反应完结后的处理，不仅节 省了时间，而且减少了PCR产物污染的风险，探针的第二次识别靶序列保障了检测的特异 性和可靠性，还可用于对基因的定量检测，达到了临床使用标准等优点。Past-PCR方法具有 AS-PCR方法和Taqman荧光PCR方法的双重优点，并且是这两种方法结合在一起时，检测组 份所能达到的最简化构成，因此，我们将其称作为完美的等位基因特异性TaqmanPCR。
[0054] 基于Past-PCR方法，发明了用于检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂盒，其 基本组成为：(a)高度特异的等位基因特异性引物；(b)荧光检测探针；（c)与等位基因特 异性引物配对的另一条特异性引物。
[0055] 其中，本发明提供的检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的引物，包括：检测CYP2C9 基因野生型特异性上游引物、检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物和检测CYP2C9基因 野生型特异性上游引物与检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物共用的第一下游引物； 且所述检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物具有SEQNo. 17序列，所述检测CYP2C9基 因突变型特异性上游引物具有SEQNo. 14序列，所述第一下游引物具有SEQNo. 16序列； 检测VK0RC1基因野生型特异性上游引物、检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物和检测 VK0RC1基因野生型特异性上游引物与检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物共用的第 二下游引物；且所述检测VK0RC1基因野生型特异性上游引物具有SEQNo. 38序列，所述检 测VK0RC1基因突变型特异性上游引物具有SEQNo. 35序列，所述第二下游引物具有SEQ No. 37序列。
[0056] 同时还提供了含有上述引物的检测试剂和试剂盒，以解决以往检测CYP2C9和 VK0RC1基因多态性存在操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度 低，不能同时大规模检测临床标本等问题，实现了检测简单、快速、准确、廉价的理想要求， 为科研和临床基因型分析提供了强有力的工具。
[0057] 优选，所述试剂盒还包括分别与检测CYP2C9和VK0RC1基因引物配合使用的第一 探针和第二探针，其中，所述第一探针和所述第二探针均为Taqman探针，且所述第一探针 具有SEQNo. 15序列，所述第二探针具有SEQNo. 36序列，整个试剂盒中仅使用两条探针， 别无其他诸如封闭探针等，降低试剂盒的成本。
[0058] 进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH 的探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因GAPDH的上游引物具有SEQNo. 19序列；所述检测管家基因GAPDH的下游引物具有SEQNo. 20序列；所述检测管家基因GAPDH的探针具有SEQNo. 21序列；其 中，将dNTPs和Taq酶混合，能够保障dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的考验；检 测管家基因GAPDH的上游引物、下游引物和探针是用于作为内参照，为防止检测时出现假 阴性；阳性质控品分别为CYP2C9 rsl057910位点CA型和VK0RC1 rs9923231位点AG型人 基因组DNA ;空白对照为灭菌超纯水。
[0059] 进一步优选，所述检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物、所述第一下游引物、 所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物 和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于C型PCR反应管内；所述检测CYP2C9基因 野生型特异性上游引物、所述第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上 游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包 被于A型第一PCR反应管内；所述检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物、所述第二下游 引物、所述第二探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下 游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于A型第二PCR反应管内；所述检测 VK0RC1基因野生型特异性上游引物、所述第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针 被预先包被于G型PCR反应管内。按最佳的反应用量预先包被在PCR反应管中，每一个反 应管中实际包被六条寡核甘酸，即一条针对等位基因的一种特异性上游引物、一条探针(通 常为Taqman探针)、一条共用特异性下游引物、一条检测管家基因GAPDH的上游引物、一条 检测管家基因GAPDH的下游引物和一条检测管家基因GAPDH的探针。这样为了检测一个位 点不同的基因多态性，常需要分别包被两管或两管以上的PCR反应管，它们中探针、共用特 异性下游引物、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管 家基因GAPDH的探针是一样的，不同的仅是鉴定等位基因不同型别的特异性上游引物，这 样预先包被避免了操作者出现位点配错的可能，而且节约了大量操作时间。
[0060] 进一步优选，所述C型PCR反应管内检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物、所 述第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基 因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm;所述A型第一PCR反应管内检测CYP2C9 基 因野生型特异性上游引物、所述第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的 上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度 分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm_5pm;所述A型第二 PCR反应管内检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物、所述第二下游引物、所述第二探针、 所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管 家基因GAPDH的探针浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、 0. 05pm-5pm;以及所述G型PCR反应管内检测VK0RC1基因野生型特异性上游引物、所述 第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM_400nM、lpm_20pm、lpm_20pm、0. 05pm_5pm。
[0061] 最优为，所述C型PCR反应管内检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物、所述 第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、 5pm、2. 5pm;所述A型第一PCR反应管内检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物、所述第一 下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH 的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、 2. 5pm。所述A型第二PCR反应管内检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物、所述第二 下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH 的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、 2. 5pm;以及所述G型PCR反应管内检测VK0RC1基因野生型特异性上游引物、所述第二下 游引物、所述第二探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的 下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、 2. 5pm〇
[0062] 由于在等位基因特异性引物内引入了错配的碱基，使其在反应时的效率下降，不 同的引物下降程度不同，通常要增加10至20个循环才能达到没有错配时的效果，保证检 测的灵敏度，优选PCR反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步 扩增的循环数，所述第一步扩增的退火温度高于第二步扩增的退火温度，第一步扩增使用 较高退火温度，第二步扩增使用较低退火温度，目的是增加第一步扩增时引物退火时的特 异性，从而保证Past-PCR检测高度特异性的目的；具体而言优选所述PCR反应的条件为： 37°C2min，95°C2min预变性；第一步扩增，95°C变性 5s，55°C~68°C退火 32s，循环 10~15次；第二步，95°C变性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循环30~50次，收集荧光信 号；更为优选PCR反应的条件为：37°C2min，95°C2min预变性；第一步扩增，95°C变性 5s，63°C退火32s，循环15次；第二步，95°C变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收 集荧光信号。
[0063] 具体的检测过程为： 1) 将待检测样品分别放入预先包被有检测CYP2C9或VK0RC1基因野生型特异引物、 共用的下游引物、探针、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物 和检测管家基因GAPDH的探针以及突变型特异引物、共用的下游引物、探针、检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针两组PCR 反应管内，并加入PCR缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、灭菌超纯水和基因组DNA，盖紧管盖， 在荧光定量PCR仪上进行反应，并收集荧光信号； 2) 如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道 有对数增长的扩增曲线，可判定样本为C型（CYP2C9基因）或A型（VK0RC1基因），即突变型 纯合子； 如果检测样本仅有野生型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为A型（CYP2C9基因）或G型（VK0RC1基因），即野生型纯 合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为CA型（CYP2C9基因）或AG型（VK0RC1基因），即 杂合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均无对数增长的扩增曲线，可能样本 或操作存在问题，或者样本DNA浓度过低，应重新提取样本DNA进行试验。
[0064]下面详述检测过程中各组份介绍： (一）等位基因特异性引物： 等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于基因的一个等位基因位点， 但不互补于该基因的另一个等位基因位点。通常而言，等位基因特异性引物的等位基因特 异性核苷酸部分位于等位基因特异性引物的3'端的末位碱基。在某些情况下，等位基因特 异性核苷酸部分也可位于等位基因特异性引物3'末端的其他碱基位置。
[0065]在一些情况下，等位基因特异性引物除3'末端互补于等位基因位点有所变化外， 我们常常要在引物的其他位置引入错配的碱基，如在引物3'端倒数第二位或第三位引入碱 基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3'端倒数第二位 或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反应特异性 的要求，越远离3'端，增加错配的碱基数越多，在5'端可达最多。等位基因特异性引物的 长度主要依据其^值来决定，通常而言其Tm值比PCR循环的退火温度低大约5-20°C。
[0066]两条检测对应基因多态性的等位基因特异性上游引物，除3'端检测的位点其碱基 不同外，其余序列尽可能相同，二条引物的Tm值也尽可能一致。
[0067]低1"的等位基因特异性引物（ASP)有更高的特异性。一般情况下，等位基因特异 性引物为短寡核苷酸，其长度是大约15-30,其Tm是大约40 °C至60 °C，比扩增过程中使用的 PCR循环条件的退火/延伸温度低大约5°C至20°C。
[0068]由于等位基因特异性引物的设计和筛选十分重要，好的引物需要从众多待选的 引物中选出，因此我们建立了一个筛选的方法，其等位基因特异性引物的具体筛选过程如 下： ⑴设计外围引物及PCR扩增：首先在待检基因突变点或SNP位点的上下游，设计一对PCR扩增引物，然后用该对引物，对目的基因进行常规的PCR反应，其中扩增片段长度可在 几十至数千碱基对，优选长度为200至500碱基对； ⑵克隆PCR产物：将扩增出的PCR产物，利用AT克隆的方法，重组到普通的T载体质粒 中，得到重组质粒，其中得到的重组质粒可以进行测序验证，从而确保PCR产物的正确性； ⑶构建重组突变体：根据生物信息学所提供的信息，采用分子克隆技术，将突变体的序 列，构建至上述得到的重组质粒中，将构建的重组突变体进行测序验证序列，从而确保其正 确性； ⑷设计及筛选突变位点特异性引物：设计两条等位基因特异性引物，一条引物的3'端 同突变序列互补，另一条引物的3'端同正常序列互补；然后分别用等位基因特异性引物和 对应的常规PCR共同下游引物配对，以上述构建好的重组突变体作为反应模板，利用荧光 定量PCR仪，对反应体系，进行筛选；其中，反应可采用荧光染料，如SYBRGREEN，也可采用 特异性的Taqman荧光探针，按照所加样品量为0. 1微克全基因组DNA的标准进行筛选，其 具体的筛选内容