一种猪流行性腹泻病毒s全基因扩增测序的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒S全基因扩增测序的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的，以猪呕吐，严重腹泻脱水为主要临床 症状特征的高度接触性传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪、断奶仔猪和 育肥猪发病率可达100%，死亡率高达95%以上。近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋 势，危害比较严重，给养猪业带来巨大经济损失，已成为中国甚至世界最常见的猪腹泻传染 病之一。
[0003] PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为不分节段的单股正链 RNA，基因组全长约28033bp，编码的结构蛋白主要有纤突（spike)蛋白（即S蛋白），囊膜 (Membrane)蛋白（即M蛋白），核衣壳（nucleocapsid)蛋白（即N蛋白）。
[0004] PEDV的S蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，由1383个氨基酸组成，有29个 潜在的糖基化位点，与其他的冠状病毒S蛋白结构类似。PEDV S蛋白可以被划分为2个功 能区即S1 (第1-789位氨基酸）和S2(第790-1383位氨基酸），其中S1区包含了病毒主 要的中和表位和受体结合域，主要识别特异性受体，不同冠状病毒对不同宿主进行感染， 所以S1具有多样性。S2段主要负责结合后的融合，在所有冠状病毒中都相对保守。不同 的冠状病毒S基因间的同源性较低；在PEDV内部，不同的毒株间S基因的变异性也很大。 S基因作为主要的结构基因，在病毒与受体结合、细胞融合以及中和抗体的产生等方面起着 重要的作用。由于受到宿主免疫选择的压力，S蛋白易发生变异，因此常被用来研究不同年 代和地点病毒之间的亲缘关系。在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细 胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要的生物学作用。
[0005] 同时，前期的研究表明，相比对于部分S基因的分析，S基因全长更能准确的对 PEDV进行分类，并且对S基因全长的分析有利于了解病毒的进化规律。李春英等将S基因 的全长分为5个相互重叠的基因片段，设计了 5对引物进行扩增；孙东波等将S基因的全长 分为3个相互重叠的基因片段，设计了 3对引物进行扩增。另外，何鑫（猪流行性腹泻病毒 的分离鉴定及其S基因和N基因的序列分析，四川大学2012年硕士学位论文）设计S1引 物和S2引物，而拼接后没有得到完整的S基因。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒S全基 因扩增的方法。
[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0008] -种猪流行性腹泻病毒S全基因扩增测序的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)提取猪流行性腹泻病毒RNA ;
[0010] 2)RT-PCR扩增：采用如SEQ ID No. 1所示上游引物和如SEQ ID No. 2所示下游引 物，对步骤1)提取的RNA进行RT-PCR扩增，得到SCX1引物PCR产物，为SCX1基因片段；采 用如SEQ ID No. 3所示上游引物和如SEQ ID No. 4所示下游引物，对步骤1)提取的RNA进 行RT-PCR扩增，得到SCX2引物PCR产物，为SCX2基因片段；
[0011]3)基因片段回收：将步骤2)所得的SCX1基因PCR产物和SCX2基因PCR产物进 行核酸电泳，回收SCX1基因片段和SCX2基因片段，并测序；
[0012] 4)拼接：将步骤3)获得的SCX1基因片段与SCX2基因片段进行拼接，得到猪流行 性腹泻病毒S全基因，测序。
[0013] 作为优选，步骤1)中，取病料经2000rpm离心5min，-20°C反复冻融2-3次，采用 E. Z. N. A. Viral RNA Kit提取试剂盒提取病料的RNA。
[0014] 作为优选，步骤1)中，取PEDV的细胞培养物上清液，-20°C反复冻融2-3次，采用 E. Z. N. A. Viral RNA Kit提取试剂盒提取病料的RNA。
[0015] 作为优选，步骤2)中，所述RT-PCR扩增的反应体系：2 y L PrimeScript lstep Enzyme Mix，25 yL 2Xlstep buffer，lyL 上游引物（20uM/iiL) ;lyL 下游引物（20uM/ y L);1 y L 模板 RNA ;ddH20 补足至 50 y L。
[0016] 作为优选，步骤2)中，所述RT-PCR扩增的反应程序：50°C 30min，94°C 2min; 94°C 30s，55°C 30s, 72°C 2min30s，设置 30 个循环。
[0017]作为优选，步骤 2)中，采用 Prime Script One Step RT-PCR kit Ver. 2 试剂盒进 行RT-PCR扩增。
[0018] 作为优选，步骤4)中，去除步骤3)获得的SCX1基因片段与SCX2基因片段的重复 碱基，进行拼接。
[0019] 本方法的目的之二在于提供上述的方法在定性检测猪流行性腹泻病毒中的应用。
[0020] 本方法的目的之三在于提供上述的方法在猪流行性腹泻病毒同源性分析中的应 用。
[0021] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0022] 1.本发明使用2对重叠引物扩增S基因，较之前使用3对或是5对基因，更加方便 简捷，成本低廉；
[0023] 2.本方法可以更快的扩增到S基因的全序列，有利于对所扩增的PEDV毒株进行分 类，同时有利于对S全长基因的分析以及了解病毒的进化规律。
[0024] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0025] 图1为RT-PCR凝胶电泳图：其中M泳道为Marker，SCX1泳道为SCX1基因为扩增 产物；SCX2泳道为SCX2基因的扩增产物；
[0026] 图2为RT-PCR扩增范围图谱；
[0027] 图3为PEDV S基因的核苷酸同源性比较图；
[0028] 图4为PEDV S基因的系统发育进化树。
【具体实施方式】
[0029] 本发明提供一种猪流行性腹泻病毒S全基因扩增测序方法，包括以下步骤：
[0030] 1)提取猪流行性腹泻病毒RNA :提取病料的RNA ;
[0031] 2)RT-PCR扩增：采用如SEQ ID No. 1所示上游引物和如SEQ ID No. 2所示下游引 物，对步骤1)提取的RNA进行RT-PCR扩增，得到SCX1基因PCR产物；采用如SEQ ID No. 3 所示上游引物和如SEQ ID No. 4所示下游引物，对步骤1)提取的RNA进行RT-PCR扩增，得 至lj SCX2基因PCR产物；
[0032] 3)基因片段回收：将步骤2)所得的SCX1基因PCR产物和SCX2基因PCR产物进 行核酸电泳，回收SCX1基因片段和SCX2基因片段，并测序；
[0033] 4)拼接：将步骤3)获得的SCX1基因片段与SCX2基因片段进行拼接，得到猪流行 性腹泻病毒S全基因，测序。
[0034] 本发明中，采用SEQ ID No. 1所示上游引物和如SEQ ID No. 2所示下游引物进行 RT-PCR扩增，得到的PEDV SCX1基因片断的长度为2600bp，SEQ ID No. 3所示上游引物和 如SEQ ID No. 4所示下游引物扩增，得到的PEDV SCX2基因片断的长度为2115bp，在步骤 4)中，去掉SCX1基因与SCX2基因中间的重复碱基，拼接得到PEDV S全基因。
[0035] 实施例1:提取猪流行件腹泻病毒RNA
[0036] 取患病猪的病料标本，命名为⑶-YJ1，尚心1200rpm，_20°C反复冻融2-3次，得到 标本上清液，然后采用OMEGA的E. Z. N. A. Viral RNA Kit试剂盒提取PEDV RNA，其具体操作 步骤如下：
[0037] 1)加入 560 u L 的 QVL 裂解液，5. 6 u L Carrier RNA 和 10ul l-mercaptoethanol 至lj 1. 5mL的EP管中；
[0038] 2)加入140 y L标本上清液；
[0039] 3)室温下孵育 5-10min ;
[0040] 4)加入560 y L无水乙醇，混匀或者用涡旋振荡器混匀30s ;
[0041]5)将步骤4)中的混合液加入到HiBind RNA吸附柱中（装配有2mL的收集管）， 离心，将收集管中的液体弃去；
[0042] 6)重复步骤5)，直到所有的混合液都经过RNA吸附柱收集完毕；
[0043] 7)将RNA吸附柱装配到新的收集管上，在柱子上加入500 y L的RWA洗液（无水乙 醇稀释），离心，弃去管中的收集液；
[0044] 8)将柱子装配到新的收集管上，在吸附柱上加入500 y L无水乙醇稀释的RWB洗 液，离心，弃去管中的收集液；
[0045] 9)将柱子装配到原收集管上，全速离心（小于12000g)3min，使RNA吸附柱干燥；
[0046] 10)将RNA吸附柱转移到干净的1. 5mL的EP管中，在柱子的吸附膜中间加入50 y L 的DEPC水，室温下孵育3-5min，10000g，lmin离心，即得到RNA。
[0047] 本实施例中，所述病料为小肠及内容物；
[0048] 本实施例中，所用到的E. Z. N. A. Viral RNA Kit试剂盒的型号为Cat. #R6874-02 ;
[0049] 本实施例中，步骤1)中也可以取PEDV的细胞培养物的上清液，-20°C反复冻融2-3 次，得到标本上清液。
[0050] 实施例2 :引物设计
[0051] 从 GeneBank 登录号为 KF272920. 1 的 USA-Colorado-2013 的 S 基因为模板，设计 引物。
[0052] S 基因全长从