专利名称：荧光分子修饰的纳米银探针及其试剂盒与在检测链霉亲和素中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种荧光分子修饰的纳米银探针及其试剂盒与在检测链霉亲和素中的应用。
背景技术：
金属纳米粒子和其他纳米结构能够用来增强荧光强度和提高荧光检测的灵敏度。当荧光分子靠近金属表面时，能使荧光分子的荧光特性改变，产生金属荧光增强的效应。这种由金属纳米结构所导致的荧光增强效应可以解释为1.近场增强所致的外来光吸收增强和纳米粒子散色所致的发射增强；2.纳米粒子表面的荧光分子的放射性衰变速度改变所致的荧光寿命和量子产率变化。该荧光增强效应与纳米粒子的形状和尺寸相关，也与荧光分子和纳米粒子之间的距离相关。最佳的荧光分子-金属表面的距离是8nm。银纳米粒子和岛状银膜已被用来增强荧光分子的荧光强度从而提高荧光检测的灵敏度。由于入射光 带来的表面等离子体激发产生的强等离子体吸收带和增强的局域电磁场，使得金属纳米粒子具有极佳的光学性质。局域表面等离子共振传感器已经用于免疫分析、生物分子检测、表面增强拉曼散射和金属荧光增强中。但是，基于局域表面等离子共振所产生的金属荧光增强效应是有限的，而且对不同的荧光分子的荧光增强能力也是有局限性的。此外，在基于金属荧光增强效应的传感器制备过程中，涉及到复杂的合成技术。因此，在金属荧光增强领域中，一个简单高效的金属荧光增强传感器具有很大的吸引力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一种灵敏的荧光增强技术并适用于蛋白质链霉亲和素(SA)检测的荧光分子修饰的纳米银探针。本发明还要解决的技术问题，是提供包含上述纳米银材料的试剂盒，用于SA的检测。本发明最后要解决的技术问题，是提供上述试剂盒在检测SA中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—种荧光分子修饰的纳米银探针，它以直径为l(T30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链和寡核苷酸链；其中，所述的荧光分子链为5’ -SH-AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-荧光分子；所述的荧光分子为Cy3或Cy5 ；其中，所述的寡核苷酸链为5’ -SH-AAAAAAAAAAAAAAA-生物素。上述的荧光分子修饰的纳米银探针的制备方法，它包括如下步骤(I)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为I :3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(2)将荧光分子链和寡核苷酸链按摩尔比(1、9) (rg)加入步骤(I)得到的纳米银溶液中，静置1(T24小时，荧光分子链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1 ；所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰，3’端由突光分子修饰,所述的突光分子为Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记；(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入I X PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0. 1XPBS，静置3 10小时；
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入广5mol/L氯化钠溶液，静置2 4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤广4次，使得氯化钠的终浓度为0. ro. 3mol/L ；(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24 72小时，取上清液；(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2 4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的
0.I飞倍；最后离心得到的沉淀用IXPBS缓冲溶液重悬即得备用探针。步骤(2)中，荧光分子链和寡核苷酸链摩尔比优选为(广10):(广10)，最优选为3:1 ;静置时间优选为15 20h，最优选为18h ;荧光分子链和寡核苷酸量的总摩尔量与纳米银摩尔量之比优选为(20(T300) :1，最优选为288:1。步骤(3)中，PBS缓冲溶液优选为I XPBS，即包含如下物质的水溶液137mM NaCl，
2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4. 12H20,2mM KH2PO4 ;静置时间优选为 6h。步骤(4)中，氯化钠溶液的浓度优选为2mol/L ;氯化钠的终浓度优选为0. 2mol/L ；静置时间优选为3h。步骤(5)中，静置时间优选为48h。步骤(6)中，所述的离心条件为1000(T20000rpm条件下离心10 30分钟，优选15000条件下离心15分钟。上述荧光分子修饰的纳米银探针在制备检测链霉亲和素的试剂中的应用。一种用于检测链霉亲和素的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂荧光分子修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、链霉亲和素、硝酸银、氢醌、牛血清白蛋白溶液、醛基片基。上述用于检测链霉亲和素的试剂盒在检测链霉亲和素中的应用。利用上述检测链霉亲和素的试剂盒检测链霉亲和素含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤(I)配制溶液稀释液将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ;洗涤液I X PBS溶液按0. 05%的体积比加入吐温-20溶液；阴性对照将0. Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl X PBS溶液中，得lmg/mlBSA溶液；封闭液将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
荧光增强液18. 2mmol/L硝酸银和I. 82mmol/L氢醌等体积混合；链霉亲和素标准溶液配制不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液；探针用IXPBS溶液配制I. 3nmol/L的荧光分子修饰的纳米银探针；(2)将不同浓度的链霉亲和素标准溶液，待测样品和阴性对照在醛基片上点样，分别为25iU，4°C条件下固定过夜；
(3)每孔加入l(T200ii L封闭液，在37 °C条件下封闭广3小时，用洗涤液荡洗5 15min,洗漆3 4次,拍干；(4)每孔加入I. 3nmol/L荧光分子修饰的纳米银探针30 y L，在37°C条件下反应1^3小时，用洗涤液荡洗5 15min，洗涤3 4次，拍干；(5)每孔加入30 y L荧光增强液，避光反应f 8min，去离子水冲洗3 4遍，拍干；(6)用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液对应不同的荧光信号强度，得到链霉亲和素的标准曲线，由标准曲线计算得到样品中链霉亲和素的浓度。有益效果本发明的纳米银探针耦合荧光增强液的方法能大大提高荧光检测的灵敏度，不需要通过改变仪器的结构来提高检测性能，巧妙地提高了检测能力。此种探针的合成及修饰方法成熟，荧光增强液廉价易得，两者的联合使用可以得到惊人的结果。为蛋白质的荧光分析检测提供了一种极好的方法。本发明利用生物素链霉亲和素的特异性结合实现对链霉亲和素的分析检测，对链霉亲和素的分析范围为31. 2 u g/ml-1000 u g/ml。纳米银簇对两种荧光分子Cy3和Cy5均有很好的荧光增强效果，此种荧光增强液独一无二，商品化的银增强溶液虽然能形成银纳米簇，但是没有荧光增强的作用。对于生物分析、荧光示踪、细胞成像和基于银纳米粒子的药物输送与治疗中的金属荧光增强研究，本发明提供了一个坚实的有前景的平台。
图I为纳米银银簇荧光增强用于SA的分析检测示意图。图2为荧光增强溶液与Sigma的显色剂对荧光分子Cy5荧光增强效应的比较。图3为扫描电镜显微镜表征图。其中，Ca)纳米银探针，(b)纳米银探针与荧光增强液反应8分钟后的图像，(c)纳米银探针与Sigma显色剂反应8分钟后的粒子形貌图。图4为纳米银簇对染料分子Cy3的荧光增强作用。图5为纳米银簇对SA的分析检测。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :纳米银探针的制备。(I)在冰浴的条件下，将2mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至3mmol/L的硼氢化钠溶液中(两者反应摩尔比为1:3)，不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7%摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2. 6nM。
(2)将荧光分子链和寡核苷酸链按摩尔比3:1加入步骤(I)得到的纳米银溶液中，静置18小时。荧光分子链和寡核苷酸量的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为288。所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰，3’端由突光分子修饰,所述的突光分子为Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记。(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2. 7mMKCl, IOmM, Na2HP04. 12H20, 2mM KH2P04)溶液，使 PBS 的浓度为 0. I X，静置 6 小时。(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液，每隔3小时加一次氯化钠，静置，使氯化钠的终浓度为0. 2mol/L。
(5)将步骤⑷得到的混合体系静置48小时，取上清液。(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的I倍；最后离心得到的沉淀经IXPBS重悬即得荧光分子修饰的纳米银探针。所述的荧光分子为Cy3时，制得相应的探针l_Cy3。所述的荧光分子为Cy5时，制得相应的探针l_Cy5。实施例2 :纳米银探针的制备。(I)在冰浴的条件下，将20mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至30mmol/L的硼氢化钠溶液中(两者反应摩尔比为1:3)，不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7%摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2. 6nmol/L。(2)将荧光分子链和寡核苷酸链按摩尔比I: I加入步骤(I)得到的纳米银溶液中，静置10小时。荧光分子链和寡核苷酸量的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为100。所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰，3’端由突光分子修饰,所述的突光分子为Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记。(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2. 7mMKCl, IOmM, Na2HPO4. 12H20, 2mM KH2PO4)溶液，使 PBS 的浓度为 0. I X，静置 3 小时。(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入lmol/L氯化钠溶液，静置2小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I次，使氯化钠的终浓度为0. lmol/L。(5)将步骤⑷得到的混合体系静置24小时，取上清液。(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0. I倍；最后离心得到的沉淀经IXPBS重悬即得荧光分子修饰的纳米银探针。所述的荧光分子为Cy3时，制得相应的探针l_Cy3。所述的荧光分子为Cy5时，制得相应的探针l_Cy5。实施例3 :纳米银探针的制备。(I)在冰浴的条件下，将10mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至20mmol/L的硼氢化钠溶液中(两者反应摩尔比为1:3)，不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7%摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2. 6nmol/L。(2)将荧光分子链和寡核苷酸链按摩尔比99:9加入步骤(I)得到的纳米银溶液中，静置24小时。荧光分子链和寡核苷酸量的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为1000。所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰，3’端由突光分子修饰,所述的突光分子为Cy3或Cy5 ；所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记。(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入IXPBS (137mM NaCl, 2. 7mMKCl, IOmM, Na2HP04. 12H20, 2mM KH2P04)溶液，使 PBS 的浓度为 0. I X，静置 10 小时。(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液，静置4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次,使氯化钠的终浓度为0. 3mol/L0 (5)将步骤(4)得到的混合体系静置72小时，取上清液。(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，沉淀加入IXPBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍；最后离心得到的沉淀经IXPBS重悬即得荧光分子修饰的纳米银探针。所述的荧光分子为Cy3时，制得相应的探针l_Cy3。所述的荧光分子为Cy5时，制得相应的探针l_Cy5。实施例4 :用于检测SA的试剂盒。荧光分子修饰的纳米银探针实施例f 3的方法合成；PBS (购自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20 (购自天津科美有限公司)用于配制洗涤液；牛血清白蛋白、链霉亲和素(标准品)购自北京博奥森生物技术有限公司；硝酸银购自于Sigma ；氢醌购自于(南京试剂有限公司)；醛基片基购自于(上海百傲科技有限公司)。所有溶液均用高纯水配制。实施例5 :检测SA的方法。利用实施例4的试剂盒检测链霉亲和素含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤(I)配制溶液稀释液将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ;洗涤液I X PBS溶液按0. 05%的体积比加入吐温_20溶液；阴性对照将0. Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl X PBS溶液中，得lmg/mlBSA溶液；封闭液将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；荧光增强液18. 2mmol/L硝酸银和I. 82mmol/L氢醌等体积混合；链霉亲和素标准溶液配制不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液；探针用IXPBS溶液配制I. 3nmol/L的荧光分子修饰的纳米银探针；(2)将不同浓度的链霉亲和素标准溶液，待测样品和阴性对照在醛基片上点样，分别为25iU，4°C条件下固定过夜；(3)每孔加入30i! L封闭液，在37°C条件下封闭2小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；(4)每孔加入I. 3nmol/L探针1-Cy3或探针1-Cy5 30 y L，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；(5)每孔加入30 L荧光增强液，避光反应8min，去离子水冲洗3遍，拍干；(6)用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液对应不同的荧光信号强度，得到链霉亲和素的标准曲线，由标准曲线计算得到样品中链霉亲和素的浓度。
实施例6:本发明首次报导构建了由荧光分子修饰的银纳米粒子和荧光增强液(由18.2mM的硝酸银和I. 82mM的氢醌组成的混合溶液)形成的具有荧光增强能力的银纳米簇。通过两端修饰有巯基及生物素的寡核苷酸(含15个碱基A)和两端修饰有巯基及荧光分子的寡核苷酸(含24个碱基A)使得银纳米粒子表面修饰有生物素和荧光分子。生物素可以使得纳米银探针固定在链霉亲和素修饰的芯片上。纳米银探针溶液可以催化荧光增强溶液中的银离子形成银纳米簇进一步增强荧光分子的荧光强度(图I)。图2为荧光增强溶液与Sigma的显色剂对荧光分子Cy5荧光增强效应的比较。实验方法与实施例5相同，所不同的是步骤(2)，将lmg/ml SA标准溶液，阴性对照在醛基片上点样，分别为25 yl，4°C条件下固定过夜；步骤(4)，每孔加入1.3nmol/L探针1-Cy5 30 y L，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；步骤(5)，每孔分别加入30 y L本发明的荧光增强液和Sigma购买的银增强溶液，分别避光反应Omin, 0. 5min, lmin, 2min, 4min, 8min,去离子水冲洗3遍,拍干；步骤(6),用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同时间对应不同的突光信号强度，时间与突光信号强度的柱状图。从图2可以发现荧光增强液可以大大提高荧光信号强度，延长探针和荧光增强溶液的反应时间可以加强荧光增强的效果(图la，lb)。通过微阵列芯片扫描仪(激发波长635nm)采集得到的数据，表明纳米银簇对于Cy5，最佳的荧光增强倍数达到25倍。而购买的Sigma的银增强溶液，其主要成分也是银离子溶液和相应的还原剂，在纳米银探针的催化作用下，同样可以生成纳米银团簇，但是其荧光增强的效果很差(图lc，ld)。图3扫描电镜显微镜表征图(荧光分子为Cy5)。其中，Ca)纳米银探针，(b)纳米银探针与荧光增强液反应8分钟后的图像，(c)纳米银探针与Sigma显色剂反应8分钟后的粒子形貌图。实验方法与实施例5相同，所不同的是步骤(2)，将lmg/ml SA标准溶液，阴性对照在醛基片上点样，分别为25 yl，4°C条件下固定过夜；步骤(4)，每孔加入1.3nmol/L探针1-Cy5 30 y L，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；步骤(5)，每孔分别加入30 y L本发明的荧光增强液和Sigma购买的银增强溶液，分别避光反应8min，去离子水冲洗3遍，拍干；步骤(6)，喷金，采集扫描电子显微镜图片。扫描电镜显微镜显示(图3)，纳米银探针与荧光增强液及Sigma显色剂后，粒子的形貌和粒径发生很大的变化。粒子形貌和粒径的不同决定了荧光增强的效应也不一样，只有形成(b)图形貌的显色剂才具有荧光增强的作用，而(C)显示的粒子其荧光增强作用很弱。同时也观察到通过荧光增强液和购自Sigma的银增强溶液所产生的银纳米簇的颜色是不同的前者产生的银纳米簇显银灰色，而后者产生的银纳米簇则是黑色的。这种差别表明银增强溶液的其他组分不仅影响到生成的银纳米簇颜色(吸收性质)，还阻碍了银纳米簇的局域表面等离子体与荧光分子之间的共振耦合。图4为纳米银簇对染料分子Cy3的荧光增强作用。实验方法与实施例5相同，所不同的是步骤(2)，将lmg/ml SA标准溶液，阴性对照在醛基片上点样，分别为25 yl，4°C条·件下固定过夜；步骤(4)，每孔加入1.3nmol/L探针1-Cy3 30 y L，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；步骤(5)，每孔分别加入30 UL本发明的荧光增强液，分别避光反应Omin, 0. 5min, lmin, 2min, 4min, 8min,去离子水冲洗 3 遍,拍干；步骤(6),用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同时间对应不同的突光信号强度，时间与突光信号强度的柱状图。为进一步拓展荧光增强溶液生成的银纳米簇的应用，本发明研究了纳米银簇对另外一种荧光染料Cy3 (激发波长为532nm)的金属荧光增强效应。结果表明，Cy3的荧光信号增强了 46倍。与Cy5的结果相似，Cy3的荧光增强效应也随着反应时间的延长得到加强(图4)。纳米银簇对Cy3具有更好的荧光增强效应。图5为纳米银簇对SA的分析检测。实验方法同实施例5，所不同的是步骤(2)，将不同浓度31.210001! g/ml SA标准溶液，阴性对照在醛基片上点样，分别为25iU，4°C条件下固定过夜；步骤(4)，每孔加入1.3nmol/L探针1-Cy5 30 ii L，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；步骤(5)，每孔分别加入30 y L本发明的荧光增强液，分别避光反应lmin，留一半的孔不加任何试剂作为对照，去离子水冲洗3遍，拍干；步骤(6),用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner 生物芯片扫描仪扫描，SA 浓度对应不同的荧光信号强度，得到浓度与荧光信号强度的图。本发明将纳米银簇用于SA蛋白的分析检测中，发现当SA浓度在31. 2-1000 u g/ml之间，荧光增强液形成的纳米银簇与浓度的对数值具有很好的线性关系，而且纳米银簇的荧光信号远远大于纳米银探针的荧光信号。
权利要求
1.一种荧光分子修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为l(T30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有突光分子链和寡核苷酸链； 其中，所述的荧光分子链为5’ -SH-AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-荧光分子；所述的荧光分子为Cy3或Cy5 ； 其中，所述的寡核苷酸链为5’ -SH-AAAAAAAAAAAAAAA-生物素。
2.权利要求I所述的荧光分子修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤 (1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为I :3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液； (2)将荧光分子链和寡核苷酸链按摩尔比(1 99):(1 9)加入步骤(I)得到的纳米银溶液中，静置10 24小时，荧光分子链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1 ； 所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5，AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5，端由巯基修饰，3’端由荧光分子修饰，所述的荧光分子为Cy3或Cy5 ； 所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAA3’，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记； (3)向步骤(2)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0. 1XPBS，静置3 10小时； (4)向步骤(3)得到的混合体系中加入f5mol/L氯化钠溶液，静置2 4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤广4次，使得氯化钠的终浓度为0. ro. 3mol/L ； (5)将步骤(4)得到的混合体系静置24 72小时，取上清液； (6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2 4次，IXPBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0. I飞倍；最后离心得到的沉淀用IXPBS缓冲溶液重悬即得备用探针。
3.根据权利要求2所述的荧光分子修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的离心条件为10000 20000rpm条件下离心10 30分钟。
4.权利要求I所述的荧光分子修饰的纳米银探针在制备检测链霉亲和素的试剂中的应用。
5.一种用于检测链霉亲和素的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下试剂荧光分子修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、链霉亲和素、硝酸银、氢醌、牛血清白蛋白溶液、醛基片基。
6.权利要求5所述的用于检测链霉亲和素的试剂盒在检测链霉亲和素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用检测链霉亲和素的试剂盒检测链霉亲和素含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤 (I)配制溶液 稀释液将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ； 洗涤液1 XPBS溶液按0. 05%的体积比加入吐温-20溶液；阴性对照将0. Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/ml BSA溶液； 封闭液将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液； 荧光增强液18. 2mmol/L硝酸银和I. 82mmol/L氢醌等体积混合； 链霉亲和素标准溶液配制不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液； 探针用I XPBS溶液配制I. 3nmol/L的荧光分子修饰的纳米银探针； (2)将不同浓度的链霉亲和素标准溶液，待测样品和阴性对照在醛基片上点样，分别为25iU，4°C条件下固定过夜； (3)每孔加入10 2001^封闭液，在371条件下封闭广3小时，用洗涤液荡洗5 151^11，洗涤3 4次，拍干； (4)每孔加入I.3nmol/L荧光分子修饰的纳米银探针30 y L，在37°C条件下反应3小时，用洗涤液荡洗5 15min，洗涤3 4次，拍干； (5)每孔加入30y L荧光增强液，避光反应f 8min，去离子水冲洗3 4遍，拍干； (6)用Luxscan-10K/AMicroarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度的链霉亲和素标准样品溶液对应不同的荧光信号强度，得到链霉亲和素的标准曲线，由标准曲线计算得到样品中链霉亲和素的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种荧光分子修饰的纳米银探针。纳米银探针以直径为10~30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链和寡核苷酸链。本发明还公开了包含上述探针的试剂盒与在检测链霉亲和素中的应用。本发明的纳米银探针耦合荧光增强液的方法能大大提高荧光检测的灵敏度，不需要通过改变仪器的结构来提高检测性能，巧妙地提高了检测能力。此种探针的合成及修饰方法成熟，荧光增强液廉价易得，两者的联合使用可以得到惊人的结果。为蛋白质的荧光分析检测提供了一种极好的信号放大的方法。
文档编号C12N15/11GK102796737SQ201210303189
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者许丹科, 李慧, 魏霞, 羌维兵, 李钟卉 申请人:南京大学