转基因水稻pa110-15转化体特异性定量pcr检测引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种转基因材料的定量检测引物，特别涉及一种转基因水稻PA110-15 转化体特异性3'端定量PCR检测引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 目前，关于转基因食品的安全性受到人们越来越广泛的关注，转基因食品的安全 性成了人们较为关注的话题，在市场上出售的粮油，蔬菜，瓜果等农产品也都打出非转基因 的招牌来吸引客户，但是，所购买的食品是否为非转基因食品，是否掺杂了转基因食品，掺 杂的量是多少，普通的消费者无法鉴别。
[0003] 转基因食品中，粮食作物的转基因尤其受到人们的关注。鉴别转基因作物的一个 有效的方法是PCR检测插入基因序列，但是，很多转基因的作物材料转入的基因在其非转 基因亲本中也含有该基因或者该基因的类似基因，会对PCR的结果造成干扰。在应用PCR 技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、 构建特异性方法和转化体特异性方法。转化体特异性检测是通过检测插入载体与植物基因 组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物转化体，都具有特异的外源插入载体与植 物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，转化体特异性具有更高的特异性和准确性，最 适合做转基因产品检测。
[0004] 专利CN201410081539公开了转基因水稻PA110-15转化体特异性PCR检测引物及 定性检测方法和试剂盒。专利CN201410081893公开了转基因水稻PA110-15外源插入片段 旁侧序列及应用。这两个专利都是从转基因水稻PA110-15插入的旁侧序列入手，设计检测 的引物，达到了检测特异性的目的，但是，在实际应用中，消费者不仅要了解其购买的大米 中是否含有该转基因水稻，而且，还要了解是否全部为该转基因大米，或者部分是，掺杂的 量（含量）为多少。目前，这两个专利所设置的引物只能做定性检测，无法实现定量检测。
【发明内容】
[0005] 本发明是为了克服上述现有技术中缺陷，通过筛选得到转基因水稻PA110-15转 化体特异性3'端定量PCR检测引物。
[0006] 定量检测一般采用荧光定量PCR的方法，引物的设计是成败的关键，对于本发明， 计算PCR的特异性引物的荧光量与内参基因荧光量的比值即为转基因水稻的掺入量，为了 使该比值检测接近于真实情况，需要对内参引物和特异性引物进行选择优化，具体，我们是 采用如下方法筛选到合适的内参引物和特异性引物的：1)根据引物设计的基本原则，设计 三组引物；2)采用实验的方法对引物进行评价，筛选出最适合的引物。评价内容：是否有荧 光信号的产生；实时荧光PCR反应体系扩增时，特异性引物和内标准基因引物能构建标准 曲线，且标准曲线的R 2> 0. 98,扩增效率在90%~110%之间；能准确的检测水稻产品中转 基因含量。
[0007] -种转基因水稻PA110-15转化体特异性3'端定量PCR检测引物，所述特异性引 物为：PA110-5-qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示；PA110-5-qR，其核苷酸序列 如序列表SEQ ID No. 2所示；所述特异性引物的探针序列如序列表SEQ ID No. 3所示。
[0008] -种转基因水稻PA110-15转化体特异性的定量检测方法，按照如下步骤进行：
[0009] (1)提取待检测水稻样品的DNA ;
[0010] (2)以提取的水稻样品的DNA为模板，设定水稻内标准基因实时荧光PCR反应体系 和PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系，将上述体系放入96孔PCR板；
[0011] (3)将96孔PCR板放在水平低速离心机中，2000rpm离心30s，然后放入PCR仪中；
[0012] (4)运行实时荧光PCR反应，若特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现， 则证明样品中不含有转基因PA110-15水稻转化体；
[0013] (5)若特异性实时荧光PCR反应体系扩增出目的荧光信号，则证明样品中含有转 基因PA110-15水稻转化体，根据标准梯度样品读取的特异性实时荧光PCR反应的Ct值和 水稻内标准基因实时荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X 轴，绘制标准曲线Ct = kXLg(Copies)+b,分别得到一条内标准标准曲线方程和一条外源 标准曲线方程，再将待测样品中Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数， 然后按下述公式计算转基因含量：样品中转基因PA110-15水稻转化体的含量％ =外源基 因拷贝数/内标准基因拷贝数。
[0014] 所述PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为：无菌水8 y L， 2XTaqMan 反应缓冲液 12.5yL，10ymol/L PA110-3-qF lyL，10ymol/L PA110-3-qR lyL，10ymol/L PA110-3-P 0.5yL，DM 丰莫丰反 2.0yL。
[0015] 所述实时荧光PCR反应的条件为：95°C，5min ;95°(：，158,60°(：，6〇8,45个循环。 [0016]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用实验的方法，筛选到转基 因水稻PA110-15转化体特异性3'端定量PCR检测引物，并配合使用常见的内参引物PLD， 该引物不仅能够定性检测样品水稻中是否含有转基因水稻PA110-15转化体，还能定量检 测其含量，能够全面检测市场上出售大米的转基因产品含量，对人们的选购具有指导意义。
【附图说明】
[0017] 图1是PLD内标基因实时荧光PCR扩增曲线。
[0018] 图2是PLD内标基因实时荧光PCR扩增标准曲线图。
[0019] 图3是PA110-15转化体3'端实时荧光PCR扩增曲线。
[0020] 图4是PA110-15转化体3'端实时荧光PCR扩增标准曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0022] 下述实验采用如下所述的实验材料
[0023] 1、植物材料
[0024] 转基因水稻PA110-15基体标准物质（100% )，转基因水稻PA110-15受体，非转基 因水稻。
[0025] 2、酶与试剂
[0026] Applied Biosystems 的 TaqMaH? Gene Expression Master Mix，天根生化科技 有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物及探针由上海生工合成。
[0027] 3、实验仪器
[0028] 分光光度计：Thermo ND-1000 ;
[0029] 离心机：Thermo Bioguge Primo R，中佳科仪 SC-3610 ;
[0030] 实时荧光定量 PCR 仪：BioRad CFX96 ;
[0031] 其他仪器包括水浴锅，精密天平，通风柜，生物安全柜等。
[0032] 实施例1棺物基因组DNA的提取与检测
[0033] 采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305 (天根生化科技有限公司）进行PA110-15 水稻基因组DNA和普通水稻基因组DNA提取和纯化，提取方法如下：
[0034] 1)取200mg水稻粉末样品；
[0035] 2)加入800 y L 65°C预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混勾，将离心管放在65°C水浴 lh，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
[0036]3)加入等体积酸：氯仿（1:1)，充分混勾，12000rpm离心10min。
[0037] 4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混勾，12000rpm离心10min。
[0038] 5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。
[0039] 6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液（吸附柱容积 700 y L，可分次加入离心）。
[0040] 7)向吸附柱CB3中加入500 y L缓冲液⑶，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附 柱CB3放入收集管中。
[0041] 8)向吸附柱CB3中加入600 y L漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附 柱CB3放入收集管中。
[0042] 9)重复步骤8。
[0043] 10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至 于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0044] 11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60yL 0. 1 X TE缓冲液，室温放置5m