专利名称：：一种miRNA分子标记的制备方法
技术领域：
：本发明属于棉花分子育种
技术领域：
，更具体涉及一种miRNA分子标记的制备方法，方法易行，操作简便，费用低廉，能高效快捷的发掘miRNA分子标记，而且由于SRAP引物设计的特点，所得的miRNA标记可能为功能基因。
背景技术：
：MicroRNA是一类内源性的非编码小分子RNA，，长约2025nt，miRNA基因的前体是约为70nt的茎环结构的RNA分子(Barteetal.1997；Laietal.2003)，它经过核糖核酸酶III(Dicer)的剪切加工，形成长约22nt的单链miRNA分子，几乎所有的miRNA都是从前体的一条臂上加工而来，只有极少数的个例可以从前体的两条臂上同时产生miRNA(Lee，Y.etal.2003)。micix)RNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分落于基因间隔区，说明它们的转录独立于其他的基因，具有本身的转录调控机制。在植物细胞中，它参与了基因的转录与表达，主要通过与靶基因mRNA的特定位点结合，抑制蛋白的合成或诱导mRNA的降解而起作用。自2002年miRNA在植物中发现以后，植物中越来越多的miRNA相继被报道，由于其在植物和动物的生命活动过程中起着重要的调控作用而受到越来越广泛的关注。miRNA作为一种调节分子广泛的参与到动植物的发育中，研究发现，植物miRNA作用的目的mRNA大都编码转录因子，这些转录因子与分生组织的特性、细胞的分裂、器官的分离、器官的极性相关，而且某些转录因子可能与棉花纤维的发育与伸长有关，因此miRNA的研究对于提高棉花产量和改善纤维品质具有重要的意义。在2002年，miRNA被Science杂志评为十大科技突破第一名，目前miRNA成为研究的热点之一，但到目前为止对miRNA进行分子标记开发的文章却很少，仅2011年Pang发表的ComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons—篇。AFLP以其精确有效的特点得到了广泛的应用，但是，其步骤相对复杂，需要经过DNA消化、连接、扩增等多步反应，各步的反应条件很难控制，出现假阳性机率较高，并且AFLP技术受到专利保护试剂盒昂贵，成本较高，而且对DNA的纯度和内切酶的质量要求较高。AFLP谱带多，但分析程序复杂、成本高有时要用到同位素，识别AATT位点的MseI酶常会引起一些物种基因组中标记分布不均衡，基因组不完全酶切，染色体聚集，这在一定程度上限制了它们的发展。基于此背景本实验利用miRNA保守序列设计的简并引物与SRAP引物进行组合开发miRNA分子标记，希望能高效快捷的发掘更多的miRNA分子标记。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、可产生共显性标记、便于克隆测序目标片段的特点，因此兼具AFLP的多态性高、产率中等、重复性好和RAPD的操作简单等优点。被广泛应用于生物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建和比较基因组学等方面，SRAP标记引物设计原理是利用基因外显子里GC含量丰富，而启动子和内含子里AT含量丰富的特点而设计的引物，对开放阅读框架进行扩增，因此本miRNA分子标记开发方法所得标记可能为功能标记，对miRNA的研究具有重要的意义。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种miRNA分子标记的制备方法，利用miRNA保守序列引物与SRAP引物(Sequence-relatedamplifedpolymorphism)进行组合制备miRNA分子标记，方法易行，操作简便，能高效快捷的发掘miRNA分子标记，而且由于SRAP引物设计的特点，所得的miRNA标记可能为功能基因,对今后miRNA的研究具有一定的参考价值。为了实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现一种miRNA分子标记的制备方法，其步骤是(I)利用已知的128个SRAP引物(刘大军.陆地棉SRAP图谱构建与种子物理、营养品质性状QTL定位.博士学位论文.西南大学图书馆，2010)，与23个保守的pre-miRNA引物(弓I物序列见MingxiongPang,ChaozhuXinga,NickAdamsComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons.JournalofPlantPhysiology,168(2011)824-830),利用两两组合的方式(共计2944对引物),在常温条件下利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对鄂棉22(ZhangYanxin等，CharacteristicsandanalysisofsimplesequencerepeatsinthecottongenomebasedonlinkagemapconstructedfromaBC1populationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense,Genome,2008(51):534-546)和海岛棉品系3-79(李武等，海岛棉遗传多样性的SRAP标记分析，作物学报ACTAAGR0N0MICASINICA2008,34(5):893-898)两个亲本进行三次多态性筛选，挑选出稳定的多态性标记组合，得到55对亲本间呈多态性的SSR引物，引物多态性率为I.87%。(2)以陆地棉品种鄂棉22为母本，海岛棉品系3-79为父本,杂交得F1，后用鄂棉22给Fl授粉得含141个单株的海陆种间BC1群体。(3)采集步骤(2)中BC1群体的各单株的叶片和鄂棉22、海岛棉品系3-79以及F1的叶片，提取gDNA(方法参照PatersonAH,BrubakerC,WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep,1993,11:122—127)。(4)以两亲本鄂棉22和海岛棉品系3-79、F1^Hl个BC1单株共144个个体的DNA为模板，用步骤(I)中筛选出的55对多态性引物进行PCR扩增，扩增产物用6%(V/V)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。(5)记录下各引物扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上的多态性信息。具体如下对于共显性标记，用“A”表示母本鄂棉22的纯合带型，用“B”表示父本海岛棉品系3-79的纯合带型，用“H”表示两亲本的杂合带型；；数据缺失用表示。(6)在构建高密度海陆种间图谱(Yu,Y,Yuan,D.J.,Liang,S.G.,Li,X.M.,Wang,X.Q.,Lin,Z.X.,andZhang,X.L.2011.Genomestructureofcottonrevealedbyagenome-wideSSRgeneticmapconstructedfromaBClpopulationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense.BMCGenomics,12:15.doi:10.1186/1471-2164-12-15.PMID:21214949)所用的多态性标记的基础上，结合新筛选的步骤(I)中的55对多态性标记，利用JoinMap3.O(Stam,P.1993.Constructionofintegratedgeneticlinkagemapsbymeansofanewcomputerpackage:JoinMap.PlantJ.3(5):739-744.doi:10.1111/j.1365-313X.1993.00739.x)为作图软件(LOD值设为5.0)，并用Kosambi函数(Kosambi,D.D.1944.Theestimationofmapdistancefromrecombinationvalues.Ann.Eugen.12(1):172-175.doi:10.1111/j.1469-1809.1943.tb02321.x)将重组率转换为遗传图距(cM),最后用MapChartV2.2software(Voorrips,R.Ε.2002.MapChan:softwareforthegraphicalpresentationoflinkagemapsandQTLs.J.Hered.93(I):77-78.doi:10.1093/jhered/93.I.77.PMID:12011185)软件绘制出遗传连锁图谱，最终实现pre-miRNA的染色体定位。结果通过对2944对miRNA引物与SRAP引物组合进行了筛选，得到55对亲本间呈多态性的SSR引物，引物多态性率为I.87%;共得到59个多态性位点，位点多态性率为2.00%。其中，57个多态性位点进入24条染色体，第I染色体和第22条染色体上未定位到引物组合标记，作图效率为96.61%。对具有多态性标记的亲本组合随机选择8对引物组合(miR165-Me21、miR168-Me22、miR164_Me40、miR168_Mel7、miR408_Em7、miR164_Em33、miR169a_Me27和miR159-Me24)挖胶进行TA克隆测序验证经TA克隆测序结果检测，其中有七对引物组合(七对引物组合为miR165-Me21、miR168-Me22、miR164-Me40、miR168-Mel7、miR408-Em7、miR164-Em33、miR169a-Me27)所得产物含有miRNA的保守序列。与现有技术相比，本发明具有以下优点MicroRNA是一类内源性的非编码小分子RNA，长约2025nt，它参与了基因的转录与表达，主要通过与靶基因mRNA的特定位点结合，抑制蛋白的合成或诱导mRNA的降解而起作用，调控棉花纤维的发育与伸长，目前miRNA的具体作用机制还不清楚，因此对已预测或经试验验证的pre-miRNA进行定位,对今后的研究具有一定的指导意义。miRNA作为一种调节分子广泛的参与到动植物的发育中，研究发现，植物miRNA作用的目的mRNA大都编码转录因子，这些转录因子与分生组织的特性、细胞的分裂、器官的分离、器官的极性相关，而且某些转录因子可能与棉花纤维的发育与伸长有关，因此miRNA的研究对于提高棉花产量和改善纤维品质具有重要的意义。在2002年，miRNA被Science杂志评为十大科技突破第一名，目前miRNA成为研究的热点之一，但到目前为止对miRNA进行分子标记开发的文章却很少，仅2011年Pang发表的ComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons一篇。本发明首次用miRNA保守序列设计的简并引物与SRAP引物进行组合制备miRNA分子标记，一方面能够高效快捷的发掘miRNA分子标记，另一方面由于SRAP引物设计的特点，所得的miRNA标记可能为功能基因,对今后miRNA的研究具有一定的参考价值。图I为一种miRNA分子标记的制备方法流程图。图2为miR171与Em5引物组合对BC1群体的电泳图。图3为TA克隆测序结果。SRAP引物用粗体表示，miRNA引物用粗体加斜体表示。图4为一种miRNA分子标记在连锁图谱上的分布示意图。引物组合标记使用粗体表示。同时，图谱两端的标记以及与引物组合标记相邻的SSR标记也被保留下来。具体实施例方式实施例I:I、构建海陆种间BC1群体用于遗传作图所用的海陆种间BC1群体参见文献(ZhangYanxinCharacteristicsandanalysisofsimplesequencerepeatsinthecottongenomebasedonlinkagemapconstructedfromaBC1populationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense,Genome,2008(51):534-546)。具体构建方法如下以陆地棉品种鄂棉22(ZhangYanxin等，CharacteristicsandanalysisofsimplesequencerepeatsinthecottongenomebasedonlinkagemapconstructedfromaBC1populationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense,Genome，2008(51):534-546)为母本，海岛棉品系3_79(李武等，海岛棉遗传多样性的SRAP标记分析，作物学报ACTAAGR0N0MICASINICA2008,34(5):893-898)为父本，杂交得F1，后用鄂棉22给F1授粉得含141个单株的海陆种间BC1群体，以该BC1群体为作图群体构建棉花海陆种间遗传连锁图。其中，陆地棉品种“鄂棉22”是湖北黄冈农科所从杂交组合鄂荆I号XFD2165后代中选育的高产品种，但纤维品质较差，且不抗枯、黄萎病；海岛棉品系“3-79”是海岛棉的遗传标准系，纤维品质优良，黄萎病抗性强，但产量水平低。2、采集上述步骤中BC1群体的各单株的叶片和鄂棉22、海岛棉品系3_79以及F1的叶片，提取gDNA(方法参照PatersonAH,BrubakerC，WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep,1993,11:122—127)。3,miRNA引物与SRAP引物组合在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件下的亲本多态性筛选。对2944对miRNA引物(MingxiongPang,ChaozhuXinga,NickAdams等，ComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons.JournalofPlantPhysiology,168(2011)824-830)与SRAP引物(刘大军.陆地棉SRAP图谱构建与种子物理、营养品质性状QTL定位.博士学位论文.西南大学图书馆，2010)组合进行了三次筛选，得到55对亲本间呈多态性的SSR引物，引物多态性率为1.87%。55对多态性引物组合及单个引物名称如下表I所示表ICN102816848>i^s5/7刦miRi60-Mel53iR159miR159-Mci9MiR160miR169a-Mc27miR162miR169a—Em5miRIMIl68-Me22miRl65/166miR168-Em34miRl67miR167-Me7miR168miR167_Me491169aI168—Mel7miRl69bmiR164-Me40miR171miR164-Em20miRl72miR160-Em46miR393miR162-Mel2miR394miR172-Me6miR397Im-Melo1403I171-Me40miRimiR17rEm5EmISiR169b~Em29ES5miR171_Me6￡371171—Mel7EmlOll￡_Mel2EmI2miR165IMC2一jE32()miRJ65丨Em33Em27miR169b,MC45EitP)1172-Me49Em30〔004s7miR172-Em20Em31niiR403-Me20Em33miR403-Me35Em34miR403-Em27Em39raiR169a-Eml2Em46miR397-Me49Em62niiR396-Me43MelmiR159-Me24Me4miR159-Me29Me6miR162-Em39Me7miR394-Em30MelOniiR393-Me4Mel2miR393-EmlMel7miR408-Em7Me19raiR408-Era31Me20miR393-Me42Me21niiR408-Mel9Me22miR169a-Eml0Me24miR168-MelMe27miR171-Era29Me29miR395-Me4Me31niiR394-Me3iMe35miR165-Me54Me40miR396-Me7Me42miR169b-Em11)Mc43miR408-Me49Me45niiR164-Me29Me49miR164-Em33Me54(I)PCR反应体系(IOul)如下DNA模板30ng，IxBuffer,2.OmmolL_lMgC12，0.2mmolL-IdNTPsj0.IμmoIL-ImiRNAprimer,0.IμmoIL-ISRAPprimer,0.5UTaqDNA聚合酶，不足部分用无菌的双蒸水补齐。(2)PCR扩增程序如下开始94°C变性5min,反应前4个循环在94°Clmin,35°Clmin,72°CImin条件下运行；之后34个循环在94°Clmin，54°Clmin，72°Clmin条件下运行，最后72°C延伸lOmin。(3)6%变性聚丙烯酰胺凝胶的配方如下尿素420.Og,丙烯酰胺57.Og,甲叉双丙烯酰胺3.Og,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为19:1，IOxTBElOOml,然后用蒸馏水定容至IL0(4)利用北京六一仪器厂生产的DYY-12型电泳仪和DYCZ-20型电泳槽，常温条件下80W恒功率电泳2h，银染的方法参照Lin等(2005)的方法。4、miRNA弓I物与SRAP弓I物组合对BC1群体进行多态性分析以两亲本鄂棉22和海岛棉品系3-79'Fp141个BC1单株共144个个体的DNA为模板，用经电泳条件筛选出的多态性引物组合进行PCR扩增，扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(方法同3)。记录下各引物扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上的多态性信息。具体如下对于共显性标记，用“A”表示母本鄂棉22的纯合带型，用“B”表示父本海岛棉品系3-79的纯合带型，用“H”表示两亲本的杂合带型；；数据缺失用表示。在原有多态性标记的基础上，结合新增加的多态性标记，利用JoinMap3.O(Stam,P.1993.Constructionofintegratedgeneticlinkagemapsbymeansofanewcomputerpackage:JoinMap.PlantJ.3(5):739-744.doi:10.1111/j.1365-313X.1993.00739.x)为作图软件(L0D值设为5.0)，并用Kosambi函数(Kosambi,D.D.1944.Theestimationofmapdistancefromrecombinationvalues.Ann.Eugen.12(1):172-175.doi:10.1111/j.1469-1809.1943.tb02321.x)将重组率转换为遗传图距(cM),最后用MapChartV2.2software(Voorrips,R.E.2002.MapChart:softwareforthegraphicalpresentationoflinkagemapsandQTLs.J.Hered.93(1):77-78.doi:10.1093/jhered/93.I.77.PMID:12011185)软件绘制出遗传连锁图谱，最终实现pre-miRNA的染色体定位。本实验对2944对miRNA引物与SRAP引物组合进行了筛选，得到55对亲本间呈多态性的SSR引物，引物多态性率为I.87%;共得到59个多态性位点，位点多态性率为2.00%。其中，57个多态性位点进入24条染色体，第I染色体和第22条染色体上未定位到引物组合标记，作图效率为96.61%。各标记在连锁图上的分布见图4。5、TA克隆验证随机选择八对引物(miR165-Me21、miR168_Me22、miR164_Me40、miR168_Mel7、miR408-Em7、miR164_Em33、miR169a_Me27和miR159_Me24),对其进行TA克隆，最终对阳性检测呈阳性的进行测序，测序结果显示八对引物组合中有七对组合(七对引物组合为miR165-Me2UmiR168_Me22、miR164_Me40、miR168_Mel7、miR408_Em7、miR164_Em33、miR169a-Me27)所得产物含有miRNA的保守序列(图3)。权利要求1.一种miRNA分子标记的制备方法,其步骤是(1)用已知的128个SRAP引物与23个保守的pre_miRNA引物，利用两两组合的方式共计2944对引物，通过常规电泳方法对鄂棉22和海岛棉品系3-79两个亲本进行三次多态性筛选，挑选出稳定的多态性标记组合，得到55对亲本间呈多态性的SSR引物，引物多态性率为I.87%；(2)以陆地棉品种鄂棉22为母本，海岛棉品系3-79为父本，杂交得F1，后用鄂棉22给Fl授粉得含141个单株的海陆种间BCl群体；(3)采集步骤(2)中BCl群体的各单株的叶片和鄂棉22、海岛棉品系3-79以及Fl的叶片，提取gDNA；(4)以两亲本鄂棉22和海岛棉品系3-79、Fl、141个BCl单株共144个个体的DNA为模板，用步骤(I)中筛选出的55对多态性引物进行PCR扩增，扩增产物用6%V/V变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；(5)记录下各引物扩增产物在6%V/V变性聚丙烯酰胺凝胶上的多态性信息，具体如下对于共显性标记，用A表示母本鄂棉22的纯合带型，用B表示父本海岛棉品系3-79的纯合带型，用H表示两亲本的杂合带型；数据缺失用-表示；(6)在构建高密度海陆种间图谱所用的多态性标记的基础上，结合步骤(I)筛选出的中的55对多态性标记，利用JoinMap3.O为作图软件，LOD值设为5.O,并用Kosambi函数将重组率转换为遗传图距，最后用MapChartV2.2software软件绘制出遗传连锁图谱，获得pre-miRNA的染色体定位。全文摘要本发明公开了一种miRNA分子标记的制备方法，其步骤是1)用已知的128个SRAP引物与23个保守的pre-miRNA引物，利用两两组合的方式对鄂棉22和海岛棉品系3-79两个亲本进行多态性筛选；2)两个亲本杂交获得F1代，然后用鄂棉22做父本回交获得BC1群体；3)提取两个亲本，F1代和BC1群体的gDNA；4)用步骤1)中筛选出的多态性引物对3)中的gDNA进行多态性筛选；5)记录扩增产物信息；6)利用作图软件获得pre-miRNA的染色体定位。方法易行，操作简便，费用低廉，能高效快捷的发掘miRNA分子标记，而且由于SRAP引物设计的特点，所得的miRNA标记可能为功能基因，对今后miRNA的研究具有一定的参考价值。文档编号C12Q1/68GK102816848SQ201210302878公开日2012年12月12日申请日期2012年8月24日优先权日2012年8月24日发明者林忠旭,张献龙,陈学梅申请人:华中农业大学