Rt-lamp法检测玉米褪绿斑驳病毒用引物组及检测体系的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)用引物组及检测体系。
【背景技术】
[0002]玉米褪绿斑驳病毒{Maize chlorotic mottle virus , ΜΟΜ?)是我国颁布的禁止进境的检疫性有害生物。是一种直径30mm二十面体，正单链RNA植物病毒，它属于番前丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属((Machlomoviru)，可通过昆虫介体和种子传播。该病毒的自然寄主有玉米、小麦、黍、大麦等。寄主被侵染后，症状表现为褪绿斑驳、坏死、矮化、穗发育差或无穗、过早死亡等症状。玉米褪绿斑驳病毒可引起10% -15%的产量损失，实验的玉米损失达59%，同时可与小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV),甘鹿花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SvMV)或玉米矮花叶病毒(Maize dwarfmosaic virus，MDMV)复合侵染，形成玉米致死性坏死病(maize lethal necrosis, MLN),可造成平均高达75%的产量损失，给玉米带来毁灭性灾害。
[0003]该病毒主要分布于阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国(堪萨斯州、内布拉斯加州、夏威夷)等地。目前，我国仅云南省有该病毒发生的报道。随着玉米产业的迅速发展，种植者及加工企业对优良品种的需求越来越大，跨国种子企业试图进入玉米等种业市场的要求越来越强烈。我国近年来玉米种子的国际贸易越来越频繁，使其传入的风险也越来越大，该病毒一旦发生，将导致我国的玉米经济损失高达140亿元人民币。国内学者对该病毒的研究较少，因此相关资料及其防治经验很少。
[0004]目前，玉米褪绿斑驳病毒的检测主要采用血清学和RT-PCR的方法，这些方法历时较长，且依赖于昂贵的仪器设备。近年来发展起来的反转录环介导等温扩增反应(RT-LAM)是Notomi等于2000年首次提出并在其后经过不断改进形成的一种新的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和链置换DNA聚合酶(Bst酶)在恒温条件保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点。
【发明内容】
[0005]本发明目的之一在于提供一种RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒用引物组。
[0006]本发明的目的之二在于提供及RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒用检测系统。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒用引物组，其特征在于该引物组为SEQ IDN0:2?SEQ ID NO:6所示的碱基序列。
[0008]一种RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒用检测体系，采用根据上述的引物组，其特征在于每25yL的检测体系中有:2 X LAMP通用反应缓冲液12.5 μ L，20 μ M上游外引物0.25 μ L，20 μ M下游外引物0.25 μ L，20 μ M上游内引物2 μ L，20 μ M下游内引物2 μ L，20 μM上游环引物I μ L，RNA模板溶液I μ L，(8U/ μ DBst酶为L 2 μ L，(5U/ μ L) AMV反转录酶为I μ L，用ddH20补充至总体积25 μ L0
[0009]上述2 X LAMP 通用反应缓冲液的配方为:40 mM Tris-HCl (ph8.8), 20 mM KCl，20 mM (NH4)2SO4, 4 mM MgSO4,0.2% Triton X-100,2.4 mM dNTP，1.6 M 甜菜碱。
[0010]本发明根据报道的登录号为EU358605.1的第0-600位核苷酸序列设计扩增引物，核酸序列为SEQID NO:1所示的序列。
[0011]用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)从带有玉米褪绿斑驳病毒的玉米叶片及购买的阳性病毒中以及阴性病毒中提取总RNA，然后进行玉米褪绿斑驳病毒的RT-LAMP反应。根据凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有玉米褪绿斑驳病毒；判断的方法具体如下:如果电泳结果出现梯形扩增条带，则说明样品中含有玉米褪绿斑驳病毒；反之，如果电泳结果没有出现相应的梯形扩增条带，则说明样品中不含有玉米褪绿斑驳病毒。
[0012]所述具体引物组为:上游外引物MCMV-F3的序列如SEQ ID NO: 2所示，下游外引物MCMV-B3的序列如SEQ ID NO: 3所示；上游内引物MCMV-FIP的序列如SEQ ID NO:4 PJf示；下游内引物MCMV-BIP的序列如SEQ ID NO:5所示；上游环引物MCMV-LF的序列如SEQID NO:6 所示；
上游外引物MCMV-F3基因，即SEQ ID NO: 2所示序列的序列特征为:
*长度:20bp *类型:核酸 *链型:单链 *拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成
下游外引物MCMV-B3基因，即SEQ ID NO: 3所示序列的序列特征:
*长度:18bp *类型:核酸 *链型:单链 *拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成
上游内引物MCMV-FIP基因，即SEQ ID NO:4所示的的序列特征:
*长度:45bp *类型:核酸 *链型:单链 *拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成
下游内引物MCMV-BIP基因，即SEQ ID NO:5所示的的序列特征:
*长度:44bp *类型:核酸 *链型:单链 *拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成
上游环引物MCMV-LF基因，即SEQ ID NO:6所示的序列特征:
*长度:20bp *类型:核酸 *链型:单链 *拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成
RT-LAMP反应中，RT-LAMP检测体系的反应条件为64°C反应45min，80°C灭活5min。RT-LAMP产物电泳检测为:取6 μ L RT-PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
[0013]本发明的优点和有益效果:对本发明的引物的特异性和灵敏度进行分析的结果，4株玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品均出现梯形条带，而4株阴性病毒及空白试验都未出现梯形条带。证明该引物具有良好的特异性。通过对引物灵敏度分析，该特异引物的灵敏度较高，因此在样品量较少或者病毒含量在样品组织中含量很低的情况下，也能用该引物组检测。所述RT-LAMP技术检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，是基于对病毒的第0-600位核苷酸序列分析设计的特异性反转录引物的检测方法，在植物病毒检测上具有快速、灵敏、特异性强的特点。
【附图说明】
[0014]图1为实施例2中RT-LAMP检测方法特异性评价凝胶电泳图；图1中1-4为玉米褪绿斑驳病毒，5为玉米矮花叶病毒，6为香石竹环斑病毒，7为齿兰环斑病毒，8为黄瓜绿斑驳病毒，9为RT-LAMP阴性对照，M为600bp的DNA Marker。
[0015]图2为实施例3中RT-LAMP检测方法灵敏度评价凝胶电泳图；图2中，泳道1-5RNA的浓度分