亚热带森林土壤纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，尤其设及 一种利用多功能酶标仪测定亚热带森林上壤中纤维二糖水解酶I活性的方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素是植物残体进入±壤的碳水化合物的重要组分之一，在±壤有机物成分 中，纤维素约占植物有机物的40%-55%，和木质素一起共占±壤有机物的60-75%。纤维素 是D-葡萄糖W0-1，4糖巧键组成的大分子多糖，在纤维素酶的作用下完成生物转化过 程。纤维素酶是一类复合酶系，包括=类不同的互补酶：外切葡聚糖巧酶、内切葡聚糖巧酶 和0-葡萄糖巧酶。其中，纤维二糖水解酶I是重要的外切葡聚糖巧酶，能分解纤维素释放 葡萄糖或纤维二糖，是水解天然纤维素必不可少的一类重要酶。准确检测±壤中纤维二糖 水解酶I的活性有助于准确了解±壤中纤维素的分解能力，同时对于研究±壤其他功能酶 系统及对±壤有机物分解过程的本质揭示具有重要意义，此外也为解开±壤养分循环机制 提供理论依据。
[0003] 目前，国内外对于纤维二糖水解酶I活性的测定多针对微生物发酵的提取液上， 而对亚热带森林±壤纤维二糖水解酶I活性的测定方法未见报道。对于微生物发酵的提取 液，纤维二糖水解酶I活性的测定方法常见的有脱脂棉法、微晶纤维素法。脱脂棉法W脱脂 棉为底物，加入稀释酶液W及醋酸钢缓冲液混合后，50°c条件下反应，然后加入3, 5-二硝 基水杨酸试剂终止反应，W每小时水解纤维素释放1 y mol葡萄糖所需要的酶量为一个酶 活力单位。该方法W棉花为底物测试原酶液所产生的还原糖量作为该酶的活力，虽然无纤 维二糖水解酶时棉花的水解程度很小，但还原糖的产生还取决于原酶液中内切葡聚糖巧 酶、纤维二糖酶组分的量，因此该测定方法不能确切反映纤维二糖水解酶的活力。国外，采 用微晶纤维素(商品名Avicel)为底物，W水解产生的还原糖量来计算酶活力。Avicel是用 稀酸水解纤维材料使结晶区与非结晶区断裂后得到的聚合度降低、结晶度升高的产物，其 中无定形区不会完全去除，聚合度一般为80-200，微晶纤维素较棉纤维易被纤酶原酶液 酶解，内切葡聚糖巧酶组分对它的水解程度高于棉花，对原酶液而言该方法反映的是外 切葡聚糖巧酶、内切葡聚糖巧酶和纤维二糖酶的协同作用结果，对单一组分来说，反映的 实际上是某些内切葡聚糖巧酶组分活力。
[0004] 因此，单一纤维素酶活性测定难的问题仍需解决。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题是如何快速准确测定亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶 I的活性，W及对活性测定时的反应底物、条件、反应装置等因素进行优化。在本发明中，W 亚热带森林±壤为酶样品库，W对硝基苯纤维二糖巧为酶的特异底物，在纤维二糖水解酶 I的最适条件下，该酶可将对硝基苯纤维二糖巧酶解生成对硝基苯酪，反应溶液中加化C〇3 溶液W调节抑值使酶失活来终止酶活反应，W1g上样1h内分解产生1帕〇1对硝基苯酪 所需的酶量作为一个酶活力单位。该测定方法选用了对硝基苯纤维二糖巧作为纤维二糖水 解酶I的特异底物，解决了单一纤维素酶活性测定难的问题，酶解反应在最适条件下进行， 检测生成物时采用多功能酶标仪，提高了准确性，缩短了测定时间，节约了成本。同时，填补 了森林±壤纤维二糖水解酶I活性测定的空白。
[0006] 为解决上述问题，本发明提供一种亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I活性的测 定方法，W对硝基苯纤维二糖巧为底物，称取±壤与底物水浴反应后，采用多功能酶标仪进 行测定。
[0007] 进一步的，本发明所述的亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法由 W下步骤组成： (1)用40mM-60mM醋酸钢缓冲液将对硝基苯纤维二糖巧配制成浓度为1.OmM- 1. 5mM的底物溶液，所述醋酸钢缓冲液抑为4. 5 - 5. 0 ;优选为用50mM醋酸钢缓冲液将对硝基苯 纤维二糖巧配制成浓度为1. 2mM的底物溶液，所述醋酸钢缓冲液抑为5. 0。
[000引 （2)吸取140化一160化步骤（1)制得的底物溶液于EP管中，称取0. 04g-0. 06g ±壤加入其中，充分混匀后置于40°C- 50°C恒温条件下水浴，反应60min-90min;反应结束 后加入0. 1血0. 4M-0. 5M化C03溶液终止反应；优选为吸取160化步骤（1)制得的底物溶液 于EP管中，称取0. 06g±壤加入其中，充分混匀后置于40°C恒温条件下水浴，反应90min; 反应结束后加入0. 1血0. 5M化C03溶液终止反应。
[0009] (3)步骤（2)反应后的溶液置于离屯、机中40(K)r/min- 50(K)r/min条件下离屯、 5min- 8min;优选为步骤（2)反应后的溶液置于离屯、机中500化/min条件下离屯、5min。
[0010] (4)吸取100化步骤（3)的上清液，用多功能酶标仪测定0D400皿一0D420皿处光 吸收值；优选为吸取100化步骤（3)的上清液，用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸收值。
[0011] (5)通过标准曲线推定亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I的活性。
[001引其中，对照样品的制备方法为；吸取140化一160化用40mM-60mM醋酸钢缓冲液 (抑为4. 5 - 5. 0)配制的1.OmM- 1. 5mM对硝基苯纤维二糖巧溶液于EP管中，40°C-50°C恒温条件下水浴60min-90min，之后加入0. 1血0. 4M-0. 5M化C03溶液，最后称取 0. 04g-0. 06g±壤样品加入上述反应液中，混匀后置离屯、机中400化/min- 5000r/min条 件下离屯、5min-8min，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定0D400皿一0D420皿处光吸 收值。优化为吸取160化用50mM醋酸钢缓冲液（抑为5. 0)配制的1. 2mM对硝基苯纤维二 糖巧溶液于EP管中，40°C恒温条件下水浴90min，之后加入0. 1血0. 5M化C03溶液，最后称 取0. 06g±壤样品加入上述反应液中，混匀后置离屯、机中5000r/min条件下离屯、5min，吸取 100化上清液用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸收值。
[0013] 对硝基苯酪标准曲线测定方法为；分别取0化、10化、20化、30化、40化、50化、60化 ImM的对硝基苯酪标准液加入EP管中，用抑为4. 5 - 5. 0的40mM-60mM醋酸钢缓冲液补齐 至180化-220ML，然后加入0. 1血0. 4M-0. 5M化C〇3溶液，吸取100化上清液用多功能酶标仪 测定0D400nm- 0D420nm处光吸收值，绘制标准曲线。优化为分别取0化、10化、20化、30化、 40化、50化、60化ImM的对硝基苯酪标准液加入EP管中，用抑为5. 0的50mM醋酸钢缓冲 液补齐至220化，然后加入0. 1血0.5M化C〇3溶液，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定 0D400nm处光吸收值，绘制标准曲线。
[0014] 本发明优化了纤维二糖水解酶I活性的测定条件，特别是亚热带森林±壤中纤维 二糖水解酶I的活性，提高了酶活测定的准确性和效率、节约了成本。
[0015] 本发明选择亚热带森林中丰富度较高、具有代表性的森林±壤为测试样品，运用 本发明被及的检测方法对各样品±壤中纤维二糖水解酶I的活性进行了测定，结果如下：
【具体实施方式】
[0016] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术 方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的 实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017] 实施例1 ; 一种亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法由W下步骤组成： (1) 用50mM醋酸钢缓冲液将对硝基苯纤维二糖巧配制成浓度为1. 2mM的底物溶液，所 述醋酸钢缓冲液pH为5. 0 ; (2) 吸取160化步骤（1)制得的底物溶液于EP管中，称取0. 06g±壤加入其中，充分混 匀后置于40°C恒温条件下水浴，反应90min;反应结束后加入0. 1血0. 5M化C〇3溶液终止 反应； (3) 步骤（2)反应后的溶液置于离屯、机中50(K)r/min条件下离屯、5min; (4) 吸取100化步骤（3)的上清液，用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸收值； (5) 通过标准曲线推定亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I的活性。
[0018] 其中，对照样品的制备方法为；吸取160化用50mM醋酸钢缓冲液（抑为5. 0 )配制 的1. 2mM对硝基苯纤维二糖巧溶液于EP管中，40°C恒温条件下水浴90min，之后加入0. 1血 0. 5M化C〇3溶液，最后称取0. 06g±壤样品加入上述反应液中，混匀后置离屯、机中5000r/ mi