ccatcaccgggtgag 实施例2 :CYP2C9基因rsl057910位点等位基因特异性引物（ASP)的设计和特异性筛 选 针对CYP2C9基因rsl057910,设计野生型和一系列突变特异型引物如下： CYP2C9 基因rsl05791〇-WT_F:ggtgcacgaggtccagagattca(SEQNo.8) CYP2C9基因rsl05791〇-mut_F: ggtgcacgaggtccagagattcc (SEQ No.9) CYP2C9基因rsl05791〇-mut_Fl:gtgcacgaggtccagagattcc (SEQ No.10) CYP2C9基因rsl05791〇-mut_F2:tgcacgaggtccagagattcc (SEQ No.ll) CYP2C9基因rsl05791〇-mut-F3:ggtgcacgaggtccagagatagc (SEQ No.12) CYP2C9基因rsl05791〇-mut_F4:gtgcacgaggtccagagatagc (SEQNo.13) CYP2C9基因rsl05791〇-mut_F5:tgcacgaggtccagagatagc (SEQNo.14) 同时设计合成CYP2C9基因Taqman特异性第一探针： SEQNo. 15 ：FAM-ccaccagcctgccccatgcagtg-BHQl〇 [0091] 相关引物和探针在生工生物工程(上海）有限公司进行合成。
[0092] 然后分别用上述7条引物与第一下游引物rsl057910-R: 5'_ctcacccggtgatggtagaggt_3'（SEQNo. 16)引物配对，加上Taqman特异性探针，加入前 述构建所得到的野生型重组质粒约3万个拷贝为模板，在荧光定量PCR仪上进行引物特异 性筛选，反应条件设定为第一步95°C2min预变性，95°C5s，63°C30s共15个循环，不收集 荧光信号，第二步95°C5s，60°C30s共40个循环，收集荧光信号，结果见图1。
[0093] 其中，图1中1~7曲线分别代表rsl057910-WT-F、rsl057910-mut-F、 rsl05791〇-mut_Fl、rsl05791〇-mut_F2、rsl05791〇-mut_F3、rsl05791〇-mut_F4、 rsl057910-mut-F5的PCR扩增曲线，从图1中我们看出1号野生型引物在7个循环产生扩 增信号，2-6引物的特异性较差，分别在8-11个循环时产生非特异性扩增，同野生型引物（1 号)扩增效率相差小于19个循环，第7号引物满足我们的要求，在40个循环时，仍然没有扩 增，同野生型引物扩增效率相差大于19个循环。为了与突变引物有更好的可比性，我们参 照第7号引物重新设计野生型的引物为：tgcacgaggtccagagataga (SEQNo.17)。
[0094] 实施例3 :CYP2C9基因rsl057910位点ASP灵敏度筛选 再用突变型引物分别同第一下游引物SEQNo. 16配对，用突变型重组质粒，按照106， 105, 104, 103, 102, 10,0作梯度稀释，加上Taqman特异性探针，在荧光定量PCR仪上进行灵敏 度验证。突变特异型引物能检测出100个拷贝的突变体，因此这一引物就是按我们的方法 筛选出检测CYP2C9基因的rsl057910位点的最佳引物，见表3所示。
[0095] 实施例4 :预制的本发明PCR(Past-PCR)反应管（CYP2C9基因rsl057910位点） 按照每个突变位点两个反应管的要求，即一管检测野生型位点，另一管检测突变位点， 将适宜浓度的引物探针预先包被于0. 2ML乳白色的PCR反应管中。
[0096] 为了防止检测时出现假阴性，在每个反应管中均预先包被有检测管家基因GAPDH 的上游引物、下游引物和探针，其中，GAPDH基因序列如下： cctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgcc aaggctgtgggcaaggtcatccctgagetgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacg tgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcg tcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacaccca ctcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacg(SEQNo. 18) 检测管家基因GAPDH的上游引物序列为：ggctgtgggcaaggtcatc(SEQNo. 19) 检测管家基因GAPDH的下游引物序列为：ctccgacgcctgcttcaccac(SEQNo.20) 检测管家基因GAPDH的探针序列为：ccttccgtgtccccactgccaacgt(SEQNo. 21) 其中，检测管家基因GAPDH的探针5 '端用HEX荧光标记，3 '端用BHQ标记，由于HEX和VIC属于同一通道检测，而许多仪器往往采用VIC标示，因此文中用VIC叙述。
[0097] PCR反应管中具体的细节见表3。
[0098] 表3.预制CYP2C9基因rsl057910多态性位点Past-PCR反应管的组分和浓度
由于我们预先把突变型和野生型上游引物、第一探针、第一下游引物、检测管家基因GAPDH的上、下游引物和检测管家基因GAPDH的探针包被在编好号的不同反应管中，有效避 免了使用者的操作误差，同时大大提高了操作效率，极大方便了在临床上的实际使用。
[0099] 实施例5 :针对VK0RC1基因rs9923231多态性位点检测的野生型和突变型阳性质 粒的制备 首先我们从基因库中调出VK0RC1基因rs9923231位点前后的基因序列，并将多态性位 点用双下划线标记，在VK0RC1基因rs9923231位点的上下游适当位置(用黑体字和下划线 标示)，设计一对克隆引物，扩增片段为227bp，突变位点包含其内，基因序列显示如下，SEQ No. 22 ： acaagttccagggattcatgcagggacatctttggtgaccattattctgtctaccacactctctagaagag agtagatgtgagaaacagcatctggagagggaggagccagcaggagagggaaatatcacagacgccagaggaagag agttcccagaagggtaggtgcaacagtaagggatccctctgggaagtcaagcaagagaagacctgaaaaacaaccat tggcc_gggtgcggtggctcacgcctataatcctagcattttgggaggccgaggtgggtggatcacttgaggtcagga gtttaagacaagcctggccaacatggtgaaaccctgtctctactaaaaatacaaaaattagccagacatggtggcag gcacctgtagtccaaactacttgggaggctgaggcacgagaaccacttgaaccctggaggcggaagttgcagtgagc cgagatggcaccgctgcactccagcct 具体实验步骤同实施例1。
[0100] 表4.VK0RC1基因rs9923231多态性位点野生型克隆引物
G型野生型质粒序列如下： SEQNo. 25：gggaggagccagcaggagagggaaatatcacagacgccagaggaagagagttcccagaaggg taggtgcaacagtaagggatccctctgggaagtcaagcaagagaagacctgaaaaacaaccattggcc^ggtgcggt ggctcacgcctataatcctagcattttgggaggccgaggtgggtggatcacttgaggtcaggagtttaagacaagcc tggccaacatg 表5.获得VK0RC1基因M9923231多态性位点突变型克隆引物
A型突变型质粒序列如下： SEQNo. 28：gggaggagccagcaggagagggaaatatcacagacgccagaggaagagagttcccagaaggg taggtgcaacagtaagggatccctctgggaagtcaagcaagagaagacctgaaaaacaaccattggccaggtgcggt ggctcacgcctataatcctagcattttgggaggccgaggtgggtggatcacttgaggtcaggagtttaagacaagcc tggccaacatg 实施例6 :VK0RC1基因B9923231位点等位基因特异性引物（ASP)的设计和特异性筛 选 针对VK0RC1基因rs9923231，设计野生型和一系列突变特异型引物如下： VK0RC1 基因rs9923231_WT_F:acctgaaaaacaaccattggccg(SEQNo.29) VK0RC1 基因rs9923231-mut_F:acctgaaaaacaaccattgggcg(SEQNo.30) VK0RC1 基因rs9923231-mut_Fl:cctgaaaaacaaccattgggcg(SEQNo.31) VK0RC1 基因rs9923231-mut_F2:ctgaaaaacaaccattgggcg(SEQNo.32) VK0RC1 基因rs9923231-mut_F3:acctgaaaaacaaccattggcg这（SEQNo.33) VK0RC1 基因rs9923231-mut_F4:cctgaaaaacaaccattggcg这（SEQNo.34) VK0RC1 基因rs9923231-mut_F5:ctgaaaaacaaccattggcg这（SEQNo.35) 同时设计合成VK0RC1基因Taqman特异性第二探针： SEQNo. 36 ：FAM-taggattataggcgtgagccaccgcac-BHQl〇
[0101] 相关引物和探针在生工生物工程(上海）有限公司进行合成。
[0102] 然后分别用上述7条引物与第二下游引物rs9923231-R: 5' - catgttggccaggcttgtc-3'（SEQ1^〇.37)引物配对，加上13卩11^11特异性探针，加入前述构建 所得到的野生型重组质粒约3万个拷贝为模板，在荧光定量PCR仪上进行引物特异性筛选， 反应条件设定为第一步95°C2min预变性，95°C5s，63°C30s共15个循环，不收集荧光信 号，第二步95°C5s，60°C30s共40个循环，收集荧光信号，结果见图2。
[0103] 其中，图 2 中 1~7 曲线分别代表rs9923231-WT-F、rs9923231-mut-F、 rs9923231-mut_Fl、rs9923231-mut_F2、rs9923231-mut_F3、rs9923231-mut_F4、 rs9923231-mut-F5的PCR扩增曲线，从图2中我们看出1号野生型引物在6个循环产生扩 增信号，2-6引物的特异性较差，分别在8-11个循环时产生非特异性扩增，同野生型引物（1 号)扩增效率相差小于19个循环，第7号引物满足我们的要求，在40个循环时，仍然没有扩 增，同野生型引物扩增效率相差大于19个循环。为了与突变引物有更好的可比性，我们参 照第7号引物重新设计野生型的引物为：ctgaaaaacaaccattggcg￡(SEQNo. 38)。
[0104] 实施例7 :VK0RC1基因rs9923231位点ASP灵敏度筛选 再用突变型引物分别同VK0RC1基因的共同下游引物SEQNo. 40配对，用突变型重组质 粒，按照1〇6,1〇5,1〇4,1〇3,1〇 2,10, 〇作梯度稀释，加上Taqman特异性探针，在荧光定量PCR 仪上进行灵敏度验证。突变特异型引物能检测出100个拷贝的突变体，因此这一引物就是 按我们的方法筛选出检测VK0RC1基因的rs9923231位点的最佳引物，见表6所示。
[0105] 实施例8 :预制的本发明PCR(Past-PCR)反应管（VK0RC1基因rs9923231位点） 按照每个突变位点两个反应管的要求，即一管检测野生型位点，另一管检测突变位点， 将适宜浓度的引物探针预先包被于0. 2ML乳白色的PCR反应管中。
[0106] 为了防止检测时出现假阴性，在每个反应管中均预先包被有检测管家基因GAPDH 的上游引物、下游引物和探针，其中，GAPDH基因序列同实施例4。
[0107] 表6.预制VK0RC1基因rs9923231多态性位点Past-PCR反应管的组分和浓度
实施例9 :CYP2C9基因rsl057910位点和VK0RC1基因rs9923231位点标本的验证 采集正常人群的外周血或口腔脱落细胞标本，并用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂 盒，提取基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测 定浓度，将其浓度调整到l〇〇ng/y1备用。
[0108] 我们用筛选出的两个基因位点各自的突变特异性引物，同时用野生型引物作对 照，在同一个PCR反应板上，每两个反应管检测一个基因位点，其中一个是突变位点，另一 个是野生型位点。每个反应管20yl反应体积中包含10mM Tris-HCl pH8. 3,50mM KC1， 0? l%Triton X-100, 2. OmM MgCl2, lOOng人基因组DN