一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法，包括以下步骤：(1)引物合成；(2)目的基因的扩增；(3)重组质粒的构建；(4)重组载体在大肠杆菌中的诱导表达；(5)重组蛋白的纯化。本发明利用PCR技术从MRSA基因组中扩增出编码PBP2a转肽酶区的DNA片段，将此目的基因克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上，并利用亲和层析进一步纯化出较高纯度的蛋白，为研发针对该蛋白的检测方法奠定了基础。
【专利说明】-种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表 达及纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽 酶区的原核表达及纯化方法。
【背景技术】
[0002] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是引起院内外感染的重要病原菌，也是细菌耐药性的主要监测对象，严重威胁着人类 健康。MRSA不仅对包括甲氧西林在内的绝大多数β-内酰胺类抗生素耐药，而且对氨基糖 苷类、大环内酯类、四环素类、磺胺类等多种抗生素也具有不同程度的耐药性。目前研究表 明，MRSA的主要耐药机制与其含有的一种特殊的青霉素结合蛋白PBP2a有关，PBP2a由耐药 基因 mecA编码，含有668个氨基酸，相对分子质量约78kD，锚定于细胞膜表面，与β -内酰 胺类抗生素有较低的亲和力。该蛋白由N-末端跨膜区、非青霉素结合区和转肽酶区三部分 组成，其中转肽酶区是其行使其功能的主要区域。PBP2a蛋白是所有MRSA共有特征蛋白，可 作为疫苗开发的靶抗原。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法，该方法利用PCR技术从MRSA基因组中扩增出编 码PBP2a转肽酶区的DNA片段，将此目的基因克隆至pGEX-6p-l原核表达载体上，并利用亲 和层析进一步纯化出较高纯度的蛋白，为研发针对该蛋白的检测方法奠定了基础。
[0004] 其具体技术方案为：
[0005] -种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法，其特征 在于，包括以下步骤：
[0006] (1)引物合成
[0007] 根据Genbank中mecA基因序列，利用Primer5. 0软件设计针对转肽酶区基因的 引物，上游引物：5, -CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG-3'，下游引物：5' -CCCGAATTCA TTCATCTATATCGTATTTTTTATTA-3 '，在上游引物5 '端引入BamH I酶切位点，在下游引物5 ' 端引入EcoR I酶切位点，由南京金斯瑞生物科技有限公司负责合成；预期PCR产物大小为 1026bp ；
[0008] (2)目的基因的扩增
[0009] 将临床分离的MRSA菌株接种于新鲜LB培养基中，过夜培养，取3mL菌液12000g 离心5min，弃上清，用细菌基因组提取试剂盒提取MRSA基因组DNA ;以MRSA基因组为模板， 进行PCR反应；PCR反应条件：94°C预变性4min ;94°C变性30s，50°C退火30°C，72°C延伸 lmin，进行30个循环；72°C延伸8min ;取反应产物5μ L，在I. 0%琼脂糖凝胶中，IOOV电压 下电泳40min，用凝胶成像系统分析结果；
[0010] (3)重组质粒的构建
[0011] 上述的PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒进行回收，与pMD19-T载体连接，连接产物 转化E.coli DH5a感受态细胞，涂布LB平板（含41^、1?了631&1)，371：培养12?1611; 挑取白色克隆，接种到含氨苄的LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜，提取质粒，经PCR及 双酶切验证正确后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序；
[0012] 将测序正确的pMD19-T_mecAf质粒和pGEX_6p_l空质粒分别用BamH I、EcoR I进 行双酶切，胶回收目的基因片段和空质粒片段，连接，转化E. coli DH5a感受态细胞，涂布 氨苄平板；挑取若干克隆，用菌落PCR方法鉴定；过夜培养鉴定为阳性的克隆，提取质粒，进 行双酶切鉴定及测序验证；
[0013] (4)重组载体在大肠杆菌中的诱导表达
[0014] 将验证正确的重组质粒转化表达菌株E. coli BL21，挑取单个菌落，接种至含有氨 苄的LB培养基中，37°C震荡培养过夜；经菌液PCR验证后，以1/100接种量接种于新鲜的含 有氨苄抗生素的LB培养基中，，37°C震荡培养至OD为0. 6,加 IPTG至终浓度为0. lmmol/L， 诱导3?4h，取ImL培养液离心收集细菌，重悬于50 μ L PBS缓冲液中，加入等体积2 X上 样缓冲液l〇〇°C煮沸5min，取10 μ L样品进行SDS-PAGE分析；
[0015] (5)重组蛋白的纯化
[0016] 将过夜培养的菌液以1/100接种量接种于500mL新鲜的含有氨苄青霉素的LB培 养基中，37°C震荡培养至OD为0. 6,加 IPTG至终浓度为0. lmmol/L，28°C诱导8h，将菌液于 6000r/min离心30min后收集菌体，用20mL PBS重悬菌体，于冰上超声破碎细胞（参数：时 间IOmin,功率30 %，超声开5sec，超声间歇5sec);结束后与高速冷冻离心机12000rpm, 4°C离心30min，小心吸出上清；取裂解上清IOmL,用0. 45um的滤膜过滤，与ImL ProteinIso GST Resin填料混合，于混匀器上翻转过夜，使蛋白与填料充分结合；次日将混合物填装重 力层析柱，用30倍床体积的PBS洗脱杂蛋白，用1倍柱体积的洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl， IOmM还原性谷胱甘肽，pH 8. 0)洗脱目的蛋白3次，分别收集洗脱液；纯化前和纯化后的产 物进行SDS-PAGE，分析纯化效果。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明应用PCR技术扩增获得了编码 PBP2a转肽酶区的基因片段，并克隆进pGEX-6p-l表达载体中，经条件优化确定在0D600为 0. 6时加入终浓度为0. lmmol/L IPTG进行诱导，28°C震荡培养8h时PBP2a重组蛋白表达 量及蛋白可溶性较好。利用蛋白亲和层析柱纯化重组蛋白，并最终获得了较高纯度的重组 蛋白。Western blot结果显示目标蛋白在E. coli中获得了高效表达。PBP2a转肽酶区蛋 白的高效表达和纯化，为进一步制备单克隆抗体，建立MRSA快速检测方法奠定了较好的基 础。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为目的基因 PCR扩增结果，M :DNA标准Marker ;1 :mecA基因片段PCR扩增结 果；
[0019] 图2为重组质粒的酶切鉴定结果，M :DNA标准Marker ;1 :BamH I、EcoR I双酶切 重组质粒；
[0020] 图3为重组蛋白的诱导表达与纯化，M :蛋白标准Marker ;1 :经IPTG诱导的空质粒 转化菌；2 :未诱导的重组质粒转化菌；3 :经IPTG诱导的重组质粒转化菌；4 :纯化的重组蛋 白；
[0021] 图4为重组表达蛋白的Western-Blot检测结果，1 :蛋白质标准Marker ;2 :经IPTG 诱导的空质粒；3 :纯化的重组蛋白。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0023] 1材料与方法
[0024] 1.1质粒、菌株和试剂
[0025] MRSA菌株纯化自西京医院败血病病人血液；pGEX-6p_l表达载体由西北工业大 学生命学院微生物与免疫实验室保存；PMD19-T载体、限制性内切酶BamH I、EcoR I、DNA Ligation Kit Ver. 2. 1 购自 TaKaRa 公司；T4DNA Ligase 购自 Promega 公司；克隆菌株 E. coli DH5a、表达菌株E. coli BL21、DNA Marker 1Kb、蛋白亲和层析柱购自全式金生物 科技公司；细菌基因组提取试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、胶回收纯化试剂盒购自天根生化 科技公司；
[0026] 1. 2实验方法
[0027] L 2.1引物合成
[0028] 根据Genbank中mecA基因序列，利用Primer5. 0软件设计针对转肽酶区基因的引 物，上游引物：5, -CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG-3'，下游引物：5' -CCCGAATTCATTC ATCTATATCGTATTTTTTATTA-3 '，在上游引物5 '端引入BamH I酶切位点，在下游引物5 '端 引入EcoR I酶切位点，由南京金斯瑞生物科技有限公司负责合成。预期PCR产物大小为 1026bp〇
[0029] 1.2. 2目的基因的扩增
[0030] 将临床分离的MRSA菌株接种于新鲜LB培养基中，过夜培养，取3mL菌液12000g离 心5min，弃上清，用细菌基因组提取试剂盒提取MRSA基因组DNA。以MRSA基因组为模板， 进行PCR反应。PCR反应条件：94°C预变性4min ;94°C变性30s，50°C退火30°C，72°C延伸 lmin，进行30个循环；72°C延伸8min。取反应产物5 μ L，在1. 0%琼脂糖凝胶中，IOOV电压 下电泳40min，用凝胶成像系统分析结果。
[0031] 1.2. 3重组质粒的构建
[0032] 上述的PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒进行回收，与pMD19-T载体连接，连接产物 转化E.coli DH5a感受态细胞，涂布LB平板（含41^、1?了631&1)，371：培养12?1611。 挑取白色克隆，接种到含氨苄的LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜，提取质粒，经PCR及 双酶切验证正确后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
[0033] 将测序正确的pMD19-T_mecAf质粒和pGEX_6p_l空质粒分别用BamH I、EcoR I进 行双酶切，胶回收目的基因片段和空质粒片段，连接，转化E. coli DH5a感受态细胞，涂布 氨苄平板。挑取若干克隆，用菌落PCR方法鉴定。过夜培养鉴定为阳性的克隆，提取质粒， 进行双酶切鉴定及测序验证。
[0034] 1.2. 4重组载体在大肠杆菌中的诱导表达
[0035] 将验证正确的重组质粒转化表达菌株E. coli BL21，挑取单个菌落，接种至含有氨 苄的LB培养基中，37°C震荡培养过夜。经菌液PCR验证后，以1/100接种量接种于新鲜的 含有氨苄抗生素的LB培养基中，，37°C震荡培养至OD为0. 6,加 IPTG至终浓度为0. lmmol/ L，诱导3?4h，取ImL培养液离心收集细菌，重悬于50 μ L PBS缓冲液中，加入等体积2 X 上样缓冲液l〇〇°C煮沸5min，取10 μ L样品进行SDS-PAGE分析。
[0036] 1. 2. 5重组蛋白的纯化
[0037] 将过夜培养的菌液以1/100接种量接种于500mL新鲜的含有氨苄青霉素的LB培 养基中，37°C震荡培养至OD为0. 6,加 IPTG至终浓度为0. lmmol/L，28°C诱导8h，将菌液于 6000r/min离心30min后收集菌体，用20mL PBS重悬菌体，于冰上超声破碎细胞（参数：时 间IOmin,功率30 %，超声开5sec，超声间歇5sec)。结束后与高速冷冻离心机12000rpm，4°C 离心30min，小心吸出上清。取裂解上清IOmL,用0. 45um的滤膜过滤,与ImL ProteinIso GST Resin填料混合，于混匀器上翻转过夜，使蛋白与填料充分结合。次日将混合物填装重 力层析柱，用30倍床体积的PBS洗脱杂蛋白，用1倍柱体积的洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl， IOmM还原性谷胱甘肽，pH 8.0)洗脱目的蛋白3次，分别收集洗脱液。纯化前和纯化后的产 物进行SDS-PAGE，分析纯化效果。
[0038] 1. 2. 6 重组蛋白的 Western Blotting 检测
[0039] 将重组蛋白在12%分离胶，5%浓缩胶中进行SDS-PAGE电泳，用湿转法转移印记 到 PVDF 膜上后，TBST(NaCL 8g/L，KCL 0.2g/L，Tris Base 3g/L，Tween200.05%，pH7.4)配 置的5%脱脂牛奶封闭lh，将膜与I : 2000稀释的鼠抗His单克隆抗体共同4°C孵育过夜， TBST洗膜3次，每次5min。将膜与1 : 2000稀释的羊抗鼠二抗IgG-HRP共同室温孵育lh， TBST洗膜3次，每次5min。加入ECL化学发光液，于暗室中用X光片曝光数秒至数分钟，显 影出理想条带，定影水洗后分析结果。
[0040] 2 结果
[0041] 2. 1目的基因的PCR扩增
[0042] 以MRSA基因组为模板扩增出的PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳可见IOOObp左右 有清晰的条带（图1)，与预期的MRSA青霉素结合蛋白2a转肽酶区编码基因大小相符。
[0043] 2. 2重组表达载体的构建及酶切鉴定
[0044] 重组质粒pGEX-6p-l-mecAf经BamH I、EcoR I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳在预期 位置出现清晰条带（图2)，且序列测定结果与预期完全一致，表明已经成功构建重组表达 载体 pGEX-6p-l_mecAf。
[0045] 2. 3重组蛋白的诱导表达和纯化
[0046] 在重组载体中目的基因与GST-tag基因融合表达，融合标签的分子量约为26kD， 目的蛋白约为37kD，所以表达出的重组蛋白分子量约为63kD。经IPTG诱导后，获得的表达 蛋白大小与所预期的一致（图3)。利用亲和层析法纯化后，该位置可见单一清晰条带，基本 无杂蛋白条带。
[0047] 2· 4重组蛋白的Westen Blot检测
[0048] Western blotting显示pGEX-6p-l_mecAf的纯化样品在相对分子质量63kD处出 现了清晰的显色条带（图4)，证实目标蛋白在E. coli中成功获得大量表达。
[0049] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 引物合成 根据Genbank中mecA基因序列，利用Primer5. 0软件设计针对转肽酶区基因的引物， 上游引物：5' -CGGGATCCACTAITGATGCTAAAGITCAAAAG-3'，下游引物：5' -CCCGAAITCAITCA TCTATATCGTATTTTTTATTA-3 '，在上游引物5 '端引入BamH I酶切位点，在下游引物5 '端 引入EcoR I酶切位点，由南京金斯瑞生物科技有限公司负责合成；预期PCR产物大小为 1026bp ； (2) 目的基因的扩增 将临床分离的MRSA菌株接种于新鲜LB培养基中，过夜培养，取3mL菌液12000g离心 5min，弃上清，用细菌基因组提取试剂盒提取MRSA基因组DNA ;以MRSA基因组为模板，进行 PCR反应；PCR反应条件：94°C预变性4min ;94°C变性30s，50°C退火30°C，72°C延伸lmin， 进行30个循环；72°C延伸8min ;取反应产物5 ii L，在1. 0%琼脂糖凝胶中，100V电压下电泳 40min，用凝胶成像系统分析结果； (3) 重组质粒的构建 上述的PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒进行回收，与pMD19-T载体连接，连接产物转化 E.coli DH5a感受态细胞，涂布LB平板（含41^、1?了6、乂1&1)，371：培养12?1611;挑取 白色克隆，接种到含氨苄的LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜，提取质粒，经PCR及双酶 切验证正确后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序； 将测序正确的pMD19-T-mecAf质粒和pGEX-6p-l空质粒分别用BamH I、EcoR I进行双 酶切，胶回收目的基因片段和空质粒片段，连接，转化E.coli DH5 a感受态细胞，涂布氨苄 平板；挑取若干克隆，用菌落PCR方法鉴定；过夜培养鉴定为阳性的克隆，提取质粒，进行双 酶切鉴定及测序验证； (4) 重组载体在大肠杆菌中的诱导表达 将验证正确的重组质粒转化表达菌株E. coli BL21，挑取单个菌落，接种至含有氨苄的 LB培养基中，37°C震荡培养过夜；经菌液PCR验证后，以1/100接种量接种于新鲜的含有氨 苄抗生素的LB培养基中，，37°C震荡培养至0D为0. 6,加IPTG至终浓度为0. lmmol/L，诱导 3?4h，取lmL培养液离心收集细菌，重悬于50 y L PBS缓冲液中，加入等体积2 X上样缓 冲液100°C煮沸5min，取10 y L样品进行SDS-PAGE分析； (5) 重组蛋白的纯化 将过夜培养的菌液以1/100接种量接种于500mL新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养 基中，37°C震荡培养至0D为0. 6,加IPTG至终浓度为0. lmmol/L，28°C诱导8h，将菌液于 6000r/min离心30min后收集菌体，用20mL PBS重悬菌体，于冰上超声破碎细胞（参数：时 间lOmin，功率30 %，超声开5sec，超声间歇5sec);结束后与高速冷冻离心机12000rpm, 4°C离心30min，小心吸出上清；取裂解上清10mL，用0. 45um的滤膜过滤，与lmL Proteinlso GST Resin填料混合，于混匀器上翻转过夜，使蛋白与填料充分结合；次日将混合物填装重 力层析柱，用30倍床体积的PBS洗脱杂蛋白，用1倍柱体积的洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl， 10mM还原性谷胱甘肽，pH 8. 0)洗脱目的蛋白3次，分别收集洗脱液；纯化前和纯化后的产 物进行SDS-PAGE，分析纯化效果。
【文档编号】C12N15/70GK104404010SQ201410603918
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】杨慧, 李冀, 黄庆生, 师俊玲, 唐蕊华, 李晶, 车速, 刘亚雄, 叶琳洁, 邵燕 申请人:西北工业大学