专利名称：一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法
技术领域：
本发明涉及一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，属于疾病免疫技术领域。
背景技术：
猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。除引起PMWS外，PCV2还能引起母猪繁殖障碍，仔猪先天性震颤等，并可能与猪皮炎肾病综合征(PDNS)呼吸道疾病复合征(PRDC)等病密切相关，还可造成一些传染病的继发感染。PCV2主要在宿主的淋巴系统增殖，可致使B淋巴细胞凋亡，影响肺泡巨噬细胞的正常功能，降低外周血中CD8+分子含量，造成免疫抑制，从而易发生混合感染和继发感染，给猪场疫病防治带来困难。目前国内外猪场普遍存在PCV2，现已对全球养猪业构成重大危害已成为危害 养猪业的又一种新的重要传染病。PCV2含有2个主要的开放式阅读框(Open reading frames，ORFs)，其中0RF2编码核衣壳蛋白(Cap蛋白)，是病毒的主要结构蛋白。Blanchard等用杆状病毒表达的PCV2核衣壳蛋白和0RF2核酸疫苗分别免疫仔猪，均可使仔猪对PCV2产生攻毒保护，且PCV2亚单位疫苗比接种DNA疫苗能产生更好的保护作用(An 0RF2 protein-based ELISA for porcinecircovirus type 2 antibodies in post-weaning multisystemic wasting syndrome ；Veterinary Microbiology 2003 (94) : 183-194)。Kamstrup 等分别用 0RF2DNA 疫苗免疫小鼠，三免后从小鼠血清中能检测到高水平的抗体。以上研究表明Cap蛋白可以诱导机体产生一定水平的抗体，对机体产生免疫保护作用(Immunisation against PCV2 structuralprotein by DNA vaccination of mice. Vaccine 2004 (22):1358-1361)。由于目前尚无有效疫苗用于预防PMWS，因此能研究出一种能有效预防PCV2的疫苗对养猪业生产具有重要的意义。迄今，国外有4种商品化PCV2疫苗相继问世，其中梅里亚动物保健公司研发的PCV2疫苗(Grcovac )为全病毒灭活苗，富道动物保健公司研制的PCV2疫苗(Suvaxyn PCV2)是嵌合病毒灭活苗。而国内由洛阳普莱克生物工程有限公司与南京农业大学联合研制的“圆健”猪圆环病毒灭活疫苗以及由上海海利生物药品有限公司和哈尔滨兽医研究所联合研制的“圆毕净”猪圆环病毒2型灭活疫苗，但由于灭活苗具有对机体刺激时间短，需要多次接种，费用高等缺点，限制了其广泛应用。Mahe和Liu等分别在sf9真核细胞及大肠杆菌中进行了 PCV2Cap蛋白的表达，但Cap蛋白的表达量较低，利用sf9真核细胞及大肠杆菌中进行了 PCV2Cap蛋白的表达的方法无法大量的应用，限制了 PCV2 疫苗的发展(Differential recognition of ORF2 protein from type Iand type2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes.J. Gen. Virol 2000 (81):1815 - 1824 !Characterization of a previously unidentifiedviral protein in porcine circovirus type2-infected cells and its role invirus-induced apoptosis. J. Virol 2005 (79):8262 - 8274)。
发明内容
本发明的目的是提供一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，以提闻猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达量。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，具体步骤如下I)将pET28a-PCV2_0RF2原核表达载体，转化大肠杆菌DH5a，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液提取质粒； 2)将提取的质粒，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液，转接培养；3)在转接培养的菌液中加入IPTG，在IPTG终浓度0. 1-1. Ommlo/L条件下，10-37°C诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达1-8小时；4)取步骤3)不同条件制得的菌液，离心，弃上清液；5)在沉淀中加入loading buffer混勻,沸水浴后迅速冷却；6)离心，得到含有Cap蛋白的上清液。所述的重组表达载体pET28a-PCV2_0RF2两次转化所有的培养基为S0C。所述的选择培养和单克隆液体培养采用的培养基均为LB+1%。Kana0IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0. 6mmol/L,诱导温度30°C,诱导时间6h。本实验室将原核表达载体pET28a-PCV2_0RF2转化大肠杆菌，用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达，并主要研究用IPTG诱导的最佳条件，包括诱导剂量、诱导时间、诱导温度。通过结果分析，表明在最佳诱导条件下能极大提到PCV2-0RF2在原核细胞中的表达量，为开发PCV2基因工程苗和相关研究奠定了良好的基础。
图I为未加入IPTG培养不同时间菌液中猪圆环病毒2型重组Cap蛋白SDS-PAGE图；图2为IPTG不同诱导剂量的菌液中猪圆环病毒2型重组Cap蛋白SDS-PAGE图；图3为IPTG不同诱导时间的菌液中猪圆环病毒2型重组Cap蛋白SDS-PAGE图；图4为IPTG不同诱导温度的菌液中猪圆环病毒2型重组Cap蛋白SDS-PAGE图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆实验室指南(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件。材料备注表PCV2 (HN株)Cap蛋白主要抗原域的pET28a-PCV2_0RF2原核表达质粒。质粒系将0RF2羧基端715bp的基因片段插入pET28a(+)表达载体多克隆位点中，构建方法为常规方法。大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)均由本实验室保存。实施例
本实施例的IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，包括以下步骤I)将pET28a-PCV2_0RF2原核表达载体，转化大肠杆菌DH5a，在LB+1%。Kana选择性培养基上挑取单克隆接种于2ml LB+1%。Kana液体培养基中，37°C，200rpm条件下培养过夜，菌液进行PCR检测，选择带有目的条带的菌液提取质粒；2)将提取的质粒，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，在LB+1%。Kana选择性培养基上培养，挑取单克隆接种于2ml LB+1%。Kana液体培养基中，37°C，200rpm条件下培养过夜，菌液进行PCR检测，选择带有目的条带的菌液；3)将带有目的条带的菌液按1%接种量转接至LB+1%。Kana液体培养基中，37°C，200印111条件下分别培养1、2、3、4、5、611，8000印111离心5111111，弃上清液，将沉淀进行303- 八6￡检测Cap蛋白表达量，得到菌液最佳培养时间为4h，如图I所示。4)选择培养时间4h的菌液进行后续实验。加入浓度400mmol/L的IPTG，分别改
变IPTG诱导剂量、诱导时间、诱导温度，诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达。A、取转接菌液与LB+1%。Kana液体培养基混合液Iml置于离心管中，按照IPTG终浓度 0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. OmmoI/L 的量加入浓度 400mmol/L 的 IPTG，37 °C，200rpm振荡培养4h。分别取500ul菌液，8000rpm离心5min，弃上清液，在每个离心管中加入50ul2. 5X loading buffer混勻，沸水浴IOmin后立即放置在冰上冷却5min ；4°C, IOOOOrpm离心5min，取IOul上清液，SDS-PAGE检测目的蛋白含量，SDS-PAGE图如图2所示。图I和图2比较，发现加入诱导剂IPTG后，目的蛋白表达量明显增多，IPTG最佳诱导剂量为终浓度 0. Bmmol /LB、取转接菌液与LB+1%。Kana液体培养基混合液Iml置于离心管中，按照IPTG终浓度0. 6mmol/L的量加入浓度400mmol/L的IPTG，37 °C，200rpm振荡培养1、2、3、4、5、、6、7、8h。分别取500ul菌液,8000rpm离心5min,弃上清液，在每个离心管中加入50ul2. 5X loading buffer混勻，沸水浴IOmin后立即放置在冰上冷却5min ；4°C, IOOOOrpm离心5min,取IOul上清液，SDS-PAGE检测目的蛋白含量，SDS-PAGE图如图3所示。从图3中可以看出，在IPTG终浓度为0. 6mmol/L，相同诱导温度诱导不同时间，随着时间的延长，目的蛋白表达量逐渐增加，其中，诱导时间6h的目的蛋白表达量最多。C、取转接菌液与LB+1%。Kana液体培养基混合液Iml置于离心管中，按照IPTG终浓度 0. 6mmol/L 的量加入浓度 400mmol/L 的 IPTG，10、20、30、37 °C 条件下，200rpm 振荡培养6h。分别取500ul菌液，8000rpm离心5min，弃上清液，在每个离心管中加入50ul2. 5X loading buffer混勻，沸水浴IOmin后立即放置在冰上冷却5min ；4°C, IOOOOrpm离心5min，取IOul上清液，SDS-PAGE检测目的蛋白含量，SDS-PAGE图如图4所示。从图4中可以看出，在IPTG终浓度为0. 6臟01/1，301诱导611的目的蛋白表达量最多。IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0. 6mmol/L,诱导温度30°C,诱导时间6h。
权利要求
1.一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，其特征在于，具体步骤如下 1)将pET28a-PCV2-0RF2原核表达载体，转化大肠杆菌DH5a，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液提取质粒； 2)将提取的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液，转接培养； 3)在转接培养的菌液中加入IPTG，在IPTG终浓度O.1-1. Ommlo/L条件下，10_37°C诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达1-8小时； 4)取步骤3)不同条件制得的菌液，离心，弃上清液； 5)在沉淀中加入loadingbuffer混勻,沸水浴后迅速冷却； 6)离心，得到含有Cap蛋白的上清液。
2.根据权利要求I所述的一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，其特征在于，所述的重组表达载体pET28a-PCV2-0RF2两次转化所用的培养基为S0C。
3.根据权利要求I所述的一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，其特征在于，所述的选择性培养和单克隆液体培养采用的培养基均为LB+1%。Kana0
4.根据权利要求I所述的一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法，其特征在于，最佳诱导条件为IPTG终浓度O. 6mmol/L，诱导温度30°C，诱导时间6h。
全文摘要
本发明公开了一种IPTG诱导猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达的方法，具体步骤如下将pET28a-PCV2-ORF2原核表达载体，转化大肠杆菌DH5a，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的基因的质粒；再将构建的pET28a-ORF2-DH5a质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过选择性培养、液体培养，加入IPTG，在IPTG终浓度0.1-1.0mmlo/L条件下，10-37℃诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达1-8小时，得到Cap蛋白。其中，最佳诱导条件为IPTG终浓度0.6mmol/L，诱导温度30℃，诱导时间6h。本发明所述的最佳诱导条件能够极大程度提高重组Cap蛋白在大肠杆菌中的表达量，为开发PCV2基因工程苗和相关研究奠定了良好的基础。
文档编号C12N15/34GK102978232SQ20121030299
公开日2013年3月20日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者吴红云, 徐进, 王卫芳 申请人:郑州后羿制药有限公司