如下： (a) 设定PCR反应条件：首先设定PCR反应的退火温度完全一致，具体温度为55°C~ 68°C，PCR循环次数为40次，PCR反应的酶和缓冲体系均优化后固定不变，此反应条件的设 定是为了方便同时检测多种基因突变； (b) 特异性筛选：采用突变型的引物以野生型的重组质粒为模板，筛选出的引物其Ct 大于40 ; 其中循环阈值的确定原因如下，突变型引物在野生型模板发生非特异性扩增比野生型 引物在野生型模板发生特异性扩增多19个循环，按照临床实际检测时，所加样品量为0. 1 微克全基因组DNA的标准，我们通过下列公式，拷贝数=(DNA量ngX6.022X 1023V(长度 bpX 109X660)，其中全基因组DNA的长度为30亿对碱基，因此0. 1微克全基因组DNA的拷 贝数为：3. 09X 104,反映在荧光定量PCR的Ct(定量循环阈值)大概为21，这样我们得到第 二个筛选指标，即用突变型的引物，在野生型的重组质粒为模板时，所得的Ct应该大于40， 方能保证检测不会出现假阳性，两者的扩增效率相差为40-21=19个循环，即扩增效率相差 19个循环以上，将成为我们判断等位基因特异性引物特异性好坏的客观指标。我们知道当 引物3'端与模板错配时，延伸效率将下降103-1066倍，换算成反应循环数则下降约13至 27个循环，这就是我们能筛选出理想引物的理论依据，因为不进行引物筛选，19-13=6个循 环，势必产生假阳性，该引物的特异性就不好，而19-27=-8,不可能产生假阳性，有8个循环 数的范围供我们对引物进行筛选。按照这一要求，我们设计一系列等位基因特异性引物，从 长短上、从靠近3'端人为引入碱基错配上着手，加上其配对的下游引物，利用构建好的野生 型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反应的交叉筛选，即当用突变引物与野生型 的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模板的反应要多用19个循环数以上，反之亦 然，那么这样的引物就具备高度的特异性。
[0069] (c)敏感性筛选：将筛选出的特异性引物用与重组突变型质粒作敏感性试验，将检 测灵敏度小于10-1000个拷贝的特异性引物筛选出来，即为所需的突变特异性引物。
[0070] 通过以上几方面的筛选，所得到的等位基因特异性引物将具备高度特异性和高度 敏感的理想引物。
[0071](二）检测探针： 在一些情况下，检测探针的^值大约为60°C至70°C，最佳为65°C，探针长度根据其Tm 值决定。尽管有多种不同形式的探针可供选择，Taqman探针（AppliedBiosystems，Foster City)常常是首选。在一些特殊的情况下，如检测序列中AT含量过高，可以采用提高!"值 的Taqman-MGB等类型的探针。
[0072] 共用的特异性引物，在一些情况下，共用的特异性引物的1"值大约为50°C至 70 °C，最佳为60 °C，其长度由其Tm值决定，一般在15-25碱基之间。
[0073](三）其他成分： 本发明使用的DNA聚合酶是Taq酶，及其突变体、衍生物或片段，也可是其他的耐热DNA聚合酶，在一些情况下，也可采用Hotstart Taq酶，以增加反应的特异和高效性。
[0074] 本发明中所提供的针对CYP2C9和VK0RC1基因所提供的引物和试剂盒，主要是针 对等位基因特异性引物PCR扩增法的缺点，利用分子克隆技术，事先分别构建含待检基因 野生型和突变型的重组质粒，以此重组质粒为阳性模板，筛选确定特异地分别与3'末端突 变位点或野生位点碱基互补的两条特异引物，一旦筛选出的特异引物序列，将是我们检测 体系的关键元素。本发明的上述产品，可用于任何型号的荧光定量PCR仪，试剂成本同如今 市面上的荧光定量PCR试剂相当，因此较好地克服了其他采用等位基因特异性引物PCR扩 增法的不足。
[0075] 本发明的优点在于：所述的试剂盒具有操作简单，成本低，结果判断简单容易，灵 敏度高，本试剂盒检测基因突变灵敏度可以达到1%(即目的基因的突变基因DNA模板数占 野生型DNA模板数的1%);而直接测序中检测基因突变的灵敏度为20% (即目的基因的突变 基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%);Taqman探针技术保障了试剂盒的检测为闭管 反应，有效的避免了假阳性的产生，其检测特异性也充分得到保证，而且检测快速方便，整 个检测过程只有80分钟，而直接测序则需要2天的时间，而且是开管操作，PCR产物污染的 可能性大增。
[0076] 本发明中PCR(Past-PCR)的实施步骤： 1.阳性质粒的构建 在待检测的CYP2C9和VK0RC1基因多态性位点的上下游设计一对PCR引物，其扩增片 段的长度可在500bp的范围内，用gDNA为模板，采用常规PCR方法，扩增出这一片段，通过 AT克隆的方式，将该片段克隆至测序的质粒中，通常用Invitrogen的pCR2. 1 Topo T载 体试剂盒，操作按说明书进行，也可用其他厂家的T载体试剂盒，甚至可用自己制备的T载 体质粒。得到的阳性克隆，经测序验证，证明序列的正确性，然后采用Stratagene公司的 Quickchange试剂盒，设计对应位点的另一个基因型引物，通过Quickchange的方法，得到 该突变型别的阳性克隆，操作按说明书进行，所得到的阳性质粒都必须经测序验证为正确 方可进入下一步的使用。Taqman定量质粒，并用作模板以验证给定的测定法的灵敏性、线性 动态范围、特异性。
[0077] 2.等位基因特异性引物（ASP)的设计和筛选 在引物3'末端互补于对应的基因突变碱基位点，而在引物3'末端倒数第二位或第三 位引入碱基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3'端倒 数第二位或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反 应特异性的要求，越远离3'端，增加错配的碱基数越多，在5'端可达最多的等位基因1特 异性引物。
[0078]ASP的筛选是利用构建好的野生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反 应的交叉筛选，即当用突变引物与野生型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模 板的反应要多用19个循环数以上，反之亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。将筛 选出的特异性引物用与对应的重组质粒作敏感性试验，检测灵敏度小于10-1000个拷贝的 引物即达到检测的灵敏度要求，满足上述两个条件的引物就是我们选出的ASP引物，可进 行下一步的检测。
[0079] 3?扩增试剂准备及加入被检测样品 (1)从试剂盒中取出各组成成分，室温缓慢融化PCR缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、阳 性质控品、空白对照，颠倒摇匀。每个反应管需加入PCR缓冲液、Taq酶（dNTPs)、灭菌超纯 水和DNA样本。盖紧管盖，瞬时离心后转移到PCR扩增区。
[0080] (2)建议每次PCR反应均同时进行样本、阳性质控品、空白对照的分析，阳性质控 品和空白对照的加样方法同样本加入方法。
[0081] 4?反应条件 每个反应管中（反应终体积的范围可在10-50y1，最佳在20-25y1反应体积）包 含PCR缓冲液（10mMTris-HClpH8.3, 50mMKC1, 0.1%TritonX-100,2.0mMMgCl2)， 10-100ngDNA或1，000, 000个拷贝的质粒DNA，50nM-400nM-个共同的通用特异性Taqman 探针，和一个50nM-2uM共同的通用反向特异性下游引物，50nM-2uM不同等位基因特异性上 游引物，lpm-20pm检测管家基因GAPDH的上游引物，lpm-20pm检测管家基因GAPDH的下游 引物，0. 05pm-5pm检测管家基因GAPDH的探针，再加上1. 5单位Taq聚合酶，200yMdNTPs。 [0082] 1)、循环条件设置
为使荧光曲线更加美观，建议从第二步开始收集荧光信号。
[0083] 2)、仪器检测通道选择
荧光信号采集温度设为60°C，具体设置方法请参照相应仪器使用说明书。
[0084] 3)、检测类型设定：空白对照设为"NTC"，阳性质控品和待检样本设为 "Unknown"。
[0085] 5.结果分析 如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为C型（CYP2C9基因）或A型（VK0RC1基因），即突变型纯 合子； 如果检测样本仅有野生型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为A型（CYP2C9基因）或G型（VK0RC1基因），即野生型纯 合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为CA型（CYP2C9基因）或AG型（VK0RC1基因），即 杂合子；由于本方法结果是"全或无"，结果极易判断，哪一个管有反应，哪一个管就是阳性。 具体实施例
[0086] 下面以对CYP2C9基因rsl057910和VK0RC1基因rs9923231多态性位点检测的情 形为例，具体对本发明作进一步详细的说明。
[0087] 实施例1 :针对CYP2C9基因rsl057910多态性检测的野生型和突变型阳性质粒的 制备 首先我们从基因库中调出CYP2C9基因rsl057910多态性位点前后的基因序列，并将 多态性位点用双下划线标记，在CYP2C9基因rsl057910位点的上下游适当位置(用黑体字 和下划线标示)，设计一对克隆引物，扩增片段为269bp，突变位点包含其内，基因序列显示 如下，SEQNo. 1 : catgattcatatacccctgaattgctacaacaaatgtgccatttttctccttttccatcagtttttacttgtg tcttatcagctaaagtccaggaagagattgaacgtgtgattggcagaaaccggagcccctgcatgcaagacaggagc cacatgccctacacagatgctgtggtgcacgaggtccagagatacattgaccttctccccaccagcctgccccatgc agtgacctgtgacattaaattcagaaactatctcattcccaaggtaagtttgtttctcctacactgcaactccatgt tttcgaagtccccaaattcatagtatcatttttaaacctctaccatcaccgggtgagagaagtgcataactcatatg tatggcagtttaactggactttctcttgtttccagtttggggctataaag 实验步骤如下： 1)提取基因组DNA 用国内天根公司或Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒，提取基因组DNA，具体操作步 骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测定浓度，将其浓度调整到50ng/ U1，保存于_20°C，或直接进行下面的反应。
[0088] 2)AT克隆获得阳性质粒 首先在突变点上下游设计克隆引物，见表1 : 表1.CYP2C9基因rsl057910多态性位点野生型克隆引物
在 12.5yl的 2XPCRMasterMix(Fermentas)的PCR扩增体系，加入 10yM上游引 物和10yM下游引物，以及基因组DNA50ng，加水至总体积25y1，PCR反应条件设定为95°C 预变性3min，95°C变性10s，60°C退火及延伸30s，总共35个循环，反应结束后取15y1反 应产物，进行浓度2. 5%的凝胶电泳，电泳结束后观察，条带与预测的大小相符，表明扩增成 功。采用美国Life公司的pCR2.0T0P0T载体，按其操作说明，通过TA克隆的方式，获得 CYP2C9基因rsl057910位点野生型阳性质粒，具体的基因序列如下，其中多态性位点显示 为A型，说明为野生型，测序证明所获质粒正确。
[0089] SEQNo. 4 ：ggaagagattgaacgtgtgattggcagaaaccggagcccctgcatgcaagacaggagcca catgccctacacagatgctgtggtgcacgaggtccagagatacattgaccttctccccaccagcctgccccatgcag tgacctgtgacattaaattcagaaactatctcattcccaaggtaagtttgtttctcctacactgcaactccatgttt tcgaagtccccaaattcatagtatcatttttaaacctctaccatcaccgggtgag 3)快速突变法获得突变质粒 然后，采用产生快速突变的方法（Quickchange，QC)，设计突变引物，引物序列见表2. 表2.获得CYP2C9基因rsl057910多态性位点突变型引物
按照（Stratagene公司）Quickchange试剂盒的反应条件和步骤，完成突变体的构建， 所得到的重组质粒，具体的基因序列如下，经测序验证其中多态性位点显示为C型，为突变 型，然后将突变型与野生型质粒分别置-20°C保存备用。
[0090]SEQNo. 7：ggaagagattgaacgtgtgattggcagaaaccggagcccctgcatgcaagacaggagcca catgccctacacagatgctgtggtgcacgaggtccagagataccttgaccttctccccaccagcctgccccatgcag tgacctgtgacattaaattcagaaactatctcattcccaaggtaagtttgtttctcctacactgcaactccatgttt tcgaagtccccaaattcatagtatcatttttaaacctcta