n)收集上清以及沉淀。经检测表达蛋白主要位于沉淀中，沉淀用 50mlSTET重悬，同时加入lmmol/LDTT。置50ml小烧杯内，冰上超声1次，离心弃上清，重复 超声和离心，直至上清透明。PBS重悬包涵体，37°C，220r，震荡lh至包涵体全部溶解。取溶 解液进行SDS-PAGE电泳。
[0140] 电泳结果如图5所示，结果表明，在IPTG诱导下重组菌Rosetta/ pET-sumo-Hby-ECS1成功表达了Hby-ECS1蛋白（诱导3h)，Hby-ECS1基因即实现了高 效异源表达，并且表达Hby-ECS1蛋白的表观分子量与理论分子量相近，约为66kDa。
[0141] (3)、蛋白复性
[0142] 将纯化好的蛋白加入到50ml的离心管内（加入20%PEG4000至终浓度为0. 2% 和50mMGSSG至终浓度ImM及100mMGSSH至终浓度2mMh)，离心管放置4°C，静置12h。取 出静置后的蛋白，透析于TE缓冲液3天。透析期间TE缓冲液更换2次。透析好的蛋白进 行SDS-PAGE电泳，经测定蛋白浓度为0. 3mg/ml，置-20°C保存。
[0143] 3、Hby-ECS1 活性验证
[0144] y-ECS活性测定按照南京建成y-谷氨酰半胱氨酸合成酶测试盒说明书进行， 具体原理如下：谷氨酸和半胱氨酸在y-ECS的催化作用下，消耗ATP，反应生成y-谷氨 酰半胱氨酸、无机磷和ADP，在636nm光吸收下，通过显色反应测定体系中无机磷的量判断Y-ECS的活力高低，实验重复三次。
[0145] 根据规定，每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1ymol无机磷为 一个酶活力单位，标准品浓度单位ymol/ml，样本蛋白浓度单位mg/ml，计算公式为：
[0146]
[0147] 综合以上各实施例的实验结果可见，实施例1获得的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合 成酶Hby-ECS1编码基因具有y-ECS酶功能，这对于研究橡胶树抗逆性以及延长排胶时间 有重要意义。
[0148] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其特征在于：所述编码基因为 SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其特征在于： 所述SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列中自5'端第224-1795位的碱基序列为编码基因的开 放阅读框。3. 根据权利要求1所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因的制备方法，其 特征在于包括如下步骤： a. EST片段克隆：以热研8-79品种的巴西橡胶树胶乳RNAoligo-d (T) 18反转录得到的 cDNA为模板，进行PCR扩增，得到EST片段，所述ETS片段为SEQ ID No: 2所示的核苷酸序 列，其中PCR扩增使用的引物对为： 上游引物：5'-TTCCAAGAGGGTGGGTAA-3' ； 下游引物：5'-AAAGCAAGACCAGCGTGA-3' ； b. 5'端RACE :利用步骤a得到的EST片段设计5'端巢式引物，然后进行5'端RACE的 PCR扩增，得到序列-5-RACE，所述序列-5-RACE为SEQ ID No: 3所示的核苷酸序列，所述5 ' 端巢式引物的序列如下： 5' RACE-GSP:5'-CTCAGAACTGAAATCCAGATTAAC-3' ； 5' RACE-NSP:5'-TCTGCTTTCCCTGTTTGAGTCCTAT-3' ； c. 3'端RACE :利用步骤a得到的EST片段设计3'端巢式引物，然后进行3'端RACE的 PCR扩增，得到序列-3-RACE，所述序列-3-RACE为SEQ ID No: 4所示的核苷酸序列，所述3 ' 端巢式引物的序列如下： 3' RACE-GSP:5'-AAACAGGGAAAGCAGAGCA-3' ； 3' RACE-NSP:5'-ACATGCACTGTCCAGGTTAA-3' ； d. cDNA全长克隆：将步骤a、b、c得到的三条序列进行拼接，即得SEQ ID No: 1所示的 核苷酸序列。4. 根据权利要求3所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因的制备方法，其 特征在于： 所述a步骤中每25y 1的PCR反应体系为：10Xbuffer2. 5y 1，浓度为2. 5mmol/L 的dNTP Mixture 2. 5 y 1，浓度为5U/ y 1的Taq酶0? 2 y 1，浓度为lOmmol/L的上游引物 0. 3 y 1，浓度为lOmmol/L的下游引物0. 3 y 1，模板I y 1，H2O补足至25 y 1 ; 扩增程序为：94°(：预变性5111111;94°(：变性3〇8,60°(：退火3〇8,72°(：延伸1111111，35个循 环；72°C延伸 IOmin ; 所述b步骤具体为：以美国Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的说明书步骤，以巴西橡胶树热研8-79胶乳RNA为模板，合成5' RACE 第一链cDNA，以UPM和5' RACE-GSP为引物，5' RACE第一链cDNA为模板进行PCR，以此PCR 产物100倍稀释液为模板，以NUP和5' RACE-NSP为引物，进行第二轮巢氏PCR扩增，扩增程 序同第一轮； 所述c步骤具体为：以美国Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的说明书步骤，以巴西橡胶树热研8-79胶乳RNA为模板，合成3' RACE 第一链cDNA，以UPM和3' RACE-GSP为引物，3' RACE第一链cDNA为模板进行PCR，以此PCR 产物100倍稀释液为模板，以NUP和3' RACE-NSP为引物，进行第二轮巢氏PCR扩增，扩增程 序同第一轮。5. 根据权利要求1所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其在制备表达 橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因的表达载体中的应用。6. 根据权利要求2所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其特征在于： 所述表达载体为含有SEQ ID No: I-ORF序列的重组质粒或含有SEQ ID No: I-ORF序列的转 基因大肠杆菌；所述SEQ ID No: 1-0RF序列为编码基因开放阅读框的碱基序列。7. 根据权利要求6所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其特征在于： 所述重组质粒为pET-sumo-SEQ ID No:l_0RF ;其中pET-sumo为载体质粒。8. 根据权利要求7所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其特征在于所 述pET-sumo-SEQ ID No: 1-0RF重组质粒通过如下步骤制得： A. pMD18-SEQ ID No:l重组质粒的制备：将SEQ ID No:l所示的核苷酸序列与pMD18-T 载体质粒连接，得到PMD18-SEQ ID No: 1重组质粒； B. PCR扩增：以步骤A得到的pMD18-SEQ ID No: 1重组质粒为模板，进行PCR扩增，然 后将扩增后的PCR产物与pET-sumo载体质粒连接，即得pET-sumo-SEQ ID No: 1-0RF重组 质粒； PCR扩增所用的引物对为： 上游引物 ORF-F :5' -GACTATGGCGCTTGTTTCTCAGGCAGGC-3' ； 下游引物 ORF-R :5' -GGCCTTTAGTACAGTAGITCCTCAAAAAC-3' ； 每2〇111的？0?反应体系为：1〇1^2\3￥81?6代61111&^61]^1、上游引物和下游 引物0? 2 y L、IOOng模板、H2O补足至20 y L ; PCR反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸I. 5min，35个 循环；72°C延伸IOmin。9. 根据权利要求6所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其特征在于所 述含SEQ ID No: 1-0RF序列的转基因大肠杆菌通过如下步骤制得：将含有SEQ ID No:l-〇RF 序列的重组质粒导入大场杆菌中，即得。10. 根据权利要求1所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其在提升橡 胶树橡胶产量方法中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种橡胶树γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，所述编码基因为SEQ？ID？No:1所示的核苷酸序列。本发明还提供该橡胶树γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因的制备方法以及应用。本发明的橡胶树γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，具有能够提升橡胶树橡胶产量、应用广泛等优点。
【IPC分类】C12N15/70, C12N1/21, C12N15/66, C12N15/54, A01H5/00, C12N15/10
【公开号】CN105112432
【申请号】CN201510539825
【发明人】魏芳, 王聪, 郑乾坤, 校现周, 罗世巧, 仇键, 杨文凤, 高宏华, 吴明
【申请人】中国热带农业科学院橡胶研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月28日