0. 6 (O. 6-0. 8均可)；加IPTG，使其在培养体系中的浓度为O.OlmM，然后16。。、220rpm振荡培养96h ;将培养体系4°C、8000rpm离心10分钟，收集上清液。本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(I )或(II)或(III)( I )制备环状糊精葡糖基转移酶；( II )降解淀粉(如可溶性淀粉)；(III)生产α-环状糊精。本发明提供的蛋白质，生产α -⑶的专一性更高，生产效率更高，对生产具有重大价值。
图I为重组质粒甲的结构示意图。图2为α -CD标准曲线。图3为β -CD标准曲线。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。可溶性淀粉北京现代东方精细化学品有限公司，批号20070216。载体pET-22b(+)Novagen，产品目录号为69744-3。大肠杆菌BL21 (DE3):北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD601-01。TB培养基(g/L):胰蛋白胨12、酵母提取膏24、甘油4mL，蒸馏水定容。实施例I、突变蛋白及其编码基因的发现从自然界筛选到一株软腐芽孢杆菌(Bacillus macerans)，可以生产环糊精糖基转移酶，该菌株中的环糊精糖基转移酶基因如序列表的序列2所不，编码序列表的序列I所不的蛋白质。将序列I所不蛋白质命名为ct _CGTase_l蛋白，将其编码基因命名为a-CGTase-1基因(如序列2所不)。将序列3所不蛋白质命名为a-CGTase-WT蛋白(NCBI中公开的序列)，将其编码基因命名为α _CGTase-WT基因(如序列4所不)。序列I与序列3的差异仅在于第590位氨基酸残基(Μ/V)和第677位氨基酸残基(S/G)。序列2与序列4的差异仅在于第1768位核苷酸(A/G)和第2029位核苷酸(A/G)。以序列表的序列I所示双链DNA为模板，进行易错PCR，得到突变体库。通过对突变体库中各个基因表达的蛋白进行酶活鉴定，发现了一系列酶的产物专一性区别于序列3所示a-CGTase-WT蛋白的突变蛋白及其编码基因。实施例2、酶活鉴定
一、分别人工合成如下双链DNA分子(I)双链DNA分子I :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 TGG，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为色氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子I编码的蛋白命名为蛋白I。(2)双链DNA分子2 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 TGC，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为半胱氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子2编码的蛋白命名为蛋白2。(3)双链DNA分子3 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 CTA，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为亮氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子3编码的蛋白命名为蛋白3。(4)双链DNA分子4 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 GTA，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为缬氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子4编码的蛋白命名为蛋白4。(5)双链DNA分子5 :与序列表的序列2所不DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 GGT，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为甘氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子5编码的蛋白命名为蛋白5。(6)双链DNA分子6 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 CGA，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为精氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子6编码的蛋白命名为蛋白6。(7)双链DNA分子7 :与序列表的序列2所不DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 GAG，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为谷氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子7编码的蛋白命名为蛋白7。
(8)双链DNA分子8 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 AAT，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为天冬酰胺，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子8编码的蛋白命名为蛋白8。(9)双链DNA分子9 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 CAC，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为组氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子9编码的蛋白命名为蛋白9。(10)双链DNA分子10 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 CCA，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为脯氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子10编码的蛋白命名为蛋白10。 (11)双链DNA分子11 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 ACA，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为苏氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子11编码的蛋白命名为蛋白11。(12)双链DNA分子12 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 TCA，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为丝氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子12编码的蛋白命名为蛋白12。(13)双链DNA分子13 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 TTT，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子13编码的蛋白命名为蛋白13。(14)双链DNA分子14 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 AAG，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为赖氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子14编码的蛋白命名为蛋白14。(15)双链DNA分子15 :与序列表的序列2所不DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸(TAC)缺失，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ；相应的将序列I中的第167位氨基酸残基(酪氨酸)缺失，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子15编码的蛋白命名为蛋白15。(16)双链DNA分子16 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 CACCAC，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为两个连续的组氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子16编码的蛋白命名为蛋白16。(17)双链DNA分子17 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为了 CACCACCAC，并将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为三个连续的组氨酸，并将第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子17编码的蛋白命名为蛋白17。(18)双链DNA分子18 :与序列表的序列2所示DNA分子的差异在于将自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG ;相应的将序列I中的第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸。双链DNA分子18编码的蛋白命名为蛋白18。(19)双链DNA分子19 即序列表的序列2所示的双链DNA分子。(20)双链DNA分子20 :即序列表的序列4所示的双链DNA分子。二、重组质粒的构建(结构示意图见图I)I、设计一对引物，由S2和A3组成。
权利要求
1.将序列表的序列I所示蛋白质进行如下(a)和(b)两个突变得到的蛋白质Ca)将序列表的序列I自N末端第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸；(b)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基进行突变。
2.如权利要求I所述的蛋白质，其特征在于所述(b)中的所述突变为如下(I)至(17)中的任意ー种(1)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为三个连续的组氨酸；(2)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为两个连续的组氨酸；(3)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为组氨酸；(4)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基缺失；(5)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为脯氨酸；(6)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为甘氨酸；(7)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为苏氨酸；(8)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为谷氨酸；(9)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为天冬酰胺；(10)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为丝氨酸；(11)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸；(12)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为缬氨酸；(13)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为半胱氨酸；(14)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为精氨酸；(15)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为亮氨酸；(16)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为赖氨酸；(17)将序列表的序列I自N末端第167位氨基酸残基由酪氨酸突变为色氨酸。
3.编码权利要求I或2所述蛋白质的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因为将序列表的序列2所示蛋白质进行如下(c)和(d)两个突变得到的DNA分子(c)将序列表的序列2自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突变为GTG；Cd)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸进行突变。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于所述(d)中的所述突变为如下如下(I)至(17)中的任意ー种(1)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CACCACCAC；(2)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CACCAC；(3)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CAC；(4)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸缺失；(5)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CCA；(6)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为GGT；(7)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为ACA；(8)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为GAG；(9)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为AAT； (10)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TCA； (11)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TTT； (12)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为GTA； (13)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TGC； (14)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CGA； (15)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为CTA； (16)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为AAG； (17)将序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突变为TGG。
6.含有权利要求3或4或5所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将所述基因插入载体pET-22b (+)的多克隆位点得到的重组质粒。
8.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是将权利要求7所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌。
9.一种制备权利要求I或2所述蛋白质的方法，是培养权利要求6或8所述重组菌，得到权利要求I或2所述蛋白质。
10.权利要求I或2所述蛋白质的应用，为如下(I)或(II)或(III) (I )制备环状糊精葡糖基转移酶； (II)降解淀粉； (III)生产α-环状糊精。
全文摘要
本发明公开了一组环状糊精葡糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明提供的环状糊精葡糖基转移酶，来自软腐芽孢杆菌(Bacillus macerans)，是将序列表的序列1所示蛋白质进行如下(a)和(b)两个突变得到的蛋白质(a)将序列表的序列1自N末端第536位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸；(b)将序列表的序列1自N末端第167位氨基酸残基进行突变。本发明提供的蛋白质，生产α-CD的专一性更高，生产效率更高，对生产具有重大价值。
文档编号C12N1/21GK102827815SQ20121030316
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者钞亚鹏, 钱世钧, 宋炳红 申请人:中国科学院微生物研究所