可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白的制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方法和应用，制备方法如下：将SEQ ID NO.3所示序列的第9～1376位核苷酸连接于pET-32(a)+载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌Rosetta、BL21或BL21(DE3)PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，加入IPTG至终浓度为0.2～1.0mmol/L，在温度为20～39℃诱导表达4～12h；制得的I型鸭肝炎病毒3D蛋白为可溶性，并且有免疫原性，能够刺激鸭体产生抗I型鸭肝炎病毒3D蛋白的抗体，能够用作检测I型鸭病毒性肝炎的血清样本或含抗I型鸭肝炎病毒3D蛋白抗体的试剂，对I型鸭病毒性肝炎的诊断和疫苗的研究具有重要意义。
【专利说明】可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方法， 还涉及该蛋白的应用。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上养鸭数量最多的国家，鸭的饲养量约占世界的70%，养鸭业在我 国农业经济中占有重要地位。因此对鸭源微生物进行研究具有重要的社会和经济意义。 鸭肝炎病毒（Duck H印atitis Virus，DHV)可引起雏鸭的鸭病毒性肝炎（Duck Viral H印atitis，DVH)。DVH是一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为 特点。DHV分为3个各自独立的没有血清学关系的血清型：1型、II型和III型。其中，血 清I型鸭肝炎病毒（DHV-I)又称鸭甲型肝炎病毒（Duck h印atitis A virus，DHAV)，是目 前我国流行的主要鸭肝炎病毒，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健 康发展。并且三种血清型均属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，核衣 壳呈20面体对称，直径为20-40nm，无囊膜，胞浆内繁殖，基因组核酸为不分节段的单股正 链RNA，长7000-8500nt，5'非翻译区（5, UTR)末端共价结合VPg，3'非翻译区（3, UTR)末 端含polyA尾，两非翻译区之间是唯一开放阅读框（ORF)，当ORF在宿主细胞中表达出多聚 蛋白后，被病毒自身编码的蛋白酶切割为成熟蛋白。多聚蛋白N段1/3编码结构蛋白P1， 组装成病毒的衣壳；剩下的编码P2和P3非结构蛋白，主要参与对病毒复制所需的相关蛋白 及宿主防御系统等结构和功能的调节，使病毒核酸和蛋白在宿主细胞内完满复制、翻译。P3 编码非结构蛋白3A、3B、3C和3D，3D蛋白是鸭肝炎病毒重要的非结构蛋白，是病毒复制的关 键酶，因此，对I型鸭肝炎病毒的3D进行研究具有重要理论和实际意义。
[0003] 对3D进行研究及应用的基础首先要获得3D蛋白。目标蛋白的获得可采用基因工 程体外表达的方法，目前表达外源基因常用真核和原核系统，真核系统常用昆虫、动物、酵 母和哺乳类细胞等，原核系统则主要利用大肠杆菌且目前广泛使用，但并不是每一种基因 都能在其中进行有效表达，并且大肠杆菌表达易形成不溶性的包涵体，包涵体由于杂蛋白 含量较低、可避免蛋白酶降解、难溶于水等特点而使其易于分离纯化。包涵体的形成原因 多种多样，其中最主要的原因可能是蛋白合成速度太快，没有足够的时间进行正确折叠；另 夕卜，当重组蛋白缺乏翻译后修饰时，也会使中间体大量积累而形成包涵体。包涵体中的目 标蛋白虽然其肽链是完整的，但却是非天然形式、无生物学活性的表达蛋白，包涵体的溶解 非常困难，需要用强变性剂高浓度尿素、SDS等来打断分子内和分子间的非共价键、离子键 等，为获得有活性的蛋白，继而需要进行蛋白复性，而包涵体蛋白溶解后的复性不仅费时、 费力，且复性率低。因此，对3D基因进行体外表达以获得有活性的3D蛋白对I型鸭肝炎病 毒的诊断和基因工程疫苗的研究具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方 法；本发明的目的之二在于提供可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭肝炎病毒 感染鸭血清或含I型鸭肝炎病毒3D抗体的ELISA试剂盒中的应用；本发明的目的之三在于 提供可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备3D蛋白免疫血清中的应用；本发明的目的之四 在于提供利用可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白制备的免疫血清在制备检测I型鸭肝炎病毒 或I型鸭肝炎病毒3D蛋白的试剂中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO. 3所 示序列的第9?1376位核苷酸连接于pET-32 (a) +载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠 杆菌Rosetta、BL21或BL21 (DE3) PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，在IPTG 终浓度为〇. 2?I. Ommol/L、温度为20?39°C条件下诱导表达4?12小时。
[0007] 优选的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)PLYS。
[0008] 优选的，在IPTG终浓度为0. 8mmol/L、温度为25°C条件下诱导表达6小时。
[0009] 优选的，所述活化的具体步骤为：将表达菌株接种于Amp抗性的LB培养基中，在 37°C、120r/min条件下过夜培养，然后将培养液与Amp抗性的LB培养基按体积比为I :100 扩大培养至OD6c?为0. 6即可。
[0010] 更优选的，诱导表达后还包括纯化步骤，具体如下：收集菌液，在12000r/min条件 下离心IOmin后收集菌体，收集的菌体用20mmol/L、pH为8. 0的Tris-HCl悬浮，然后在冰浴 下超声，将破碎后的菌体在4°C、12000r/min条件下离心lOmin，收集上清，上清用Ni 2+-NTA 琼脂糖凝胶柱纯化，透析，用〇. 45 μ m的滤膜超滤得纯化的可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白。
[0011] 最优选的，所述冰浴下超声为在冰浴条件下超声破碎6次，30sec/次，每次之间间 隔 30sec。
[0012] 2、所述方法制得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭肝炎病毒感染 鸭血清或含I型鸭肝炎病毒3D抗体的ELISA试剂中的应用。
[0013] 优选的，所述可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在作为I型鸭病毒性肝炎抗体或I型 鸭肝炎病毒3D蛋白抗体的捕获剂中的应用。
[0014] 3、所述方法制得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备I型鸭肝炎病毒3D蛋白免 疫血清中的应用。
[0015] 4、利用可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白制备的I型鸭肝炎病毒3D蛋白免疫血清在 制备检测I型鸭肝炎病毒或I型鸭肝炎病毒3D蛋白的试剂中的应用。
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明公开了可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方 法，该方法获得的3D蛋白为可溶性的，克服了现有技术容易形成包涵体的缺陷，因此获得 的蛋白是天然的，不需要使用变性剂进行变性、复性获得有活性的蛋白。并且将制得的可溶 性I型鸭肝炎病毒3D蛋白免疫兔后能够获得高免血清，表明该重组蛋白具有免疫原性，能 够刺激兔产生抗3D蛋白的多克隆抗体；此外利用获得的3D蛋白作为抗原包被剂后能够捕 获I型鸭肝炎病毒3D蛋白抗体，因此能够作为诊断I型鸭病毒性肝炎的ELISA试剂，对I 型鸭病毒性肝炎的诊断和基因工程疫苗的研究具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018] 图1为I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因 PCR扩增产物电泳结果（M :DL 2000Marker，I :3D 基因 PCR 扩增产物）。
[0019] 图2为I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因载体构建过程中PCR鉴定和酶切 鉴定结果（A :pJET-l. 2+/DHAV-H-3D 质粒 PCR 鉴定，M :DL2000Marker，I :PCR 产物；B : pJET-1. 2+/DHAV-H-3D 质粒酶切鉴定，M :DL15000Marker，I :Kpn I /Xho I 双酶切条带，2 : Xho I 单酶切条带；C :pET-32(a)+/DHAV-H-3D 质粒的 PCR 鉴定，M :DL2000Marker，I :PCR产 物；D :pET32a+/DHAV-H-3D质粒的酶切鉴定，I :Kpn I /Xho I双酶切结果，2 :Xho I单酶 切条带）。
[0020] 图3为可溶性3D蛋白表达条件的优化（M为低分子量蛋白质标准品；A :表达菌 的筛选，1为pET-32 (a) +空载体表达产物，2-4分别为pET-32 (a) +/DHAV-H-3D重组质粒转 化Rosetta、BL21和BL21 (DE3) PLYS三种不同表达宿主菌的表达产物；B :诱导表达时间的 优化，1-5依次为诱导12h、10h、8h、6h和4h的BL21 (DE3)PLYS宿主菌表达产物；C :诱导表 达温度的优化，1-6 分别为 39°C、37°C、35°C、30°C、25°C和 20°C 的 BL21 (DE3)PLYS 宿主菌 表达产物；D :IPTG 浓度优化，1-5 分别为 0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L 和 I. Ommol/L的IPTG诱导的表达产物。
[0021] 图4为可溶性3D蛋白Western-blot检测及纯化蛋白电泳（A为3D蛋白的免疫印 迹检测结果，M为蛋白质Marker，1为3D蛋白印迹；B为SDS-PAGE检测纯化的3D蛋白，M为 低分子量蛋白质Marker, 1为纯化的3D蛋白）。
[0022] 图5为兔抗可溶性3D蛋白高免血清琼扩效价检测。
[0023] 图6为兔抗3D蛋白高免血清的免疫组化法检测DHAV及3D在免疫鸭肝脏中的分 布（A :免疫组化检测可溶性3D蛋白免疫鸭3D蛋白在肝脏内的分布；B :免疫组化检测DHAV 弱毒苗与可溶性3D蛋白共同免疫鸭3D蛋白在肝脏内的分布；C :免疫组化检测DHAV弱毒苗 免疫鸭3D蛋白在肝脏内的分布；D :免疫组化检测对照鸭肝脏组织（10X60);箭头示特异 性染色）。
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 实施例1、克隆I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因
[0026] I 型鸭肝炎病毒株 H(DHAV-H)(基因组序列见 GenBank :JQ301467)、E. coli DH5 α 菌种和pET-32 (a) +载体均由四川农业大学禽病防治研究中心保存并提供。各种分子生物 学试剂购于生物试剂公司。
[0027] 根据DHAV-H的基因组序列（GenBank JQ301467)设计扩增3D基因的引物，具体引 物如下：
[0028] Pl :5' -ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3' (SEQ ID NO. 1)，下划线表示 Kpn I酶切位点；
[0029] P2 :5' -acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3' (SEQ ID NO. 2)，下划线表不 Xho I酶切位点；然后将设计的引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
[0030] 取保存的DHAV-H病毒液以灭菌PBS作5倍稀释，添加 1/100体积的双抗（青霉 素、链霉素的终浓度分别为l〇〇IU/mL和100yg/mL)后于37°C温育lh，然后接种9日龄发 育良好、无母源抗体的鸭胚,弃去24h内死亡胚，收集24?72h死亡胚的尿囊液及胚体，按 照Trizol试剂盒说明书提取病毒RNA。
[0031] 将提取的病毒RNA反转录合成cDNA，然后以CDNA为模板进行PCR扩增，反转录和 PCR扩增体系如表1所示。
[0032] 表1反转录和PCR反应体系
[0033]
【权利要求】
1. 可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID NO. 3所示序列的第9?1376位核苷酸连接于pET-32 (a) +载体的多克隆酶切位点处，然后 以大肠杆菌R〇setta、BL21或BL21 (DE3) PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后， 在IPTG终浓度为0. 2?1. Ommol/L、温度为20?39°C条件下诱导表达4?12小时。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3) PLYS。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在IPTG终浓度为0. 8mmol/L、温度为 25°C条件下诱导表达6小时。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化的具体步骤为：将表达菌株 接种于Amp抗性的LB培养基中，在37°C、120r/min条件下过夜培养，然后将培养液与Amp 抗性的LB培养基按体积比为1 :100扩大培养至0D_为0. 6即可。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，诱导表达后还包括纯化 步骤，具体如下：收集菌液，在12000r/min条件下离心lOmin后收集菌体，收集的菌体用 20mmol/L、pH为8. 0的Tris-HCl悬浮，然后在冰浴下超声，将破碎后的菌体在4°C、12000r/ min条件下离心lOmin,收集上清，上清用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，透析，用0. 45 μ m的 滤膜超滤得纯化的可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述冰浴下超声为在冰浴条件下超声破 碎6次，30sec/次，每次之间间隔30sec。
7. 权利要求1-6任一项所述方法制得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型 鸭肝炎病毒感染鸭血清或含I型鸭肝炎病毒3D抗体的ELISA试剂盒中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在作 为抗I型鸭肝炎病毒3D蛋白抗体或抗I型鸭病毒性肝炎抗体的捕获剂中的应用。
9. 权利要求1-6任一项所述方法制得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备I型鸭肝 炎病毒3D蛋白免疫血清中的应用。
10. 利用可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白制备的I型鸭肝炎病毒3D蛋白免疫血清在制 备检测I型鸭肝炎病毒或I型鸭肝炎病毒3D蛋白的试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104293823SQ201410604051
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】程安春, 汪铭书, 曹乾大, 陈孝跃 申请人:四川农业大学