n条件下离屯、5min，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸收值。
[0019] 其中，对硝基苯酪标准曲线测定方法为；分别取0化、10化、20化、30化、40化、 50化、60化ImM的对硝基苯酪标准液加入EP管中，用抑为5. 0的50mM醋酸钢缓冲液补齐至 220化，然后加入0.ImL0. 5M化C〇3溶液，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定0D400nm 处光吸收值，绘制标准曲线。
[0020] 实施例2 ; 一种亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法由W下步骤组成： (1)用40mM醋酸钢缓冲液将对硝基苯纤维二糖巧配制成浓度为1.OmM的底物溶液，所 述醋酸钢缓冲液抑为4. 5 ; (2) 吸取140化步骤（1)制得的底物溶液于EP管中，称取0. 04g±壤加入其中，充分混 匀后置于45°C恒温条件下水浴，反应60min;反应结束后加入0.ImL0. 4M化C〇3溶液终止 反应； (3) 步骤（2)反应后的溶液置于离屯、机中40(K)r/min条件下离屯、8min; (4) 吸取100化步骤（3)的上清液，用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸收值； (5) 通过标准曲线推定亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I的活性。
[002U 其中，对照样品的制备方法为；吸取140化用40mM醋酸钢缓冲液（抑为4. 5 )配制 的1.OmM对硝基苯纤维二糖巧溶液于EP管中，45°C恒温条件下水浴60min，之后加入0.ImL0. 4M化C03溶液，最后称取0. 04g±壤样品加入上述反应液中，混匀后置离屯、机中4000r/ min条件下离屯、8min，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸光值。
[002引其中，对硝基苯酪标准曲线测定方法为；分别取0化、10化、20化、30化、40化、 50化、60化ImM的对硝基苯酪标准液加入EP管中，用抑为4. 5的40mM醋酸钢缓冲液补齐 至180化，然后加入0. 1血0. 4M化C03溶液，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定0D400皿 处光吸收值，绘制标准曲线。
[0023] 实施例3 ; 一种亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法由W下步骤组成： (1) 用60mM醋酸钢缓冲液将对硝基苯纤维二糖巧配制成浓度为1. 5mM的底物溶液，所 述醋酸钢缓冲液抑为4. 8; (2) 吸取150化步骤（1)制得的底物溶液于EP管中，称取0. 05g±壤加入其中，充分混 匀后置于50°C恒温条件下水浴，反应80min;反应结束后加入0. 1血0. 5M化C〇3溶液终止 反应； (3) 步骤（2)反应后的溶液置于离屯、机中45(K)r/min条件下离屯、7min; (4) 吸取100化步骤（3)的上清液，用多功能酶标仪测定0D420nm处光吸收值； (5) 通过标准曲线推定亚热带森林±壤中纤维二糖水解酶I的活性。
[0024] 其中，对照样品的制备方法为；加入150化用50mM醋酸钢缓冲液（抑为4. 8)配制 的1.5mM对硝基苯纤维二糖巧溶液于EP管中，50°C恒温条件下水浴80min，之后加入0.ImL 0. 5M化C〇3溶液，最后称取0. 05g±壤样品加入上述反应液中，混匀后置离屯、机中4500r/ min离屯、7min，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定0D400皿处光吸收值。
[0025] 其中，对硝基苯酪标准曲线测定方法为；分别取0化、10化、20化、30化、40化、 50化、60化ImM的对硝基苯酪标准液加入EP管中，用抑为4. 8的60mM醋酸钢缓冲液补齐至 200化，然后加入0. 1血0. 5M化C〇3溶液，吸取100化上清液用多功能酶标仪测定0D420皿 处光吸收值，绘制标准曲线。
【主权项】
1. 亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特征在于：以对硝基苯纤 维二糖苷为底物，称取土壤与底物水浴反应后，采用多功能酶标仪进行测定。2. 如权利要求1所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特征 在于由以下步骤组成： 用40mM-60mM醋酸钠缓冲液将对硝基苯纤维二糖苷配制成浓度为1.0 mM - I. 5mM的底 物溶液，所述醋酸钠缓冲液pH为4. 5 - 5. 0 ; 吸取140ML - 160ML步骤（1)制得的底物溶液于EP管中，称取0. 04g-0. 06g 土壤样品 加入其中，充分混匀后置于40°C - 50°C恒温条件下水浴，反应60min-90min ;反应结束后加 入0? ImL 0? 4M-0. 5M恥(：03溶液终止反应； 步骤（2)反应后的溶液置于离心机中4000r/min - 5000r/min条件下离心5min - 8min ； (4)吸取100ML步骤（3)的上清液，用多功能酶标仪测定0D400nm - 0D420nm处光吸收 值； 通过标准曲线推定亚热带森林土壤中外切纤维二糖水解酶的活性。3. 如权利要求2所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特征 在于：所述步骤（1)为用50mM醋酸钠缓冲液将对硝基苯纤维二糖苷配制成浓度为I. 2mM的 底物溶液，所述醋酸钠缓冲液PH为5. 0。4. 如权利要求2所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特征 在于：所述步骤（2)为吸取160ML步骤（1)制得的底物溶液于EP管中，称取0. 06g 土壤样品 加入其中，充分混匀后置于40°C恒温条件下水浴，反应90min ;反应结束后加入0.1 mL 0. 5M 似0)3溶液终止反应。5. 如权利要求2所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特征 在于：所述步骤（3)为步骤（2)反应后的溶液置于离心机中5000r/min条件下离心5min。6. 如权利要求2所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特征 在于：所述步骤（4)为吸取100ML步骤（3)的上清液，用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸 收值。7. 如权利要求1或2所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方 法，其特征在于对照样品的制备方法为：吸取140ML - 160ML用pH为4. 5 - 5. 0浓度为 40mM-60mM醋酸钠缓冲液配制的1.0 mM - I. 5mM对硝基苯纤维二糖苷溶液于EP管中， 40°C - 50°C恒温条件下水浴60min - 90min，之后加入0.1 mL 0. 4M-0. 5M他0)3溶液，最后 称取0. 〇4g-〇. 06g 土壤样品加入上述反应液中，混勾后置离心机中4000r/min - 5000r/min 条件下离心5min-8min，吸取100ML上清液用多功能酶标仪测定0D400nm - 0D420nm处光吸 收值。8. 如权利要求7所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特 征在于对照样品的制备方法为：吸取160ML用pH为5. 0浓度为50mM醋酸钠缓冲液配制的 I. 2mM对硝基苯纤维二糖苷溶液于EP管中，40°C恒温条件下水浴90min，之后加入0.1 mL 0. 5M NaCO3溶液，最后称取0. 06g 土壤样品加入上述反应液中，混匀后置离心机中5000r/ min条件下离心5min，吸取100ML上清液用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸收值。9. 如权利要求1或2所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其 特征在于对硝基苯酚标准曲线测定方法为：分别取0ML、10ML、20ML、30ML、40ML、50ML、60ML ImM的对硝基苯酚标准液加入EP管中，用pH为4. 5 - 5. O的40mM-60mM醋酸钠缓冲液补齐 至180ML-220ML，然后加入0.1 mLO. 4M-0. 5M NaCO3溶液，吸取IOOML上清液用多功能酶标仪 测定0D400nm - 0D420nm处光吸收值，绘制标准曲线。10.如权利要求9所述的亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶I活性的测定方法，其特 征在于对硝基苯酚标准曲线测定方法为：分别取0ML、10ML、20ML、30ML、40ML、50ML、60ML ImM的对硝基苯酚标准液加入EP管中，用pH为5. 0的50mM醋酸钠缓冲液补齐至220ML，然 后加入0.1 mL 0. 5M NaCO3溶液，吸取100ML上清液用多功能酶标仪测定0D400nm处光吸收 值，绘制标准曲线。
【专利摘要】本发明涉及一种亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ活性的测定方法，尤其涉及一种利用多功能酶标仪测定亚热带森林土壤中纤维二糖水解酶Ⅰ活性的方法。该方法以对硝基苯纤维二糖苷为底物，称取土壤与底物水浴反应后，采用多功能酶标仪进行测定。具有简单、高效、准确的优点。
【IPC分类】C12Q1/34
【公开号】CN104988209
【申请号】CN201510436011
【发明人】吕艳娜, 李文静, 武翔宇
【申请人】潍坊医学院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月22日