专利名称：用于发酵制备l－半胱氨酸、l－胱氨酸、n－乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的微生物和方法
技术领域：
本发明涉及用于发酵制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的微生物和方法。
在当今技术水平下，许多氨基酸可以通过氨基酸的发酵方法制备。然而，在本发明以前还没有任何制备L-半胱氨酸的经济的发酵方法。
四氢噻唑衍生物及其对应的半酮缩硫醇一般在半胱氨酸与酮或醛缩合时产生。半胱氨酸与不同的酮或醛(特别是与α-酮酸)缩合的化学方法已是长期已知的。缩合通过中间体半酮缩硫醇发生，该中间体则由硫游离电子对亲核进攻醛类或酮类的缺电子碳原子而形成。然后，消去水的闭环反应则产生对应的四氢噻唑衍生物。
四氢噻唑衍生物形成的一般方式可以用下列图式表示
这里，R1和R2，可以表示任何有机基团。
因而起始化合物通过半酮缩硫醇与四氢噻唑衍生物达到平衡。由于这一原因，在水溶液中除四氢噻唑衍生物之外还有半酮缩硫醇存在。
在本发明的范围内，＂四氢噻唑衍生物＂也被理解为意指与半酮缩硫醇相关连的这些物质的平衡。
以前从未报导过四氢噻唑是细胞的直接代谢物。所有关于细胞形成四氢噻唑的报导都基于外部加入的过量的一种起始化合物，该化合物通常是L-半胱氨酸，该半胱氨酸经脱硫和脱氨基作用转化成丙酮酸，丙酮酸依次再与添加的半胱氨酸进行反应(Ronald C.Simpson等，生物化学生物物理学报，496(1977)，12-19)。而Kredich等曾在生物化学杂志.248，176187-6196中报导通过酶对L-半胱氨酸的脱硫作用，2-甲基-2，4-四氢噻唑二羧酸在体外形成，这些作者认为这一物质在体内形成是极不可能的。
用四氢噻唑作为外消旋前体物通过生物转化(EP-A 0101052，OkHee Ryu等，生物技术通讯，17(3)，275-28(1995年3月))制备L-半胱氨酸是很常见的。当用外消旋物制备L-半胱氨酸时，它得利用酶或者整个细胞立体选择转化成为L-半胱氨酸，而且余下的非异构体还要再一次经过外消旋化。由于这些原因，这一生物转化具有高的成本。
从外消旋半胱氨酸和对应的酮或者醛进行四氢噻唑的化学合成会形成四种不同的非异构体。从对映异构体纯化L-半胱氨酸而进行化学合成十分昂贵，并且其后分离L-半胱氨酸的目的也是荒谬的。由于以上原因，制备C4原子上为R构型的四氢噻唑非异构体，其起始化合物花费高的成本。
本发明涉及适合于发酵制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸和/或四氢噻唑衍生物的微生物。
按照本发明的微生物菌株的特征是它过量表达至少一种基因，该基因编码的蛋白质直接适合于向胞外分泌抗生素或其它对有机体有毒的物质。
在本发明内，对有机体有毒的物质被认为是优选的化合物，其对有机体的生长具有负作用。这种化合物的例子是羧酸或羧酸衍生物，它们在胞内以高浓度存在。
由此，编码直接适合于向胞外分泌抗生素和其它有毒物质或导致这种蛋白质形成的基因被称为外向通量基因(efflux gene)。
因而，本发明也涉及外向通量基因在增强表达发酵中胞内形成的氨基酸或氨基酸衍生物上的用途。
选自mar基因座(S.P.Cohen等，细菌学杂志，mar.1993，1755，1484-1492)，emr基因座，acr基因座，cmr基因座(参见P.F.Miller和M.C.Sulavik，分子微生物学(1996年)21(3)，441-448)，mex基因(T.Khler等，分子微生物学(1997年)23(2)，345-354)，bmr基因(A.A.Neyfakh等，美国科学院院报884781-4785(1991年))和qacA基因(J.M.Tennent等，J.Gen.Microbiol.1351-10(1989年))的至少一种基因作为外向通量基因在本发明的微生物中被优选地过量表达。
按照本发明，这些mar基因座基因作为外向通量基因在微生物中优选地过量表达。
编码包含序列MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ ID NO1)或与SEQ ID NO1具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白质的基因在本发明的微生物中被特别优选地过量表达。
优选的是与SEQ ID NO1具有高于75％的序列同源性的序列，并且特别优选的是与SEQ ID NO1具有高于90％的序列同源性的序列。
因而，本发明也涉及编码一种蛋白质的基因，该蛋白质包含序列MSRKDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ ID NO1)或与SEQ ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列。
此外，本发明涉及一种蛋白质，该蛋白质包含序列MSR KDGVLALLVVVVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ ID NO1)或与SEQ ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列。
优选的是与SEQ ID NO1具有高于75％的序列同源性的序列，并且特别优选的是与SEQ ID NO1具有高于90％的序列同源性的序列。
例如，本发明的蛋白质可以具有下列序列1 MKFRGGRMSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV51 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL101 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML151 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS201 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR251 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK310 AVKVGS*(SEQ.ID.NO2)由此，编码具有SEQ.ID.NO2中描述的氨基酸序列的蛋白质的开放读框被称为ORF 306。
下列序列代表本发明的蛋白质的另一例子。
1 MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV
44 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL94 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML144 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS194 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR244 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK294 AVKVGS*(SEQ.ID.NO3)具有在氨基酸水平上与SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于50％的序列同源性的氨基酸序列的那些蛋白质也是本发明的蛋白质。
优选的是与SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于75％的序列同源性的本发明的蛋白质，特别优选的是与SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于90％的序列同源性的蛋白质。
因此，编码以下蛋白质的那些基因也是本发明的基因，所说的蛋白质具有SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3所示的氨基酸序列或者具有在氨基酸水平上与SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于50％，优选地高于75％，特别优选地高于90％的序列同源性的氨基酸序列。
在本发明中提及的所有同源性值与利用＂威斯康星软件包版本9.0，遗传学计算机集团(GCG)，Madison，威斯康星＂的计算机程序获得的结果相关。用＂fasta＂子程序和默认值在数据库中查找来确定同源性(词汇大小2)。用“gap”子程序和＂缺口产生罚分12＂及＂缺口延伸罚分4＂默认值参数检测具有最大相似性的序列间的同源性。
为增加半胱氨酸产量的目的，另一种按照本发明的基因的超量表达的例子是一个5.5kb的DNA片段的超量表达，该片段编码mar基因座。这一质粒(命名为100-1-1，在大肠杆菌K12 W3110中)保藏在德意志微生物保藏中心，D-38124 Braunschweig，保藏号是DSM 11545。
图1显示了该质粒的图谱。该质粒可以用于PCR扩增按照本发明的基因。
技术人员熟悉用于在各种情况下所需的序列中的位置上获得进一步的特定修饰的已知方法(例如定点诱变技术)。因而，含有用这一方式修饰过基因的微生物也符合本发明，只要用这一方法修饰的基因有利于制备L-半胱氨酸，L-胱氨酸，N-乙酰丝氨酸和/或四氢噻唑衍生物。
在本发明含义内，过量表达被理解为意指在本发明的微生物中表达的蛋白质的量至少两倍于在蛋白质所来源的野生型微生物中表达的量。
蛋白质在本发明的微生物中的表达比在野生型微生物体中的表达优选地至少强5倍，特别优选地比在蛋白质所来源的野生型微生物体中的表达至少强10倍。
没有上述基因的过量表达，就不能观察到与起始菌株比较L-半胱氨酸或四氢噻唑衍生物产率的明显增加，例如，借助于使用分离的启动子的独立转录，或者例如不使用在质粒上以多拷贝存在的编码marA的基因时。
所说序列的过量表达引起的产率增加是令人惊奇的，因为文献报道开放读框ORF266的基因产物(其序列是从SEQ.ID.NO 2的41位甲硫氨酸开始，相应于SEQ.ID.NO4，)的过量表达不引起L-半胱氨酸产率上的增加。
在来源于ORF306并在以上描述的氨基酸序列中，ORF266的起始甲硫氨酸用粗体印刷并有下划线。
获得过量表达基因的一些方法是本领域技术人员熟知的，例如，其中一种可能性是在质粒中表达该基因，该质粒在细胞中以高拷贝数存在。这样的质粒是已知的，可以提及的例子有pACYC177，pACYC184，pACYC184的衍生物，pBR322，其它pBR的衍生物，pBluescript，pUC18，pUC19以及其他在大肠杆菌中常用的质粒。
按照本发明，优选的过量表达的质粒是pACYC177，pACYC184，pACYC184的衍生物，pBR322和其它pBR的衍生物。
特别优选的质粒是pACYC184及其衍生物，如pACYC184-LH(保藏在DSMZ德意志微生物保藏中心，D-38124 Braunschweig，保藏号DSM10172)。
因而，本发明也涉及含有本发明的所述基因的质粒。
其他增强表达的可能性在于增加外向通量基因的拷贝数(通过扩增在染色体中的基因片段)或运用强启动子来改进外向通量基因转录。
合适的强启动子的例子是GAPDK启动子，tac启动子(Ptac，lac启动子(Plac)，trp启动子(Ptrp)，λPL或λPR。
GAPDH启动子或tac启动子(Ptac)是优选的合适启动子。
GAPDH启动子是特别优选的合适启动子。
加强表达的另一种可能性是灭活阻抑蛋白基因，该基因对外向通量基因的表达有抑制效应。在mar基因座的情况下，例如这涉及灭活marR基因。
在翻译水平上对基因表达具有正效应的因子对外向通量基因的过量表达也有影响。这种因子的最好的例子是好的核糖体结合位点(例如Shine-Dalgarno序列)或下游框。
GAPDH基因的好的核糖体结合位点是在翻译水平上对基因表达具有正效应的优选因子。
为了表达，外向通量基因将被转化到能产生L-半胱氨酸的微生物中。
外向通量基因优选地转化到选自芽孢杆菌属(如B.subtilis)和棒杆菌属(如C.Glutamicum)，链霉菌属和大肠杆菌的微生物中。
外向通量基因最好转化到半胱氨酸代谢是去调节的微生物中，以实现L-半胱氨酸或随后可能的L-半胱氨酸或N-乙酰丝氨酸的四氢噻唑衍生物产量的增加。
产生增加量的L-半胱氨酸的微生物的例子是具有反馈抗性CysE等位基因的微生物。
在另一个优选的实施方案中，转化这样的微生物，其借助L-半胱氨酸和酮或者醛(特别是丙酮酸)的缩合胞内形成四氢噻唑衍生物。
例如，产生增加量的L-半胱氨酸的微生物在专利申请19539952中描述(19539952引入作参考)。
专业技术人员对转化微生物的方法(例如来自标准教科书的方法)是非常熟悉的。所有已知的方法都可以运用来产生本发明的微生物。
增强外向通量基因在能胞内产生氨基酸或者氨基酸衍生物(如L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸，或四氢噻唑衍生物)的微生物中的表达会令人惊奇地导致在胞内形成的氨基酸或者氨基酸衍生物(如L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸，或四氢噻唑衍生物)向胞外分泌量的增加。这导致在发酵期间可以获得实质上较高产率的这些产物。
因此，本发明也涉及制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的方法。该方法包括使用一种微生物，其在以已知的方式发酵时过量表达外向通量基因。
按照本发明的用于发酵制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的方法具有下列优点只形成在C4碳原子上具有R构型的四氢噻唑非对映异构体，这是由于细胞酶装备的结果，立体选择性地形成L-半胱氨酸，然后L-半胱氨酸可以用于与特定的醛或酮反应以产生上述四氢噻唑非对映异构体。
常规的化学和生物方法及技术可以用来从在C4碳原子上具有R构型的四氢噻唑获取L-半胱氨酸，只需简单地按起始化合物方向移动平衡。
此外，还令人惊奇地发现，从胞内产生的四氢噻唑衍生物发酵制备L-半胱氨酸是有利的。对此令人惊奇的事件做更详细的研究发现四氢噻唑对细胞的毒性比L-半胱氨酸实质上要低。
因而，本发明也涉及制备L-半胱氨酸的方法，该方法包括使由微生物胞内形成的L-半胱氨酸在微生物中胞内与存在于这一微生物胞内的醛或酮反应，产生四氢噻唑衍生物；采用直接适用于向胞外分泌抗生素或对该微生物有毒性的其他物质的蛋白质将这种四氢噻唑衍生物分泌到微生物外；并且在合适时，在分离出四氢噻唑衍生物后，通过向L-半胱氨酸的方向移动L-半胱氨酸和四氢噻唑衍生物之间的平衡获得L-半胱氨酸。
胞内形成四氢噻唑衍生物的一种选择是将在每种情况下存在于胞内的醛或酮与L-半胱氨酸反应。许多适合于缩合反应的醛和酮在有机体代谢途径中是已知的。在细菌代谢途径中，例如，这些醛和酮包括丙酮酸，草酰乙酸，α-酮戊二酸和乙醛酸。
L-半胱氨酸优选地与丙酮酸或者乙醛酸进行反应。
因此，按照本发明，对于按照本发明的方法中形成的四氢噻唑衍生物，在第1页所示图式中至少R1或R2中的一个基团优选地表示一个羧基基团，特别优选的是在式I中R1代表COOH和R2代表CH3。
用于产生四氢噻唑衍生物的缩合的起始化合物可以都由微生物产生，或者，仅其中一种起始化合物由微生物产生而第二种起始化合物在发酵期间加入。
在本发明的优选的实施方案中，两种用于产生四氢噻唑衍生物的缩合的起始化合物都由微生物产生。
羟胺或2，4-二硝基苯阱可以作为诱导剂以诱导形成丙酮酸，而后其可以从平衡中移走。
在按照本发明的方法中，四氢噻唑衍生物(和对应的半酮缩硫醇)可以有利地由简单和便宜的C，N和S源制备。
在按照本发明的方法中，通常用于发酵中的C源(如葡萄糖，乳糖，果糖，淀粉及其类似物)、N源(如铵或蛋白水解物及其类似物)以及S源(如硫化物，亚硫酸盐，硫酸盐，硫代硫酸盐或连二亚硫酸)可以用于发酵中。
由发酵获得的四氢噻唑衍生物可以用于获得半胱氨酸及其它目的。许多利用发酵制备的并且在C4碳原子具有R构型的四氢噻唑衍生物作为更广泛的合成起始点(构件)的应用可能性是已知的。
下列实施例用于进一步地阐明本发明。
仅仅可以间接定量测定四氢噻唑衍生物/半酮缩硫醇。在实施例中，这些化合物由运用Gaitonde，M.K.(1967)，Biochem.J.104，627-633的方法测定半胱氨酸来测定。在强酸条件下用茚三酮诱导半胱氨酸并从平衡中移走。这导致半酮缩硫醇随后发生反应，最终形成四氢噻唑衍生物。在100℃下处理10分钟，所有四氢噻唑衍生物以及有关的半酮缩硫醇均转变为半胱氨酸-茚三酮衍生物，其可以在560nm处定量测定。按此方法，游离半胱氨酸也包括在测定中。
游离SH基和游离半胱氨酸的量借助由Sang-Han，Lee等，生化和生物物理研究通信，Vol.213，第3号(1995)，837ff页描述的试验方法单独地测定，其中使用5，5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)。
当游离L-半胱氨酸形成时，它在发酵期间受大气中氧气的氧化作用形成L-胱氨酸，胱氨酸仅稍溶于pH7.0的水溶液中并以白色颗粒沉淀。当不溶的半胱氨酸颗粒形成时，它能溶解在半浓HCl中，并且在由使用二硫苏糖醇(DTT)获得的还原条件下在以上提到的试验中同样地测定。
在实施例3中，通过使用Gaitonde试验在上清液中测量的＂总半胱氨酸量＂作为发酵结果给出。在本文中，＂总半胱氨酸＂具体地说包括2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸，有关的半酮缩硫醇，游离L-半胱氨酸和溶解的胱氨酸。沉淀的胱氨酸单独定量测定和表示。
在检测2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸时，可以利用一种用二价金属离子沉淀在本发明实施方案中产生的这一衍生物。在以前报导过该衍生物可以用乙酸锌沉淀(Schubert等，见上述参考文献)。然而，其也可以用其他二价金属离子(如镁，铁，铜，锌，锰，钴等)沉淀。形成的四氢噻唑产物的沉淀和随后的鉴定在实施例4中描述。该实施例也表明经过24小时的发酵后，2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸是主要产物。该发酵产物易于沉淀在分析时是有帮助的，且在纯化时是有用的。
实施例1运用PCR扩增等位基因A扩增cysE等位基因在下面运用的cysE等位基因，即cysEIV和cysEX，是在DE19539952实施例2/10中描述的。
在上述文献中论及的突变可以通过定点诱变获得，实现这种诱变的试剂盒可以从商家购得，如从Stratagene(Stratagene GmbH，Po.Box105466，D-69044 Heidelberg)以商品名ExSite或Chameleon购得。
在定点诱变实现后，形成的等位基因可以从有关DNA通过聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等，科学，239487-491)扩增，选用下列引物cysE-fw(SEQ.ID.NO5)5’-TGG ACC AGA GCT CTG GGC GCA TCG CTT CGG CGT TG-3’SacIcysE-rev(SEQ.ID.NO6)5’-CTC GAT GCA TTA CGT AGG GGT ATC CGG GAG CGG TAT TG-3’NsiIPCR实验在存在200微摩尔的三磷酸脱氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1微摩尔的对应的寡核苷酸，100ng的包含特定cysE等位基因的模板DNA，1/10的10倍的反应缓冲液(100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，200mM tris-HCl(pH8.8)，20mM MgSO4，1％曲通X-100和1000微克/ml BSA)和2.5单位的热稳定重组Pfu DNA聚合酶(Stratagene)于热循环器(Gene-ATAQ-Controller，Pharmacia)中进行30个循环，并利用下列条件94℃1分钟，60℃1分钟和72℃3分钟。
扩增产物用SacI和NsiI(都来自Boehringer Mannheim GmbH)水解，水解条件按照制造商的规定；并在1％琼脂糖凝胶中分离，运用相应制造商说明的Geneclean方法(Geneclean试剂盒BIO101 PO.Box.2284LaJolla，加利福尼亚，92038-2284)可分离得到大约1.7kb大小的片段。在进一步使用前，将其保存在-20℃条件下。
B.mar基因座的扩增大肠杆菌mar基因座通过PCR得到扩增，分离扩增片段的方法与在实施例1A部分描述的相同。来自大肠杆菌W3110(ATCC 27325)的染色体DNA用作模板DNA；质粒100-1-1(DSM 11545)也可用作模板DNA。裂解细胞并纯化染色体DNA，依据在Ausubel等，1987，2.4.1-2.4.2，分子生物学中的当前草案，Greene出版协会和Wiley-Interscience中所描述的方案，用下列引物扩增mar基因座mar-fw(SEQ ID NO7)5‘-TTT GGC GCG CCG ATC AGC GGC GGC GCA ACC ATC AG-3’AscImar-rev(SEQ ID.No8)5’-GCC TTA ATT AAG ATC GAC ACT CAG GCT GTA CTG GCG AC-3’PacImar基因座扩增出高达3kb大小的片段，该片段用实施例1A段中描述的方法纯化。序列的限制性消化用酶AscI和PacI(两者均来自新英格兰Biolabs GmbH P.O.Box2750，D-65820 Schwalbach/Taunus)依据制造商的说明和缓冲液进行，片段经琼脂糖凝胶电泳纯化后存储于-20℃。
C.ORF306 DNA的扩增按在实施例1A段中所述，利用PCR扩增编码ORF306的DNA。以在实施例1A段中从大肠杆菌W311(ATCC 27325)分离的染色体DNA用作模板。质粒100-1-1(DSM 11545)也可用作模板DNA。运用下列引物ORF306-fw(SEQ.ID.NO9)
5‘-GGA ATT CAT TAA TCC GGC GAC TAA CGA ATC AAC TG-3’AsnIORF306-rev(SEQ.ID.NO10)5’-GCC TTA ATT AAC GCT ATG TAG TTT GTT CTG GCC CCG-3’PacI扩增的DNA片段约1.05kb大小，按前述用琼脂糖凝胶电泳纯化。后续的限制性消化用酶AscI(Boehringer Mannheim)和PacI(新英格兰Biolabs)进行，所需DNA片段在去除酶后获得。该片段用前储存在-20℃。
D.扩增编码GAPDH启动子的DNA片段3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子用于获得ORF306的有效转录。该片段也通过PCR获得。来自大肠杆菌W311(ATCC 27325)的染色体DNA用作模板。质粒100-1-1(DSM 11545)也可用作模板DNA。运用下列引物GAPDH-fw(SEQ.ID.NO11)5‘-GTC GAC GCG TGA GGC GAG TCA GTC GCG TAA TGC-3’MluIGAPDH-rev(SEQ.ID.NO12)5‘-GAG CTT AAT TAA GAT CTC ATA TGT TCC ACC AGC TAT TTG TTA G-3’PacI NdeI获得约0.3kb大小的DNA片段，按实施例1A部分所述的方法通过琼脂糖凝胶电泳纯化。后续限制性消化用酶MluI和PacI进行即可获得所需DNA片段。去除限制性消化酶后将DNA片段储存在-20℃。
实施例2构建本发明的质粒质粒pACYC184是用作构建本发明所需质粒的基本质粒。该质粒按在DE 19539952所述修饰并作为质粒pACYC184-LH保藏在德意志微生物保藏中心，保藏号是DSM10172。
图2显示了质粒pACYC184-LH的限制性酶切图和功能图。质粒pACYC184-LH携带多接头，这一多接头具有下列限制性酶切点NotI-NcoI-SacI-NsiI-MluI-PacI-NotI在实施例1中借助PCR获得的DNA片段和后续的限制性酶消化物均与此接头连接。
A.构建对照质粒pACYC184/cysEIV和pACYC184/cysEX按DE 19539952实施例3所述制备pACYC184/cysEIV与pACYC184/cysEX质粒，简略总结如下约1微克质粒pACYC184-LH(DSM 10172)按制造商(BoehringerMannheim)的说明用限制酶SacI与NsiI消化，如前所述消化过的DNA用琼脂糖凝胶电泳纯化以去除酶。将在实施例1A部分中获得的编码各cysE等位基因的DNA片段，按等摩尔比例与SacI和NsiI消化的质粒pACYC184-LH混合；向混合物中加入1微升T4 DNA连接酶和2微升10倍连接酶缓冲液配制总量为20微升的反应体系，不足用无菌双蒸水补足。将混合物温育过夜并用于转化大肠杆菌W3110(27325)。下面所述的转化方法可以用于在实施例中论及的所有转化。
运用电穿孔法转化大肠杆菌W3110，为此，在三角瓶中装入500毫升LB培养基(胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，以及NaCl5g)，并接种1％(V/V)的过夜培养物到相同培养基中。经定轨摇床37℃培育至600纳米光密度值为0.5-0.6。通过离心在4℃无菌容器中收获细胞株，所有后续方法要保证在冰上和无菌条件下操作。细胞沉淀用预冷无菌双蒸水冲洗两遍，最后将其悬浮于30毫升10％(V/V)的无菌甘油中。经进一步离心，细胞沉淀溶解于500微升10％(V/V)甘油中并以每200微升一等份储存于-80℃条件下。为进行转化，细胞需在冰上解冻，随后，加入约10-100ng的DNA，将混合物转入一无菌电击用吸收池(BioRad)内，把该小池放入基因脉冲发生器(BioRad)中进行电击，条件是电压2500伏，水平阻抗200欧姆以及25μF的电容。接着将细胞悬浮在1毫升SOC培养基中(酪蛋白蛋白胨20.0g/l，酵母提取物5.0g/l，NaCl0.58g/l，KCl0.19g/l，MgCl22.03g/l，MgSO42.46g/l，葡萄糖3.60g/l，pH＝7.0)，并且在37℃摇动1小时。之后，适当稀释细胞，涂布到LB平板(10g/l胰化蛋白胨，5g/l NaCl，15g/l琼脂，pH＝7.2)上，然后将平板在37℃温育过夜直到长出单菌落。
在质粒用QIAprep spin质粒试剂盒(Qiagen GmbH，MaxVolmerstrasse4，D-40724 Hilden)分离后，用限制酶切分析确定转化子。它们在实施例3的发酵中用作对照。
质粒pACYC184/cysEIV和pACYC184/cysEX在图3中描述。
B.质粒pACYC184/cysEIV-mar和pACYC184/cysEX-mar的构建在每种情况下，在实施例2A部分构建的1微克质粒pACYC184/cysEIV和pACYC184/cysEX连续地用限制性酶MluI(Boehringer)与PacI(新英格兰Biolabs)按照制造商的说明消化。经过此步消化后，用琼脂糖凝胶电泳如在实施例1A部分所述进行分离和纯化。将大约20ng MluI/PacI 消化载体pACYC184/cysEIV或pACYC184/cysEX与200ng在实施例1A部分制备的DNA片段，1微升T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)和2微升10倍连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim)及足量的无菌双蒸水混合，使最终体积为20微升。在4℃温育过夜，这两种DNA混合物用来转化大肠杆菌W3110(ATCC 27325)。用QIAprep旋转质粒试剂盒(Qiagen GmbH)分离质粒之后，进行限制酶切分析，所需转化子按在实施例3中所述分离并用于发酵。图4显示的是质粒pACYC184/cysEIV-mar和pACYC184/cysEX-mar的限制性酶切图和功能图。
C.质粒pACYC184/cysEIV-GAPDH和pACYC184/cysEX-GAPDH的构建在实施例2A部分构建的质粒pACYC184/cysEIV与pACYC184/cysEX均根据制造商的说明用限制酶MluI(BoehringerMannheim)和PacI(新英格兰Biolabs)消化。
用该种方法处理后的质粒纯化后，按实施例2B部分所述用实施例1D部分制备的DNA片段开始两个连接反应。
经4℃温育过夜后，将连接混合物转化到大肠杆菌W3110中。在质粒DNA分离后，用合适的限制酶分析可确定正确的转化子。
如在下面D部分中所述，质粒pACYC184/cysEIV-GAPDH和pACYC184/cysEX-GAPDH用作为构建质粒pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306与pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的起始材料。
D.质粒pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306和pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的构建在C部分制备的质粒按制造商的说明用NdeI(Boehringer Mannheim)和PacI(新英格兰Biolabs)消化。在质粒DNA纯化后，利用来自实施例IC部分的DNA片段开始两个连接反应，该片段用AsnI-PacI切过并编码ORF306。
在4℃温育过夜后，将混合物转化进大肠杆菌W3110中，并将转化菌平板接种到LB培养基上。一旦单菌落出现，立即分离它们的质粒并限制消化以进行正确性检验。
图5显示质粒pACYC184-cysEIV-GAPDH-ORF306和pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的限制性酶切图和功能图。
实施例3在发酵中比较本发明的构建体和已知构建体的产量在发酵中比较的所有质粒均在大肠杆菌W3110中发酵。由此保证观察到产率的增加是基因的新应用的结果。
用各种大肠杆菌构建体接种在锥形瓶(100ml)中的含15mg/l四环素的20ml LB培养基。在摇动温箱中经7小时的培养后(150rpm，30℃)，将各起始培养物转入100毫升SM1培养基(12g/l K2HPO4，3g/lKH2PO4，5g/l(NH4)2SO4，0.3g/lMgSO4X7H2O，0.015g/l CaCl2X2H2O，0.002g/l FeSO4X7H2O，1g/l柠檬酸三钠X2H2O，0.1g/l NaCl，1ml/l痕量元素(包括0.15g/l NaMoO4X2H2O，2.5g/l H3BO3，0.7g/l CoCl2X6H2O，0.25g/l CuSO4X5H2O，1.6g/l MnCl2X4H2O，0.3g/l ZnSO4X7H2O))中，该培养基补充有5g/l 葡萄糖，5mg/l 维生素B1和15mg/l 四环素。培养物在150rpm和30℃条件下于Erlenm eyer瓶(1升)中摇动培养17小时。经此培养，在600nm的光密度(OD)值在3和5之间。
发酵在BIOSTATM Braun-Melsungen发酵罐中进行，使用总体积为2L的培养容器。发酵培养基含有15g/l葡萄糖，10g/l 胰化蛋白胨(Difco)，5g/l酵母提取物(Difco)，5g/l(NH4)2SO4，1.5g/l KH2PO4，0.5g/lNaCl，0.3g/l MgSO4X7H2O，0.015g/l CaCl2X2H2O，0.075g/l FeSO4X7H2O，1g/l柠檬酸三钠X2H2O，和1ml/l痕量元素(参见上段)，0.005g/l维生素B1和l5mg/l四环素。在发酵罐中的pH最初通过泵入25％的NH4OH溶液调节到7.0，在发酵期间，pH通过25％NH4OH溶液自动地校正保持在7.0。对于接种，将100ml最初培养物泵入发酵容器中。起始容积约1L，培养物最初在200rpm下搅拌，并通过经灭菌过滤器灭菌的1.5vvm压缩空气通气。在发酵期间将大气氧饱和度调整到50％这是通过搅拌速率自动控制的。发酵在30℃的温度下进行，发酵2小时以后，以每小时3ml的速率加入无菌的30％的5倍硫代硫酸钠贮存液。在600纳米的OD值达到10后，以每小时约8-14ml的速率加入无菌的56％葡萄糖贮存液。利用YSI的葡萄糖分析仪酶促测定葡萄糖量。在发酵期间，葡萄糖浓度通过连续加入控制在10-20g/l。培养基中的半胱氨酸总量依据Gaitonde，M.K.(1967)，Biochem.J.104，627-623通过对样品中无细胞上清液的比色法测定。在本文中，应当注意在发酵期间剩余的半胱氨酸剩余物主要以四氢噻唑衍生物存在溶液中，但仍然被试验记录。如果酮或者醛(在这种情况下是丙酮酸)的量不够转化形成四氢噻唑衍生物的半胱氨酸，则游离L-半胱氨酸形成，这种半胱氨酸也被试验记录。当形成L-半胱氨酸时，其在发酵期间经导入的大气氧气缓慢氧化形成L-胱氨酸。胱氨酸仅微溶于pH7.0的培养基水溶液并以白色颗粒沉淀。当形成不溶的胱氨酸沉淀时，经从样品分离上清液并离心后，其可溶于半浓HCl中，在还原条件(DTT)下用上述试验法同样地测量。
在这些条件下，在表1和2中所显示的产量分别是在24小时和48小时发酵后获得的。这些表提供了清楚证据说明在本发明中使用的基因，即E.coli mar基因座，尤其是编码ORF306的片段，显著地增加半胱氨酸和/或四氢噻唑衍生物(总半胱氨酸)的产量。胱氨酸沉淀的形成在表中单独地记录。
表1利用cysEIV等位基因的半胱氨酸总产量
*胱氨酸的量，以克/升表示，其以颗粒存在。
表2利用cysEX等位基因的半胱氨酸总产量
*胱氨酸的量，以克/升表示，其以颗粒存在。
实施例4形成2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸的证明将构建体大肠杆菌W3110XpACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306按在实施例3中所述用于发酵，以证明2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸是如在实施例3中所述的发酵中的主要产物。
24小时后，通过离心将发酵上清液与细胞分离。按描述的半胱氨酸测量法测出上清液中半胱氨酸的总量为12.8g。然后，将MgSO4加入发酵上清液中，使其达到0.3M的终浓度。通过在搅拌下4℃温育过夜后，上清液中形成白色沉淀。该沉淀是2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸的微溶性镁盐。
经离心分离该沉淀后，测得上清液中剩余的半胱氨酸量仅为2.5g/l。
将沉淀溶解在半浓HCl中，并同样地用于半胱氨酸检测。在这种情况下，发现半胱氨酸浓度为9.5g/l。在溶于D2O+HCl中的沉淀经1HNMR和13C NMR分析后，可确定它不同于参考物质(M.P.Schubert，生物化学杂志.121539-548(1937))，而是2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸。
实施例5L-半胱氨酸和2-甲基四氢噻唑-2，4(R)-二羧酸的不同的毒性对于该实验，2-甲基四氢噻唑-2，4(R)-二羧酸是运用Schubert方法(M.P.Schubert，J.Biol.Chem.121，539-548(1937))从L-半胱氨酸和丙酮酸合成的。将在LB培养基中过夜温育的大肠杆菌W3110接种到20mlSM1培养基中(见实施例3)，后者补充了10g/l葡萄糖，10％LB培养基，5mg/l维生素B1，15mg/l四环素和适当量的L-半胱氨酸或2-甲基四氢噻唑-2，4(R)-二羧酸。经37℃下培养7小时，在含1mM或1mM以上浓度L-半胱氨酸的培养基中未发现进一步的生长。而在含高达50mM 2-甲基四氢噻唑-2，4(R)-二羧酸的培养基中可以观察到生长。不可能培养更长的时间，因为半胱氨酸易于氧化。故L-半胱氨酸对大肠杆菌的毒性比2-甲基四氢噻唑-2，4(R)-二羧酸更显著。因此，2-甲基四氢噻唑-2，4(R)-二羧酸更适合于用发酵法获得L-半胱氨酸，即便在这种情况下，为释放L-半胱氨酸，仍需要一个化学步骤。
实施例6增强N-乙酰-L-丝氨酸的形成N-乙酰-L-丝氨酸是由O-乙酰-L-丝氨酸自发重排形成的，该O-乙酰-L-丝氨酸在细菌生物合成途径中是L-半胱氨酸的直接前体物。因此，当向O-乙酰-L-丝氨酸中掺入的硫不够或缺乏时，其发酵的终产物是N-乙酰-L-丝氨酸。当没有硫供给时，按照本发明的基因仍会增加该发酵产物的产率。
进行实施例3中所述的发酵，但不加入硫代硫酸盐。为了说明它们所包含的基因特别是ORF306的功效而使用构建体pACYC184/cysEX和pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306。
如表3显示的结果，本发明的基因，特别是ORF306，可显著增加发酵中N-乙酰-L-丝氨酸的产量。
表3发酵24小时后N-乙酰-L-丝氨酸产量
当用更强的反馈抗性CysE等位基因(例如来自DE 19539952的cysEXIV，cysEXI和cysEXXII)与本发明的基因结合时，可以获得超过30克/升N-乙酰-L-丝氨酸的产量。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称电化学工业有限公司(国际)(B)街道Zielstattstr.20(C)城市慕尼黑(D)联邦州巴伐利亚(E)国家德国(F)邮区代码81379(G)电话089-74844-0(H)传真089-74844-350(ii)发明名称用于发酵制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的微生物和方法(iii)序列数12(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度43个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假设否(iv)反义否(v)片段类型内部片段(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO1
Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp1 5 10 l5Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Arg20 25 30Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val35 40(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度306个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假设否(iv)反义否(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Phe Arg Gly Gly Arg Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala1 5 10 15Leu Leu Val Val Val Val Trp Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val20 25 30Gly Leu His Asn Met Pro Arg Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met35 40 45Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile Phe Phe Val ALa Arg Pro Lys Val Pro50 55 60Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe65 70 75 80Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala85 90 95Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala100 105 110Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala115 120 125Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly130 135 140Gln His Val Ala Met Leu Gly Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe145 150 155 160Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser165 170 175Thr Arg Pro Ala Val Met Ser Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro180 185 190Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr195 200 205Met Ile His Ser Leu Val Thr Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu210 215 220Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ile Trp Gly225 230 235 240Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu245 250 255Leu Val Pro Val Val Gly Leu Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu260 265 270Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly275 280 285Leu Thr Ile Asn Val Phe Gly Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val290 295 300Gly Ser305(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度299个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假设否(iv)反义否(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp1 5 10 15Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Arg20 25 30Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile35 40 45Phe Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr50 55 60Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile65 70 75 80Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln85 90 95Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu100 105 110His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu115 120 125Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Leu Gly130 135 140Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Cly Asn Tle145 150 155 160Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser165 170 175Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala150 185 190Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr195 200 205Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala210 215 220Thr Ile Val Gly Thr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu225 230 235 240Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu245 250 255Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe260 265 270Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly275 280 285Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser290 295(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度266个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(iii)假设否(iv)反义否(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile Phe1 5 10 15Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr Gly20 25 30Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile Asn35 40 45Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln Ala50 55 60Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu His65 70 75 80Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu Val85 90 95Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Ieu Gly Phe100 105 110Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile Phe115 120 125Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser Leu130 135 140Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Aal Ser145 150 155 160Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr Ile165 170 175Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Thr Leu Ala Phe Val Ala Thr180 185 190Ile Val Gly Thr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Gly Thr195 200 205Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu Ala210 215 220Ser ALa Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe Leu225 230 235 240Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly Leu245 250 255Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser260 265(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种核酸(A)描述/desc＝＂合成＂(iii)假设否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO5TGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT CGGCGTTG 38(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种核酸(A)描述/desc＝＂合成＂(iii)假设否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO6CTCGATGCAT TACGTAGGGG TATCCGGGAG CGGTATTG 38(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种核酸(a)描述/desc＝＂合成＂(iii)假设否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO7TTTGGCGCGC CGATCAGCGG CGGCGCAACC ATCAG 35(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种各样的核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假设否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO8GCCTTAATTA AGATCGACAC TCAGGCTGTA CTGGCGAC38(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假设否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO9GGAATTCATT AATCCGGCGA CTAACGAATC AACTG35(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假设否
(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO10GCCTTAATTA ACGCTATGTA GTTTGTTCTG GCCCCG36(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假设否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO11GTCGACGCGT GAGGCGAGTC AGTCGCGTAA TGC 33(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型各种核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假设否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO12GACCTTAATT AAGATCTCAT ATGTTCCACC AGCTATTTGT TAG 4权利要求
1.一种适合于制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸和/或四氢噻唑衍生物的微生物菌株，该菌株过量表达至少一种编码直接适用于向胞外分泌抗生素或对该微生物有毒性的其他物质的蛋白质的基因。
2.如权利要求1所要求的微生物菌株；其中选自mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex基因、bmr基因及qacA基因的至少一种基因作为编码直接适用于向胞外分泌抗生素或对该微生物有毒性的其他物质的蛋白质的基因被过量表达。
3.如权利要求1所要求的微生物菌株；其中编码包含序列MSRKDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ.ID.NO1)或者与SEQ.ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白质的基因作为编码直接适用于向胞外分泌抗生素或对该微生物有毒性的其他物质的蛋白质的基因被过量表达。
4.一种基因，该基因编码包含序列MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVIKVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ.ID.NO1)或者与SEQ.ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白质。
5.一种基因，该基因编码包含以下序列SEQ.ID.NO2或者与SEQ.ID.NO2具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白质1 MKFRGGRMSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV51 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL101 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML151 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS201 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR251 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK301 AVKVGS*(SEQ.ID.NO2)
6.一种蛋白质，该蛋白质包含序列MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVIKVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ.ID.NO1)或者与SEQ.ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列。
7.一种质粒，该质粒含有至少一种如权利要求4或5所要求的基因。
8.一种制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或其四氢噻唑衍生物的方法，该方法包括在发酵中以已知的方式使用如权利要求1、2和3中所要求的微生物菌株。
9.外向通量基因在增强表达发酵中胞内形成的氨基酸或氨基酸衍生物中的用途。
10.一种制备L-半胱氨酸的方法，该方法包括使由微生物胞内形成的L-半胱氨酸在微生物胞内与存在于这一微生物胞内的醛或酮反应，以产生四氢噻唑衍生物；采用直接适用于向胞外分泌抗生素或对该微生物有毒性的其他物质的蛋白质将这种四氢噻唑衍生物分泌到微生物外；并且在合适时，在分离出四氢噻唑衍生物后，通过向L-半胱氨酸的方向移动L-半胱氨酸和四氢噻唑衍生物之间的反应平衡获得L-半胱氨酸。
全文摘要
本发明涉及用于发酵制备L－半胱氨酸、L－胱氨酸、N－乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的微生物和方法。按照本发明的微生物菌株适合于制备L－半胱氨酸、L－胱氨酸、N－乙酰丝氨酸和/或四氢噻唑衍生物,其过量表达至少一种编码直接适用于向胞外分泌抗生素或对该微生物有毒性的其他物质的蛋白质的基因。
文档编号C07K14/245GK1203274SQ9810261
公开日1998年12月30日 申请日期1998年6月18日 优先权日1997年6月19日
发明者克里斯托弗·温特豪特, 威尔弗雷德·莱因费尔德 申请人:电化学工业有限公司(国际)