639G〉A的引物浓度为5pmol/祉，震荡混匀，PCR扩增采用Q5?热启动超 保真2XMasterMix(购自肥B公司，货号M049化），反应体系如表2所示。多重PCR扩增 反应条件包括；Step1: 98°Cfor3min;Step2: 98°Cfor10s;Step3: 58°Cfor30s; Step4: 72°CforImin；Step5:Gotostep2,29times；Step6: 72°Cfor5min； St巧 7: 25°Cforever。PCR扩增结束后，取 2.0yLExoSAP-IT(购自Affymetrix，货号 78205)和3. 0yLd地2〇,混匀，加入PCR扩增产物2. 0yL，混匀微离屯、；在PCR仪中进行酶 切反应，程序；37°C，15min;80°C，15min;4°C，保温。
[0026]
配置SNaPshotPCR引物混合物，VKR0C1-1639G〉A、CW义讲2和CW义讲3的引物浓度 比为 1 ; 1 ; 1，VKR0C1-1639G〉A的引物浓度为 5pmol/uL，震荡混匀，采用挪aPshot?Multiplex Kit(购自ABI公司，货号4323151)进行扩增，反应体系如表3所示。SNaPshotPCR反应 条件包括；Step1: 96°Cfor10s;Step2: 55°Cfor5s;Step3: 60°Cfor30s;Step4: Gotostep1,25times；Step5: 4°Cforever。
[0027]
在SNaPshotPCR产物中加入1. 0yLSAP酶，按照W下程序进行反应；37 °C， 60min;75°C，15min;4°C，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用 GE肥MAP阳RIDV4. 1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。
[002引实施例S检测VK0RC巧日CYP2C9基因多态性的方法的特异性 本检测方法的特异性定义为阴性符合率。VK0RC1 -1639A/A基因型占绝大部分 (82. 1%)，VKORCl-1639A/G基因型占 17. 9%，CYP2C9*2 430C/C基因型占绝大部分，CYP2C9*3 1075A/A基因型占绝大部分。因此，本检测将VKORCl-1639A/A基因型的检出定 义为阴性结果，CYP2C9*2 430C/C基因型的检出定义为阴性结果，CYP2C9*3 1075A/A基因 型的检出定义为阴性结果。
[0029] 采用本发明提供的SNaPshot法对18例样品进行检测，同时采用Sanger测序法进 行验证。SNaPshot测序法检测出无突变（阴性）的样品共9例，与Sanger测序法显示的结 果相符，如表4所示。本检测方法的特异性为100%。
[0030]
实施例四检测VK0RC巧日CYP2C9基因多态性的方法的灵敏度 本检测方法的灵敏度定义为阳性符合率。采用本发明提供的SNaPshot法对18例样品 进行检测，同时采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出突变（阳性）的样品 共9例，与Sanger测序法结果相符，如表5所示。本检测方法的灵敏度高。
[0031]
WCYP2C9*3位点为例验证本检测方法的检测下限。使用CYP2C9*3C/C基因型样本 (纯合突变型）与A/A基因型样本（野生型）分别按1 ;9,2 ;8,3 ;7,4 ;6,5 ;5比例混合后 进行检测，结果如表6所示。结果显示，突变型与野生型比例为1:9 (突变型比例为10%)时 本检测方法也能检测到突变型。CYP2C9*3多态性为胚系突变，在杂合基因型A/C中突变等 位基因为50%，因此，本检测方法的检测灵敏度100%。
[0032]
实施例五检测VK0RC巧日CYP2C9基因多态性的方法的准确度 本检测方法的准确度定义为不同方法检测结果的一致性。18例样品经SNaPshot法和 Sanger测序法，不同方法检测结果一致，如表7所示。本检测方法的准确度为100%。
[0033]
实施例六检测VKORC巧日CYP2C9基因多态性的方法的精密度 本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。本检测进行了 人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验，结果如表8a和8b所示，所有 结果均显示一致，本检测精密度为100%。其中，位点1 ;VK0RC1-1639G〉A;位点2 ;CYP2C9*2 430OT;位点 3 ;CYP2C9*3 1075A〉C。
[0034]
因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决 了VK0RC1-1639G〉A、CYP2C9*2 和CYP2C9*3 进行准确分型鉴定问题，发挥PCR-SNaPshotPCR 对所述基因位点基因分型结果精确、高通量操作的特点，可W对华法林的个体化用药起到 很大的指导作用，减少华法林的不良反应。
[0035] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于该些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩 增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对VKR0C1-1639G>A的上 游引物 5' -GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3' 和下游引物 5' -AGITTGGACTACAGGTGCCT-3'， 针对 CYP2C9*2 的上游引物 5' - CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG-3' 和下游引 物 5' -CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG -3' 以及针对 CYP2C9*3 的上游引物 5' -CAGGAAGAGAITGAACGTGTGAT-3' 和下游引物 5' -TAATGTCACAGGTCACTGCATGG -3' ；所述 SNaPshot PCR 引物包括：针对 VKR0C1-1639G>A 的 SNaPshot PCR 引物 5'-ATAGGCGTGAGCCACCGCACC-3'，针对 CYP2C9*2 的 SNaPshot PCR 引物 S'-TITITITITGGAAG AGGAGCAITGAGGAC-3' 以及针对 CYP2C9*3 的 SNaPshot PCR 引物 5'- TITITITITITITITITIT GGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA-3'。2. 根据权利要求1所述的同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的引物，其特征在于： 所述PCR扩增引物中，VKR0C1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1 :1 :1 ;所 述 SNaPshot PCR 引物中，VKR0C1-1639G>A、CYP2C9*2 和 CYP2C9*3 的引物浓度比为 1 :1 :1。3. -种同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：A) 提取DNA样品；B)采用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增 产物进行纯化；C)采用权利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩 增，对扩增产物进行纯化；D)毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位 点及其基因型。4. 根据权利要求3所述的同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于： 所述步骤A)中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。5. 根据权利要求3所述的同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于： 所述步骤B)中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段I :98°C 3min ;阶段2 :98°C IOs ;阶段 3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环；阶段6:72°C 5min;阶段 7 :25 °C 保温。6. 根据权利要求3所述的同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于： 所述步骤C)中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段I :96°C IOs ;阶段2 :55°C 5s ;阶 段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环；阶段5:4°C保温。7. 根据权利要求3所述的同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于： 所述步骤D)中，采用GENEMAPPERID V4. 1软件对检测结果进行分析。8. 根据权利要求1或2所述的同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的引物在制备检 测VKORCl和CYP2C9基因多态性试剂中的用途。
【专利摘要】本发明提供一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物可以实现VKORC1和CYP2C9基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104988223
【申请号】CN201510384262
【发明人】赵薇薇, 胡昌明, 燕启江, 郭周萍
【申请人】广州金域医学检验中心有限公司, 广州医科大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月30日