专利名称：：抑制肉质食品中致病细菌生长的含有蛋黄免疫球蛋白的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种食品添加剂的制备方法及其应用，该食品添加剂含有IgY(蛋黄免疫球蛋白)，能够抑制肉质食品中致病细菌的生长。技术背景为了提高肉质加工食品(如火腿、香肠和烤肉)的质量，基于这些食品来自不同的肉质来源(如猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉)的事实，需要适用于广大领域的核心工艺。在改进肉质加工食品的整体性质上起到了重要作用的工艺包括各种各样的工艺，例如，基于使用新的香料的改善口感的工艺，基于使用具有较高持水能力的蛋白质基原料的降低成本的工艺，基于添加酶或蛋白质基原料的改善质地和风味的工艺，以及能够将由热导致的变质最小化的非热能灭菌工艺。在这些工艺中，通过将热处理最小化对肉质食品进行灭菌的非热能灭菌工艺对于显著提高肉质食品的质量是最至关重要的。目前正在开发的两类处理工艺包括利用天然的抗微生物的物质的化学处理工艺和使用电场、磁场、超高压或光能的物理处理工艺。关于当前的技术水平以及不稳定的生产成本，利于天然的抗微生物的物质的非热能灭菌工艺在食品工业中的应用更具有优势。包括细菌素(bacteriocine)提取物、药用壳聚糖(Chitosan)、药用溶菌酶、药用钙(calciummedicine)、各种有机酸、葡萄柚籽提取物、聚赖氨酸(polylysine)以及维生素B1衍生物在内的各种天然的抗微生物的物质己经被开发并可以商购得到。目前使用2%-3%的有机酸(例如乳酸钾和乳酸钙)来防止细菌从而确保肉质食品的安全。但是，大多数商购抗菌物质具有灭活机能，即表面活性剂能损伤在细菌细胞的疏水性和亲水性区域的细菌细胞膜，使微生物灭活，但是，问题在于，表面活性剂的抗菌效果在蛋白质基食品中(例如含有大量极性基团的肉质加工食品)受到了极大地妨碍。正是因为食物中的具有极性基团的蛋白质预先使抗菌物质的表面活性剂不能有效地到达并与细菌的细胞膜结合，因而不能实现有效地灭菌。由于在培养基上表现出优异的灭菌或抑制生长效果的商购抗菌物质在真正的食品(特别是蛋白质食品)中出现了效果减弱的重大缺陷，因此除了从有机酸中获得的天然抗菌物质外，能够被用在肉质加工食品中的抗菌物质受到了很大的限制。因此，最重要的是开发并安全使用能够应用于以蛋白质为主要成分的肉质加工食品的具有灭菌和抑制细菌生长功能的天然抗菌物质。这也将是非热能灭菌的基础，因为开发和安全使用有效的天然抗菌物质将是将变质和由二次热处理灭菌引起的产量下降最小化的差异化技术。关于前述方面，通过开发抑制肉质食品中致病细菌生长的含有IgY的组合物而完成了本发明，该组合物具有不同的抗菌机理并且能够用作肉质加工食品的有效的天然防腐剂，研究并分析本发明组合物应用于肉质加工食品时的抑制生长的效果。IgY是一种抗体，是一种特异性免疫球蛋白，它能从母鸡母体通过蛋黄传递给胚胎。天然抗菌物质和表面活性剂在制备方法和功能机理上是完全不同的。为了产生IgY，将待杀灭的或抑制生长的靶向致病细菌(例如螺旋杆菌(//e/z'co6a"er)，大肠埃希氏菌(￡.co//)，金黄色葡萄球菌d//z;/ococ薦m^ew)和沙门氏菌(5WmoMe〃a))注射到母鸡母体内以在蛋黄中产生一种能够抵御靶向细菌的特异性免疫球蛋白(抗体)。这种在蛋黄中积聚的特异性免疫球蛋白被称为IgY，有别于一般的抗菌素，它的特点是对人体没有副作用，并且对细菌也没有耐受性。迄今为止，IgY只是主要被用于功能蛋、奶制品、豆奶、功能餐和功能性化妆品产品。在先前的案例中没有如本发明所建议的将IgY用于肉质食品中。没有在先尝试以杀灭和抑制多种能够在肉质食品安全和质量方面起到负面作用的致病细菌为目而使用IgY，或者将IgY加工成粉末状或液态物质。目前在韩国以及国外存在的研究和开发的案例形成专利和研究文献的是专利登记号为0437500的韩国专利涉及一种食品添加剂，是通过将两种能够引起口腔疾病的链球菌变体(Streptococcusmutants)和伊氏放线菌(Actinomycesisraelii)作为抗原，将它们分别注射到不同的鸡体中，产生能够抗每个相关致病细菌的IgY。此外，该专利还涉及含有特殊食品添加剂的功能性冰激淋。专利登记号为0415911的韩国专利涉及如何生产能够预防肠炎的鸡蛋，通过将能引起肠炎和胃炎的大肠埃希氏菌和引起肠炎的幽门螺杆菌(7/e/^oZ^"w同时注射到幼鸡体内。此外，专利登记号为0406870的韩国专利提出了如何从蛋黄的水溶性成分中分离和纯化IgY。专利登记号为0392564的韩国专利介绍了如何生产功能性鸡蛋，该功能性鸡蛋具有特异性免疫球蛋白，该免疫球蛋白能抗导致痤疮的痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)。申请号为2001-0046634的韩国专利申请涉及功能性豆奶和含有含抗螺旋杆菌(//e//C06a"e。的IgY的液态蛋黄的酸奶。本领域的大多数研究文献和论文描述如何从蛋黄制备IgY抗体以及IgY的特性，对于灭菌和抑制生长的研究仅使用几种特殊的细菌，例如螺旋杆菌(/^//coZ^"w)、大肠埃希氏菌(￡.co//)和沙门氏菌(5Wwo"e〃a)。正如本文所讨论的，本发明的动机是基于这样的事实现在关于IgY的研究、发展和商业化高度集中在功能性原料和食品，而用于肉质加工食品的有效的天然抗菌物质还没有商业化应用。通过发明一种可商业化应用的对靶向细菌具有选择性抗生效果的天然抗菌物质，我们能够发展并完善先进的非热能灭菌技术，该技术使公司的高品质的产品以各种形式商品化，如在封装以及烹调后立即将产品装盘而无需任何额外的热处理的无菌包装产品
发明内容本发明的目的是提供抑制肉质食品中致病细菌生长的含有IgY的组合物。本发明的另一个目的是提供一种通过使用前述组合物杀灭肉质加工食品中的致病细菌和抑制肉质加工食品中的致病细菌的生长的方法。本发明包括下述几个步骤含有IgY的蛋黄的生产步骤；从蛋黄中分离IgY并纯化的步骤；含有IgY的液态蛋黄和蛋黄粉末的制备步骤；检验前一步骤获得的IgY的稳定性的步骤；检测和评价含有IgY的蛋黄粉末和液态蛋黄的抗菌效果的步骤。本发明提供了一种IgY的制备方法，该方法包括下述步骤O通过给鸡注射疫苗来生产含有特异性免疫球蛋白的鸡蛋，该疫苗能抗使产品变质的致病细菌和其它微生物；ii)对从鸡蛋中分离出的蛋黄进行低温灭菌；和iii)向已灭菌的蛋黄中加入酸性水溶液并将得到的混合物离心分离。在步骤ii)中，低温灭菌在50-75'C下进行15分钟至1小时。如果灭菌温度低于50°C，灭菌不能充分地进行。如果温度高于75r，蛋黄将会由于热而变性。如果灭菌时间少于15分钟，灭菌不能充分地进行，然而也没必要使灭菌时间长于1小时，因为灭菌时间长于1小时也不会带来更好的灭菌效果。在步骤iii)中，其特征在于，离心分离是在通过向已灭菌的蛋黄中加入酸性水溶液将最终酸度调节至pH值为5.2-5.5之后进行的。此外，本发明还提供了含有特异性免疫球蛋白的蛋黄，该蛋黄是通过下述两个步骤特别制备的步骤l，该步骤通过给鸡注射能抗使产品变质的致病细菌和其它微生物的疫苗来生产含有特异性免疫球蛋白的鸡蛋；和，步骤2，该步骤对从鸡蛋中分离出的蛋黄进行低温灭菌。经过灭菌的蛋黄在低温下能被冻干或冷冻干燥，以使它变成含有IgY的蛋黄粉末。此外，本发明还提供了对肉质食品具有杀菌或抑制腐烂功能的食品添加剂组合物，该组合物含有下述组中的一种或几种上述IgY，含有上述IgY的蛋黄，以及含有上述IgY的蛋黄粉末。图1说明本发明的IgY的制备过程；图2说明本发明的IgY的抗菌活性滴定度的曲线图；图3说明本发明的IgY的酸度和温度稳定性的曲线图；图4说明了在2(TC下GrillWinner香肠的每个储存阶段，含有IgY的蛋黄粉末的灭菌和抑制生长的效果的曲线图；图5举例说明沙门氏菌的细胞膜被本发明的IgY破坏的机理；图6为表明在20"C下GrillWinner香肠的每个储存阶段，含有本发明的IgY的蛋黄粉末的灭菌和抑制生长的效果的照片；其中，A是对照组，B是经IgY处理的实验组；图7为本发明的IgY对0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)的灭菌效果的曲线图；图8为本发明的IgY对肠炎沙门氏菌(Sa/wo"e〃aew&n力'fifo)的灭菌效果的曲线图；图9为本发明的IgY对鼠伤寒沙门氏菌"a/mowe〃a的灭菌效果的曲线图；图10为用电子显微镜观察到的本发明的IgY对O157:H7(大肠埃希氏菌(五^/7eWc/2^co//0157:H7))的细胞膜的破坏机理；图11为用电子显微镜观察到的经本发明的液态IgY处理的GrillWi皿er香肠；将经过IgY处理的香肠在37i:下放置7天后进行观察；其中，A是对照组，B是经IgY处理的实验组。具体实施方式根据本发明，术语"IgY"或蛋黄中的免疫球蛋白的意思是从母鸡母体通过蛋黄传递给胚胎的特异性免疫球蛋白(抗体)。本发明的技术术语IgY包括所有类型的IgY组合物，例如液态或粉末状物质。大约有20种致病细菌和其它微生物能使肉质加工食品变质。它们包括嗜水气单胞菌(v4m附o"os/^ra/M(3)、蜡状芽孢杆菌(万ac/肠cer潔)、空肠弯曲菌(G3wp//o6ac^7'咖m')、产气荚膜梭菌(C7o/nW謂/e^/h'"gms)、0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)、乳酸杆菌aacto6fl"7/w)、单核细胞增生李斯特氏菌(丄^er/(3wo"oc_y)、酉良酒酵母(Sacc/2"ramycescerev/w'ae)、肠炎沙门氏菌(5"a/,"e〃ae"&rk逾)、鼠伤寒沙门氏菌(5"a/mo"e〃a(y//z/柳Mr/M附)、金黄色葡萄球菌(5^a//^/ococci^awrews)、表皮葡萄球菌((SVa//2;v7ococcMSe//cferw/(i/s)、肉毒梭菌(C7astr/tZ/MmZo/w//ww/w)、弓瓜菌(F6厂z'ospp)禾口青霉菌(户em'cz'〃/wm)。在上述20种细菌中，本发明只选择了12种致病细菌作为最终的靶向细菌，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌以及耐热型产孢菌类Gpwe/om7W)。这些细菌具有可能导致进行了较高强度的热处理和较低强度的热处理的产品以及没有进行后续灭菌处理的无菌包装产品发生腐烂，产生气体，形成痰状物质，和形成食物毒素的危险。本发明所述的使产品变质的致病细菌和微生物包括0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7，革兰氏阴性菌)、肠炎沙门氏菌(5Wwo"e〃ae"&W^fo)、鼠1劳寒《少I、，氏菌(Sa/m。"e〃a/);//H'附wrz.w附)、空肠弯曲菌(Gawp_y/o6ac&ry'ey'ww/)、金黄色葡萄球菌(&ap/^/ococcwm/Mus，革兰氏阳性菌)、表皮葡萄球菌(Stop/^/ococcwe//fl^/mW^)、单核细胞增生李斯特氏菌(ZiWeWawowoc^ogms)、蜡状芽孢杆菌(5a"7/wc^ews，革兰氏阳性菌和耐热型产抱菌类G;or^/br附ers))、产气英膜梭菌(C7ofr/^'w附per^777ge"s)、以及酉良、酒酵母(Sacc/zara，cescerev&z'ae)，酉良酒酵母(iSacc/zaram_yc&scerev/w'ae)是能导致食品变质的典型的细菌之一。本发明还提供了关于IgY或含有IgY的蛋黄的信息，所述IgY或含有IgY的蛋黄对上述被认为是引起食品变质的致病细菌和其它微生物的靶向细菌具有优异的抗菌活性。根据本发明，将筛选后的靶向细菌注射到母鸡体内，首先从母鸡产的蛋的蛋黄中获得IgY(特异性抗体，能够阻止被注射的12种细菌)。产品中含有大量的蛋白质，其次是脂质、灰分和水。能抵御12种致病微生物的抗体IgY的总含量为15.5毫克/克(图1)。为了直接验证IgY对12种细菌的灭杀和抑制效果，用ELISA(酶联免疫吸附试验，一种间接的酶免疫响应的方法)来观察抗原抗体响应过程中光密度(OD，OpticalDensity)值的变化。光密度值的增加表明IgY对特异的病原体的选择性响应较高。因此，这可以被用作表明具有强的杀灭和抑制生长效果的间接的指标。实验结果表明，除了肠炎沙门氏菌(5""/附o"e〃ae"&n'"tfo)禾卩鼠伤寒沙门氏菌(/S<3/mowe〃a(y//z/mwn'wm)以外，本发明的IgY对12种病原体中的大多数显示出高的光密度值，这说明IgY能够抑制特异的病原体生长。IgY的灭活机理可以被理解为对抗体与细胞膜结合的响应。详细地说，IgY不是单克隆抗体而是多克隆抗体，在与细菌一起培养6个小时的期间内，它的数量增加，且显示出限制细菌生长的特异的杀菌功能。在一段时间内抑制细菌繁殖的作用是通过下述机理产生的IgY的Fab片段的两个位点与细菌的膜外蛋白质(菌毛)或脂多糖结合产生粘着作用并因此破坏细胞膜的功能。为了生产含有IgY的液态蛋黄，将含有IgY的鸡蛋捣碎分离出蛋黄，鸡蛋的抗菌效果通过ELISA被间接证明。然后，在50-75'C下以低速将蛋黄搅拌15-60分钟，同时杀菌。通过这种方法，使用低温灭菌得到无菌条件下的含有IgY的液态蛋黄。此外，如果使在低温下搅拌的含有IgY的蛋黄在l-l(TC的冷却室内冷却过夜，并在无菌条件下喷雾干燥，然后就能够获得含有IgY的蛋黄粉末。更进一步说，IgY水溶液也可以通过下述方法制备得到将分离出的蛋黄在低温下搅拌，然后用pH值为2-5的酸性水溶液将蛋黄稀释6-9倍，得到最终的酸度为pH值为5.2-5.5。然后，将蛋黄溶液在1-10。C的冷却条件下放置至少6小时(优选6-24小时)，并在3000-6000rpm下离心分离15-60分钟。用这种方法，IgY在上层清液中，颗粒状的蛋清蛋白被分离，得到IgY水溶液。此外，通过将IgY水溶液冻干(冷冻干燥)，也可以得到粉末状的IgY。由于便于储存和运输，在很多用途中粉末状物质比液态物质更有用。上述说明的分离IgY的方法是有效的，采用简单的只使用离心分离机(离心机)和冷冻干燥机作为必要设备的方法，获得的大于90%的抗体活性滴定度是安全的。将IgY应用于实际的肉质加工食品后，观察由该方法制备的IgY的杀菌和抑制生长的效果。每一种具有抗12种病原体效果的混合有IgY的粉末和液体被分别应用于作为食物样本的GrillWinner香肠(商标名称，韩国CJ株式会社)。在生产香肠的过程中，IgY的加入量为香肠重量的0.5重量％。观察香肠在10°C、15"C和35'C下放置8天直到56天的状况，分析总细菌数、感官测试和表明腐烂的气体的产生。分析结果显示出杀菌和抑制生长的效果，该效果包括没有由1(^个微生物的杀灭和抑制生长引起的细菌生成气体。在具有良好的抗菌效果的基础上，IgY不会影响加工得到的食物的味道，IgY的最大优势是有望克服现有商购天然抗菌物质的使用范围有限的问题。另一方面，本发明涉及杀灭和抑制使肉质食品变质的病原体和其它微生物生长的方法，该方法通过采用上述组合物对肉质食品进行处理。针对这一点，所述组合物应该在有效量的范围内使用。而对处理方法没有特别要求，可以在加工食物的过程中将组合物加入到肉质食品中。下面，将结合实施例对本发明进行详细描述。还应该清楚地理解的是，前面只是通过举例来描述，因此，本发明并不限于该具体的实施方式。实施例1:通过分离和纯化制备含有IgY的蛋黄及其组合物通过下述方法(图1)制得含有IgY的粉末状和液态的蛋黄。关于整个制备过程，挑选出12种在肉质食品的卫生和质量方面会造成问题的病原体，每种细菌疫苗被注射到随机抽样的母鸡体内，以获得对细菌具有特异性的IgY物质。将IgY分离和纯化以检测它的活性。通过低温灭菌和干燥方法制得含有IgY的液态蛋黄或蛋黄粉末，间接地证明其有效的抗菌功能。通过下述方法对本发明进行详细说明步骤l:含有IgY的鸡蛋的生产为了理想地完成本发明，将能够抗包括杆菌(&"7//^)、梭菌(C/o^7W"m)、沙门氏菌(Sa/附o"e〃a)和大肠埃希氏菌(Eco//)在内的12种靶向细菌的疫苗注射到单个的12周到21周大的白冠来亨鸡体内，分别获得含有能抗12种细菌的IgY的12种鸡蛋。注射的细菌疫苗是通过热处理或化学处理使细胞膜变性而被灭活的细菌，将该细菌与免疫刺激物质混合，并通过胸腔肌肉注入鸡的体内。为了产生最大量的抗体，至少注射两次疫苗。在本发明中，在初次注射疫苗后，记忆细胞B被激活，然后进行第二次注射使细胞以几何级数进行分裂而产生大量的特异性抗体。步骤2:IgY的分离和纯化在本发明中，将IgY从鸡蛋的蛋黄中分离，并通过ELISA(—种免疫酶响应的方法)间接检测它的抗菌功能，以确定该含有IgY的蛋黄是否适用。有效地分离IgY是非常重要的，它是来自蛋黄液态成分中的一种水溶性成分。因此，在本发明中，将蛋黄与9倍的酸性的盐溶液(pH值为5.0-5.5)混合，6小时后，低密度脂蛋白从混合物中沉淀出来，只有水溶性物质(IgY)能够通过离心而分离。将分离出的IgY冻干。通过ELISA(OD值为450nm)(抗菌效果的一个间接参数)用OD值分析得到抗特异的病原体的IgY的特征活性。高的OD值间接说明它具有高的抗病原体的抗菌效果。结果如图2所示。结果显示，IgY对病原体和其它使产品变质的细菌具有有效的抗菌效果。特别值得注意的是，对于7种病原体的抗菌效果特别优异，例如，0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)和肠炎沙门氏菌(&/mo"e//ae"^7'"(&，革兰氏阴性菌)、金黄色葡萄球菌(Sto;^;;/o"ccwa"^w，革兰氏阳性菌)、单核细胞增生李斯牛寺氏菌(丄/Wer/a附o"ocj^oge"s)、蜡状芽f包杆菌(5flc/〃wscerews'革兰氏阳性菌和耐热产孢菌类)、产气荚膜梭菌(C7o/nW/wmpe/yh'"gem)、禾卩酿酒酵母(Sacc/2aramycescereWWae)，它们是典型的使产品变质的微生物。根据实施例的结果，除了肠炎沙门氏菌和鼠疫沙门氏菌，IgY组合物显示出抗12种病原体中的大部分病原体的有效的OD值，这说明它对特异的病原体具有优异的抑制生长的性能(参见表l)。表1含有本发明的IgY的蛋黄的生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>步骤3:制备含有IgY的液态蛋黄和蛋黄粉末由于本发明的含有IgY的蛋黄的抗菌效果表现出了有效的值，下一步是制备含有IgY的液态蛋黄和蛋黄粉末。将含有IgY的鸡蛋捣碎分离蛋黄，通过上述ELISA法间接证明了IgY的抗菌效果。然后将蛋黄以低速搅拌，同时在62'C的低温下灭菌30分钟。下一步，将液态蛋黄在(C的冷却室中冷却过夜，然后在无菌条件下喷雾干燥制备得到蛋黄粉末。制备粉末过程的产率为83%，蛋黄粉末中的IgY的活性为90.7。/。，这说明了在该过程后相当高OD值的IgY被保留下来。按照实施例制得的组合物的实验结果如下。实验实施例l:IgY稳定性的测试为了将本发明的IgY作为商购天然抗菌物质而商业化，有必要确保IgY在各种条件下的稳定性。因此，在上述实施例中设定的pH值和温度条件下对稳定性的研究结果表明，在pH值为3或更低的情况下，由于变性而丧失功能，而且在pH值为9或更高的情况下，抗体功能下降。由于加工食品的酸度一般在pH值为4-7，测得在这个范围内IgY能够保持很好的活性。总的来说，为了在食物中使用鸡蛋衍生材料，在65"下实施5分钟巴斯德杀菌。在这种情况下，IgY显示出99n/。的抗菌活性。但是，当在75'C或更高温度下加热l小时，它的抗菌活性会减少60%以上。因此，能够总结出，这种物质适用于非热能灭菌产品(如图3)。实验实施例2:含有12种IgY的蛋黄粉末的抗菌活性测试在本实验实施例中，分析了将含有对12种病原体具有抗菌效果的IgY的蛋黄粉末应用于实际的肉质加工食品中的灭菌和抑制生长的效果。实验结果表明，当生产的GrillWinner香肠含有0.5重量％的含有IgY的蛋黄粉末时，在2(TC的储存温度下储存21天后，观察到的灭菌效果为10'(如图4所示)。这样的抗菌效果是由于特异性免疫球蛋白(IgY)与细菌的细胞膜结合而使细胞膜结构发生形变，从而使细菌的细胞膜的功能被削弱或者丧失(如图5所示)。因为IgY具有基于使细菌的功能退化的抗菌机制，它在抑制生长方面的作用更为有用，而不是通过杀菌灭活。对于制得的肉质食品(例如火腿或香肠)不能完全被灭菌，微生物安全性是为了抑制病原体的生长并且将细菌控制在10M02以下。由于IgY对特异的病原体具有选择性抑制生长的作用，可以注意到，IgY在微生物安全性方面是有效的。因此，当加入含有具有选择性抗菌功能的IgY的蛋黄粉末时，可以有效地杀灭和控制靶向细菌的生长，并且不会影响(产品的)味道。实验实施例3:含有2种IgY的液态蛋黄的抗菌效果的测试在本实验实施例中，通过应用于实际的肉质加工食品，分析含有对特别的两种病原体具有抗菌活性的IgY的蛋黄粉末的灭菌和抑制生长的作用。两个靶向病原体包括近来经常出现在肉质加工食品中的李斯特菌a^en'fl)和沙门氏菌(5Wmo"e^)。在本实验中，将在预先的测试中表现对这些病原体有作用的两种IgY混合，并进行测试。实验结果表明，当加工的GrillWinner香肠含有0.5重量％的含有IgY的液态蛋黄时，在15"的储存温度下储存14天后，没有发现细菌总数有明显的变化。但是，在没有添加IgY的对照组中，生成了粘液质，间接地说明香肠处于腐烂状态，并且由于产生气体，包装袋膨胀，然而，在实验组中没有观察到这种状态改变，这说明产品质量良好。实验实施例3再次证实了实验实施例2的关于IgY具有优异的抑制微生物生长的作用的结果。实验实施例4:本发明的IgY的抗菌效果测试将0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)、肠炎沙门氏菌(Sa/mo"e〃ae"fen'^fc)和鼠伤寒沙门氏菌(Sa/mowe〃a0^/2/wMn'ww)的每种疫苗注射，以获得对每种微生物具有抗菌效果(杀灭和抑制生长)的液态IgY。将液态IgY冻干以制成粉末状物质，然后采用基于免疫酶响应方法的ELISA证明对包括0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)、肠炎沙门氏菌(Sa/mo"e〃ae"teW^fc)和鼠伤寒沙门氏菌(5"a/mo"e〃a/^7/n'mwn'ww)在内的每种特异的病原体的抗菌效果。然后，分别制备含有106-107CFU/mlO157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)、肠炎沙门氏菌"a/wo"e〃a和鼠伤寒沙门氏菌(5^/mo"e//aO^/n'mMn'Mm)的三种盐溶液，然后分别向三种盐溶液中加入相应的抗0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)的IgY粉末2.34毫克/毫升、抗肠炎沙门氏菌(5^/mo"e//aewfen'^fo)的IgY粉末0.9毫克/毫升和抗鼠伤寒沙门氏菌(&/mo"e〃a^//z/附wWMm)的IgY粉末0.63毫克/毫升。通过检测细菌数量的减少来研究对三种类型的微生物的灭菌和抑制生长的作用随着时间的变化。除了靶向细菌的选择，IgY粉末的制备与实施例l相同。结果表明，抗0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)的IgY粉末的灭菌效果为102(CFU/ml)(99%的0157:H7被杀灭)。(如图7所示)。对于肠炎沙门氏菌"a/wo"e〃ae"&nW^y),灭菌效果表现为101(CFU/ml)(90%的肠炎沙门氏菌(Sa/wo"e〃ae"/en力'cfc)被杀灭)(如图8所示)。抗鼠伤寒沙门氏菌(Sa/wo"e〃a0^/2^mn'iw7)的IgY粉末的灭菌效果为101(CFU/ml)(90%的鼠伤寒沙门氏菌(5"a/mo"e〃aO^/2/wwn'wm)被杀灭)(如图9所示)。为了指出IgY对0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)的灭菌或抑制生长的作用机理，用电子显微镜观察用IgY处理过的0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)。如图10所示，IgY免疫金标记粒子被吸附在0157:H7(大肠埃希氏菌0157:H7)的细胞膜上。在大约4个小时后，该病原体的细胞膜被破坏以致该病原体死亡或抑制生长。将根据实施例1步骤2分离出的IgY水溶液冻干得到的IgY粉末加入到GrillWinner香肠中。制得的香肠含有0.05重量％的上述IgY粉末，并将其放置在35'C的培养器中。7天后，观察并分析由微生物(病原体和其它使产品变质的微生物)生长引起的香肠表面发生的变化。结果表明，没有经过IgY处理的对照组(A)，由于微生物的生长，结构被完全破坏，如图11所示。但是，在添加了本发明的IgY的实验组中，微生物被杀灭或被抑制生长，因此，产品的结构完好。这证实了本发明的IgY具有优异的抗菌效果。含有本发明的对12种病原体具有抗菌作用的IgY的组合物，被设计用来杀灭和抑制病原体细菌的生长，对导致食物中毒和肉质食品腐烂的细菌具有突出的抗菌效果。本发明的组合物还在低温、非热能处理条件下对病原体细菌显示出优异的杀灭和抑制生长的效果。因此，在食品灭菌工业中这是一个杰出的发明，因为它能将天然杀菌剂以各种方式商业化应用。权利要求1、一种特异性蛋黄免疫球蛋白的制备方法，该方法包括下述步骤i)通过给鸡注射疫苗来生产含有特异性免疫球蛋白的鸡蛋，该疫苗能抗使产品变质的致病细菌和其它微生物；ii)对从所述鸡蛋中分离出的蛋黄进行低温灭菌；和iii)向已灭菌的蛋黄中加入酸性水溶液并将得到的混合物离心分离。2、根据权利要求1所述的特异性蛋黄免疫球蛋白的制备方法，其中，步骤ii)中，所述低温灭菌在50-75X:下进行15分钟至l小时。3、根据权利要求1所述的特异性蛋黄免疫球蛋白的制备方法，其中，在实施步骤iii)的离心分离之前，通过向已灭菌的蛋黄中加入酸性水溶液将最终酸度调节至pH值为5.2-5.5。4、根据权利要求1所述的特异性蛋黄免疫球蛋白的制备方法，其中，所述使产品变质的致病细菌和其它微生物为嗜水气单胞菌(Arawoww/z_y<ira/7Ma)、蜡状芽孢杆菌(B腦.〃mcerews)、空肠弯曲菌(C謹p/2/0Z)ac&rm')、产气荚膜梭菌(C7o/r/<i/ww;eryHwgera)、大肠埃希氏菌0157:H7(￡^/7^&/7&0//0157:117)、乳酸杆菌(丄actoZ)ac/〃w)、单核细胞增生李斯特氏菌(丄/他r/awo"oqytogera)酉良酒酵母(Sacc/w!ra，cescerev/57'ae)、肠炎t少l、，ft"^^^1"/^^"^//"er"/(^/s)、鼠i^寒》少n氏菌(5^/附0"6//"^p/z/mwr/MW)、金黄色葡萄球菌(S鄉/^/ococcz^awmM1)禾口表皮葡萄球菌(S鄉/2y/0c0ccws5、一种特异性蛋黄免疫球蛋白，该特异性蛋黄免疫球蛋白是由权利要求1-4中任意一项所述的特异性蛋黄免疫球蛋白的制备方法制备得到的。6、含有特异性蛋黄免疫球蛋白的蛋黄，该蛋黄是由包括下述步骤的方法制备得到的i)通过给鸡注射疫苗来生产含有特异性免疫球蛋白的鸡蛋，该疫苗能抗使产品变质的致病细菌和其它微生物；和ii)对从所述鸡蛋中分离出的蛋黄进行低温灭菌。7、含有特异性蛋黄免疫球蛋白的蛋黄粉末，该蛋黄粉末是通过将权利要求6所述的蛋黄冷冻干燥而制备得到的。8、对肉质加工食品具有灭菌或抑制腐烂功能的食品添加剂组合物，该组合物含有选自由权利要求5所述的特异性蛋黄免疫球蛋白、权利要求6所述的含有特异性蛋黄免疫球蛋白的蛋黄以及权利要求7所述的含有特异性蛋黄免疫球蛋白的蛋黄粉末所组成的组中的一种或几种物质。全文摘要本发明涉及一种抑制肉质食品中的致病细菌生长的含有IgY的组合物，IgY是一种从蛋黄中得到的特异性免疫球蛋白。本发明的IgY靶向的使肉质加工产品变质的12种具有代表性的细菌和其它微生物包括嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、空肠弯曲菌(Camphlobacterjejuni)、产气荚膜梭菌(Clotridiumperfringens)、0157:H7(Escherichiacoli，大肠埃希氏菌0157:H7)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。12种细菌以抗原的形式被分别注射到鸡体内，以获得本发明的抗12种病原体的IgY。文档编号C07K16/00GK101400701SQ200780008575公开日2009年4月1日申请日期2007年3月12日优先权日2006年3月10日发明者孙京铉,宋珉锡,尹熙南,李惠珍,赵元一申请人:Cj第一制糖株式会社;Igy公司