一种检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种利用SYBRGreenI巧光定量PCR方法检 测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患，慢性，消耗性疾病。结核病主要通 过空气传播，其最常发病部位为肺部，在19世纪W前一直被视为不治之症。在19世纪40年 代W后，一系列抗结核的药物出现，使结核病得到了控制。但是耐药菌株随之出现，近年来 又出现多耐药菌株、泛耐药菌株，加之部分患者混合感染有艾滋病，导致结核病感染率、发 病率和死亡率呈逐年上升趋势。全球有将近=分之一的人口潜伏感染，在2013年将近900 万的新发病结核病患者，150万人因感染结核而死亡，在因感染死亡的人中有360000人呈 HIV阳性。所W近年来结核分枝杆菌的致病机制W及耐药性的研究成为热点。
[0003] 细菌生物被膜是指细菌附着于惰性或者活性实体的表面繁殖分化并分泌一些多 糖基质将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。相关研究显示，绝大多数致病菌 可W形成生物被膜，而生物被膜的形成可W使病原菌持久的寄生于机体，提高病菌的耐药 性，导致疾病愈后复发，甚至迁延不愈。大量研究表明，结核分枝杆菌可W形成生物被膜。 AnilOjha等证实结核分枝杆菌生物被膜态菌与浮游态相比，利福平对其杀灭效果明显降 低。由此可见，研究结核分枝杆菌生物被膜的产膜能力对于更好的研究结核分枝杆菌的耐 药性有重要意义。
[0004]目前为止，对结核分枝杆菌生物被膜的检测方法主要有有=磯酸腺巧（ATP)生 物发光法，高效液相色谱法，巧光素二己酸醋法，平板擦拭法，扫描电镜（SE^O和透射电镜 (TEM)，激光共聚焦扫描显微镜法（化SM)，银染法，结晶紫染色法，刚果红实验，报告基因检 测技术，W及近年来发展的PCR鉴定，肤核酸（PNA)探针巧光原位杂交技术等。但他们也存 在很大的不足，一是微生物必须借助外力从接触表面脱落下来，二是劳动强度大耗时多，= 是灵敏度不高，四是培养结核公枝杆菌出于安全考虑对实验室要求高，培养时间长。建立一 种灵敏度高，检测简便，特异性高的检测方法，对结核杆菌生物被膜的检测带来便利。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的为解决在检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力，需要对结核分枝杆 菌进行培养，不安全的问题，而提供一种操作简便、特异性好、灵敏度高、检测成本低、安全 可靠的检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法。
[0006] 一种检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法，它包括： 1) 提取结核分枝杆菌总RNA，反转录成cDNA，； 2) WcDNA为模板，用内参基因leSrRNA的上游引物 5' -AAGAAGCACCGGCCAACTAC-3'， 下游引物5' -TCGCTCCTCAGCGTCAGTTA-3' ；检测基因Rv3519的上游引物5' -GTTCATCCATCATCTGCC-3'，下游引物 5' -AAGTCCGCCATGATCTTC-3' ；巧光定量PCR检测； 所述的巧光定量PCR反应体系为；SYBR?PremixExTaq(TliRNas細Plus) (2X) 10uL，正向引物 0.4uL(10mmol),反向引物 0.4uL(10mmol)，ROXReferenceDye (50X) 0. 4yL，cDNA模板 2yL，地2〇6.8yL; 反应条件为；95°C30min;95°C5s，60°C30s，40 个循环；烙解曲线；95°C15s，60°C1min，W每秒 0. 3°C上升到 95°C。
[0007] 本发明提供了一种检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法，它包括；1)提取 结核分枝杆菌总RNA，反转录成cDNA;2)WcDNA为模板，用内参基因leSrRNA引物，检测基 因RV3519引物巧光定量PCR检测；最后由公式；RV3519基因的相对表达量=2^&a，计算结 核分枝杆菌中RV3519基因的相对含量。确定结核分枝杆菌中的RV3519表达差异，通过对 不同的结核分枝杆菌检测，结果表明RV3519表达量越高，成膜能力越强，与对结核分枝杆 菌培养后，再进行结晶紫染色法检测被膜的结果相符。时间短、操作简便、特异性好、灵敏度 高、检测成本低，不需要对结核分枝杆菌进行培养，安全可靠。为研究结核分枝杆菌的耐药 性提供可靠的实验基础。
【附图说明】
[0008] 图1结核分枝杆菌总RNA提取电泳图； 图2为16srRNA内参基因扩增曲线； 图3为16srRNA内参基因扩增溶解曲线图； 图4为Rv3519基因扩增曲线图； 图5为RV3519基因扩增溶解曲线图； 图6为S株不同菌Rv3519基因的相对表达量。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1结核分枝杆菌总RNA的提取纯化 将生长至15天的不同结核分枝杆菌菌株悬液8ml分别收集至10ml离屯、管中，8000g4°C离屯、5min,之后用Trizol法提取总RNA，去除可能残留的DNA后，经电泳检测结果见 附图1。
[0010] 实施例2引物设计 内参基因 16srRNA的义用文献（Fivian-Hu曲esAS,Hou曲tonJ,Davis EO.MycobacteriumtuberculosisthymidylatesynthasegenethyXisessential andpotentiallybifunctional,whilethyAdeletionconfersresistanceto p-aminosalicylicacid[J].Microbiology2012, 158(Pt2):308-318.)报道过的 引物，内参基因leSrRNA的上游引物5' -AAGAAGCACCGGCCAACTAC-3'，下游引物5' -TCGCTCCTCAGCGTCAGTTA-3' ； Rv3519 基因引物在GenBank(ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中查找Rv3519 基因序列通过PrimerExpress3. 0软件自行进行设计，所设计的检测基因Rv3519的上游 引物 5'-GTTCATCCATCATCTGCC-3'，下游引物 5'-AAGTCCGCCATGATCTTC-3'。上述引物 均由华大基因合成。
[0011] 实施例3RNA的逆转录反应 分别取约500ng总RNA为模板，按照逆转录酶试剂说明书配制逆转录反应体系合成cDNA。逆转录体系；SXPrimeScriptBuffer2uliPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5 y1，01igodTPrimer(50uM) 0.5yl，Random6mers(100uM) 0.5yl，TotalRNA 500ng，加RNase化ee地2〇 至 10yl。逆转录反应：37°C15min，85°C5s,cDNA 分装后，置-20°C保存。
[001引实施例4实时巧光PCR扩增 实时巧光定量PCR分析WcDNA为定量模板，W 16s rRNA为内参基因，使用Applied Biosystems? StepOnePlus? Real-Time PCR Systems进行定量试验，反应体系为20 uL ; SYBR?Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2X) lOuL,正向引物0. 4 uL (10 mmol),反 向引物0. 4yL (10 mmol)，R0X Reference Dye (50X)0. 4yL，cDNA模板2^1，地20(灭 菌蒸馈水）6.8uL。取不同菌株的cDNA样本，每个样品组织做3个统计学重复。反应条 件；95°C 30min ;95°C 5s，60°C 30s，40个循环。烙解曲线；95°C 15 s，60°C 1 min，W每 秒0.3°C上升到95°C。其中16s rRNA内参基因扩增曲线见附图2,其溶解曲线见附图3; RV3519基因扩增曲线见附图4,其溶解曲线见附图5。
[0013] 实施例5不同菌株的RV3519基因表达分析 对巧光定量检测结果进行扩增曲线W及烙解曲线分析，利用公式计算RV3519基因的 相对表达量。Rv3519基因的相对表达量A ACt=(Rv3519目的基因Ct值-16s rRNA 对照基因Ct值)-校准Act值，计算结核分枝杆菌的形成生物被膜能力。取3株不同结核 分枝杆菌(菌株A，B，C)，使用7H9B培养基在37°C，160转/分培养15天。将摇好的菌液(菌 株A，B，C)进行总RNA提取，反转为cDNA，巧光定量检测，3株结核分枝杆菌(菌株A，B，C)的 RV3519基因的相对表达量分别为1,6. 0,3. 9见附图6。
[0014] 与此同时，对上述3株不同的结核分枝杆菌同时进行生物膜培养。将3株结核分 枝杆菌分别接入含有150ml 7H9培养基的锥形瓶中，150rpm/min摇动培养1周，生长至对数 期；用紫外分光光度计测菌液的0D600吸光度值，用新鲜7H9培养基调节菌液0D600吸光度 值至07-1. 0,得到接种物。将3株不同的结核分枝杆菌培养物分别接种于50ml血清瓶中进 行生物被膜培养，每株做3个重复。取生长至4周的各菌株生物被膜进行结晶紫染色，并测 量570nm的吸光度值，吸光度值越大表明被膜含量较高，即产生被膜的能力越强。测量结果 表明实时巧光PCR检测方法同结晶紫染色法一致。结晶紫染色法吸光度值见表1
【主权项】
1. 一种检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法，它包括： 1) 提取结核分枝杆菌总RNA，反转录成cDNA ; 2) 以cDNA为模板，用内参基因16SrRNA的上游引物5' -AAGAAGCACCGGCCAACTAC-3'， 下游引物5' - TCGCTCCTCAGCGTCAGTTA -3' ；检测基因Rv3519的上游引物5' -GITCATCCATCATCTGCC -3'，下游引物 5' - AAGTCCGCCATGATCTTC -3' ；荧光定量 PCR 检测。2. 权利要求1所述的一种检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法，其特征在于： 所述的荧光定量PCR反应体系为：SYBIfPremix Ex Taq IOy L，正向引物0.4 yL，反向引 物 0? 4 y L，ROX Reference Dye 0? 4 y L，cDNA 模板 2 y L，dH20 6. 8 y L03. 权利要求1或2所述的一种检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法，其特征在 于：所述的荧光定量PCR反应条件为：95°C 30min ;95°C 5s，60°C 30s，40个循环；熔解曲 线：95°C 15 s，60°C I min，以每秒 0.3°C上升到 95°C。
【专利摘要】本发明公开了一种检测结核分枝杆菌生物被膜产膜能力的方法，它包括：1）提取结核分枝杆菌总RNA，反转录成cDNA；2）以cDNA为模板，用内参基因16SrRNA引物，检测基因Rv3519引物荧光定量PCR检测；最后由公式：Rv3519基因的相对表达量=2-ΔΔCt，计算结核分枝杆菌中Rv3519基因的相对含量。确定结核分枝杆菌中的Rv3519表达差异，通过对不同的结核分枝杆菌检测，结果表明Rv3519表达量越高，成膜能力越强，与对结核分枝杆菌培养后，再进行结晶紫染色法检测被膜的结果相符。时间短、操作简便、特异性好、灵敏度高、检测成本低，不需要对结核分枝杆菌进行培养，安全可靠。为研究结核分枝杆菌的耐药性提供可靠的实验基础。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN104988217
【申请号】CN201510350580
【发明人】于录, 王超, 杨志强, 郭娜, 汪杨, 唐旭东, 孟日增, 安雅男, 张巧丽, 施晓晨
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月24日