别为:40ng/ μ L，4ng/ μ L，400Pg/ μ L，40pg/ μ L，4pg/ μ L，泳道 8 为 ddH20，泳道 M为 600bp 的 DNA Marker。
【具体实施方式】
[0016]结合具体的实施例，进一步进行阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。所述试剂盒生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。引物由上海生物工程公司合成，AMV逆转录酶购自大连TaKaRa公司，Bst酶购自NEB (北京)有限公司，RNA提取试剂盒购自天根科技生化有限公司。
[0017]实施例1:一种玉米褪绿斑驳病毒RT-LAMP检测方法，包括以下步骤:
步骤1，引物设计和合成
利用Primer Explorer 3.0软件根据玉米褪绿斑驳病毒的第0-600位核苷酸序列设计I组寡核苷酸引物，上游外引物MCMV-F3，下游外引物MCMV-B3，上游内引物MCMV-FIP，下游内引物MCMV-BIP以及上游环引物MCMV-LF。
[0018]上游外引物及其序列为:
MCMV-F3 (SEQ ID NO:2):5’-ACGCGTTAGACACGACCTTA-3’
下游外引物及其序列为:
MCMV-B3 (SEQ ID NO:3):5’-CCTCAAGGCTTGGACCAC-3’
上游内引物及其序列为:
MCMV-FIP (SEQ ID NO:4):5’-AACCTGATTGCCAGTCAGGGGTTTTTGACTCACGTCTTGCATCCT-3’下游内引物及其序列为:
MCMV-BIP (SEQ ID NO:5):5’-CTCCCTGCACTTATGGCGACCTTTTCTTCCGTTCCTCCGAGAAC-3’上游环引物及其序列为:
MCMV-LF (SEQ ID NO:6):5’-TCCCACGTTAGAGCTCTCAC-3’
步骤2，总RNA的提取
用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取其总RNA。
[0019]步骤3，玉米褪绿斑驳病毒RT-LAMP检测方法的建立
第一步 2 X LAMP 通用反应缓冲液的配制:40 mM Tris-HCl (ph8.8)，20 mM KCl ,20 mM(NH4)2SO4,4 mM MgSO4,0.2% TritonX-100, 2.4 mM dNTP, 1.6 M 甜菜碱。
[0020]第二步进行RT-LAMP扩增。PCR检测体系为:25 μ L的RT-LAMP反应体系:2 X LAMP 通用反应缓冲液12.5 μ L，20 μ M上游外引物0.25 μ L，20 μ M下游外引物0.25 μ L，
20 μ M上游内引物2 μ L，20 μ M下游内引物2 μ L，20 μ M上游环引物I μ LRNA模板溶液I μ L，(8U/ μ DBst酶为1.2 μ L，(5U/ μ L)AMV反转录酶为I μ L，用ddH20补充至总体积25 μ L0具体反应参数为:64° C反应45min，80°C灭活5min，RT-LAMP扩增结束。
[0021]第三步凝胶电泳检测扩增产物。取RT-LAMP扩增产物6 μ L进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察、拍照。以是否产生梯形条带来判定样品中是否含有玉米褪绿斑驳病毒。
[0022]实施例2:玉米褪绿斑驳病毒RT-LAMP的特异性检测
取4株不同来源带有玉米褪绿斑驳病毒的玉米叶片(来自上海出入境检验检疫局)及阴性病毒(玉米矮花叶病毒、香石竹环斑病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒购自Agdia公司)按实施例1方法提取总RNA、进行RT-LAMP，凝胶电泳检测结果。结果如图1所示。
[0023]实施例3:玉米褪绿斑驳病毒RT-PCR的灵敏性试验
按实施例1方法提取玉米褪绿斑驳病毒的总RNA后，经超微量分光光度计测量，RNA的起初浓度约为40ng/ μ L0将上述测定的玉米褪绿斑驳病毒的总RNA溶液用RNase-free去离子水10倍梯度稀释，从40ng/ μ L-4pg/ μ L的RNA溶液分别取I μ L进行RT-LAMP的灵敏度检测。RT-LAMP检测结果如图2所示。扩增结果如图2所示，在第3条泳道可以看到清晰的条带。所对应RNA的浓度为400pg/μ L，而第4条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定该特异性引物组 MCMV-F3 (SEQ ID NO: 2)，MCMV-B3 (SEQ ID NO: 3)，MCMV-FIP (SEQ IDNO:3)，MCMV-BIP (SEQ ID NO:5)和 MCMV-LF (SEQ ID Ν0:6)能检测到的最低 RNA 浓度的灵敏度为400pg/ μ L，引物具有较高的灵敏度。
【主权项】
1.一种RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒用引物组，其特征在于该引物组为SEQ IDN0:2?SEQ ID NO:6所示的碱基序列。2.一种RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒用检测体系，采用根据权利要求1所述的引物组，其特征在于每25 μ L的检测体系中有:2XLAMP通用反应缓冲液12.5μ?，20μΜ上游外引物0.25 μ L，20 μ M下游外引物0.25 μ L，20 μ M上游内引物2 μ L，20 μ M下游内引物2 μ L，20 μ M 上游环引物 I μ L，RNA 模板溶液 I μ L，(8U"L)Bst 酶为 1.2 μ L，(5U/μ L)AMV反转录酶为I μ L，用ddH20补充至总体积25 μ L03.根据权利要求2所述的检测体系，其特征在于所述2XLAMP通用反应缓冲液的配方为:40 mM Tris-HCl (ph8.8)，20 mM KCl ,20 mM (NH4)2SO4, 4 mM MgSO4,0.2% TritonX-100,2.4 mM dNTP, 1.6 M 甜菜碱。
【专利摘要】本发明涉及一种RT-LAMP法检测玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）用引物组及检测体系，该引物组为SEQ？ID？？NO:2～SEQ？ID？NO:6？所示的碱基序列。该方法具有良好的特异性、灵敏性高。适合玉米褪绿斑驳病毒的快速准确的检测。对本发明的引物的特异性和灵敏度进行分析的结果，4株玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品均出现梯形条带，而4株阴性病毒及空白试验都未出现梯形条带。证明该引物具有良好的特异性。通过对引物灵敏度分析，该特异引物的灵敏度较高，因此在样品量较少或者病毒含量在样品组织中含量很低的情况下，也能用该引物组检测。所述RT-LAMP技术检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，是基于对病毒的第0-600位核苷酸序列分析设计的特异性反转录引物的检测方法，在植物病毒检测上具有快速、灵敏、特异性强的特点。
【IPC分类】C12R1/94, C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105132587
【申请号】CN201510590281
【发明人】刘战民, 夏雪影, 杨翠云
【申请人】上海大学, 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月17日