A，lOOnM特异性Taqman探针，500nM共 用特异性下游引物，500nM野生型特异性上游引物或突变型特异性上游引物，5pm检测管家 基因GAPDH的上游引物，5pm检测管家基因GAPDH的下游引物，2. 5pm检测管家基因GAPDH 的探针，再加上1. 5单位Taq DNA聚合酶，200 y M dNTPs，其余为去离子水。
[0109] 第一步PCR反应条件是：37°C2min，95°C2min预变性，然后 95°C5s，63°C30s， 15个循环，此步不收集荧光；第二步PCR反应条件是：95°C5s，60°C30s，共40个循环， 此步收集荧光。为了方便起见，我们将CYP2C9基因rsl057910多态性正常位点认定为野 生型（A位点），而容易引起CYP2C9酶活性下降的位点则为突变型（C位点)，VK0RC1基因 rs9923231多态性正常位点认定为野生型（G位点)，而容易引起VK0RC1酶代谢异常的位点 则为突变型（A位点)，如果对应的反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道 有对数增长的扩增曲线，就判断为对应的纯合基因型；如两管均在FAM通道有对数增长的 扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，则为杂合型。
[0110] 1、按照上述方法进行两个基因位点均是纯合子（CYP2C9-A型、VK0RC1-G型）标本 的检测，其具体基因序列为： SEQNo. 39：ccagagatacattgaccttct SEQNo. 40：caaccattggccgggtgcggtggct 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图3所示，其中，1曲线代表检测CYP2C9-A型PCR反应管中的扩增曲线，2曲线代表检测VK0RC1-G型PCR反应管中的扩增曲线，3、4号曲线代 表没有扩增的PCR反应管中的曲线。
[0111] 2、按照上述方法进行两个基因位点一个是杂合子（CYP2C9-CA型)，一个是纯合子 (VK0RC1-A型）标本的检测，其具体基因序列为： SEQNo. 41 ：ccagagataca/cttgaccttct SEQNo. 42：caaccattggccaggtgcggtggct 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图4所示，其中，5曲线代表检测CYP2C9-A型PCR反应管中的扩增曲线，6曲线代表检测CYP2C9-C型PCR反应管中的扩增曲线，7曲线代表检 测VK0RC1-A型PCR反应管中的扩增曲线，8号曲线代表没有扩增的PCR反应管中的曲线。
[0112] 3、按照上述方法进行两个基因位点一个是纯合子（CYP2C9-C型)，一个是杂合子 (VK0RC1-GA型）标本的检测，其具体基因序列为： SEQNo. 43：ccagagataccttgaccttct SEQNo. 44 ：caaccattggccg/aggtgcggtggct 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图5所示，其中，9曲线代表检测CYP2C9-C型PCR反应管中的扩增曲线，10曲线代表检测VK0RC1-G型PCR反应管中的扩增曲线，11曲线代表 检测VK0RC1-A型PCR反应管中的扩增曲线，12号曲线代表没有扩增的PCR反应管中的曲 线。
[0113] 4、按照上述方法进行两个基因位点均是杂合子（CYP2C9-CA型、VK0RC1-GA型）标 本的检测，其具体基因序列为： SEQNo. 41 ：ccagagataca/cttgaccttct SEQNo. 44 ：caaccattggccg/aggtgcggtggct 收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图6所示，其中，13曲线代表检测CYP2C9-A型PCR反应管中的扩增曲线，14曲线代表检测CYP2C9-C型PCR反应管中的扩增曲线，15曲线 代表检测VK0RC1-A型PCR反应管中的扩增曲线，16曲线代表检测VK0RC1-G型PCR反应管 中的扩增曲线。
[0114] 同时，上述4个检测案例中，当VIC通道管家基因GAPDH有对数增长的扩增曲线， 如图7所示，同时FAM通道有对数增长的扩增曲线，则此次实验结果有效。
[0115] 因此，从上述的检测试验可见，本试剂盒的检测结果为"全或无"的结果，即若被检 测样品为突变等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有突变型PCR反应管在FAM通道和 VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而野生型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检 测样品为野生等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有野生型PCR反应管在FAM通道和 VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而突变型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检 测样品为杂合子，两个PCR反应管在FAM通道和VIC通道均有对数增长的荧光信号。该试 剂盒的检测结果判读简单，减少了以往试剂盒的检测结果需要进行ACt等一系列复杂计 算的过程，降低错判率，同时还有效避免了以往试剂盒检测结果中存在假阴性假阳性现象 的发生。此外本发明提供的试剂盒可用于任何型号的荧光定量PCR仪，检测仪器简单，成本 低，为科研和临床CYP2C9和VK0RC1基因型分析提供了强有力的工具。
【主权项】
1. 一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物，其特征在于，所述引物包括：检 测CYP2C9基因野生型特异性上游引物、检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物和检测 CYP2C9基因野生型特异性上游引物与检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物共用的第一 下游引物； 且所述检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物具有SEQ No. 17序列，所述检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物具有SEQ No. 14序列，所述第一下游引物具有SEQ No. 16序列； 检测VKORCl基因野生型特异性上游引物、检测VKORCl基因突变型特异性上游引物和 检测VKORCl基因野生型特异性上游引物与检测VKORCl基因突变型特异性上游引物共用的 第二下游引物； 且所述检测VKORCl基因野生型特异性上游引物具有SEQ No. 38序列，所述检测VKORCl基因突变型特异性上游引物具有SEQ No. 35序列，所述第二下游引物具有SEQ No. 37序列。2. -种检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂，其特征在于：所述试剂含有权利要 求1所述的引物。3. -种检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权 利要求1所述的引物。4.按照权利要求3所述检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述 试剂盒还包括分别与权利要求1中检测CYP2C9和VK0RC1基因引物配合使用的第一探针和 第二探针，其中，所述第一探针和所述第二探针均为Taqman探针，且所述第一探针具有SEQ No. 15序列，所述第二探针SEQ No. 36序列。5.按照权利要求4所述检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂盒，其特征在于：所 述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、检测管家基因GAPDH的上 游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针、阳性质控品和空白 对照； 所述检测管家基因GAPDH的上游引物具有SEQ No. 19序列；所述检测管家基因GAPDH的下游引物具有SEQ No. 20序列；所述检测管家基因GAPDH的探针具有SEQ No. 21序列。6.按照权利要求5所述检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述 检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物、所述第一下游引物、所述第一探针、所述检测管 家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH 的探针被预先包被于C型PCR反应管内；所述检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物、所 述第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于A型第一PCR反应管内； 所述检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物、所述第二下游引物、所述第二探针、所述检 测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于A型第二PCR反应管内；所述检测VK0RC1基因野生型特异性上 游引物、所述第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检 测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于G型PCR反 应管内。7.按照权利要求6所述检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂盒，其特征在于：所 述C型PCR反应管内检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物、所述第一下游引物、所述 第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和 所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、 lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;所述A型第一 PCR反应管内检测CYP2C9基因野生型特异性上游 引物、所述第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检 测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、 50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;所述 A 型第二 PCR 反应管内检测 VKORCl基因突变型特异性上游引物、所述第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针 浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;以及所述 G型PCR反应管内检测VKORCl基因野生型特异性上游引物、所述第二下游引物、所述第二探 针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测 管家基因 GAPDH 的探针浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、 0? 05pm_5pm〇8. 按照权利要求7所述检测CYP2C9和VKORCl基因多态性的试剂盒，其特征在于：所 述C型PCR反应管内检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物、所述第一下游引物、所述第 一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述 检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;所述A型第 一 PCR反应管内检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物、所述第一下游引物、所述第一探 针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测 管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;所述A型第二PCR 反应管内检测VKORCl基因突变型特异性上游引物、所述第二下游引物、所述第二探针、所 述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家 基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;以及所述G型PCR反 应管内检测VKORCl基因野生型特异性上游引物、所述第二下游引物、所述第二探针、所述 检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基 因 GAPDH 的探针浓度分别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm。9. 一种权利要求1所述引物或权利要求3~8任一试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR 反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第 一步扩增的退火温度高于所述第二步扩增的退火温度。10. 按照权利要求9所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：37°C 2min， 95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，55°C~68°C退火32s，循环10~15次；第二 步，95°C变性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循环30~50次，收集荧光信号；或所述PCR反 应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，63°C退火32s， 循环15次；第二步，95°C变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收集荧光信号。
【专利摘要】本发明公开了一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，其中，检测CYP2C9基因，包括野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和共用第一下游引物；且野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，共用第一下游引物具有SEQ No.16序列；检测VKORC1基因，包括野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和共用第二下游引物；且野生型特异性上游引物具有SEQ No.38序列，突变型特异性上游引物具有SEQ No.35序列，共用第二下游引物具有SEQ No.37序列；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104962609
【申请号】CN201510290036
【发明人】高劲松, 张英杰, 魏欣芳, 李星颐, 刘晓莹, 魏潇, 魏奇
【申请人】沈阳优吉诺生物科技有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年5月29日